Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы .10
1.1. Стрептококкоз животных 10
1.2. Характеристика возбудителей стрептококкоза .13
1.3. Клинические симптомы и патологоанатомические изменения при стреп-тококкозе 17
1.4. Эпизоотический процесс при стрептококкозе .21
1.5. Диагностика стрептококкоза .23
1.6. Иммунитет и специфическая профилактика стрептококкоза 24
2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Материалы 39
2.2. Методы исследований 40
3. Результаты собственных исследований .45
3.1. Эпизоотическая обстановка по бактериальным инфекционным болезням крупного рогатого скота в Краснодарском крае 45
3.1.1. Нозологический профиль и место стрептококкоза в инфекционной па-тологии крупного рогатого скота .46
3.1.2. Изучение превалентности и инцидентности стрептококкоза крупного рогатого скота 50
3.1.3. Изучение территориальных и временных границ распространения стрептококкоза крупного рогатого скота 51
3.1.4. Изучение возрастной восприимчивости крупного рогатого скота к стрептококкозу 54
3.2. Диагностика, клинические признаки, патологоанатомические и гистоло-гические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота .56
3.2. 1. Изучение клинического проявления стрептококкоза у крупного рогато-го скота 58
3.2.2. Изучение патологоанатомических и гистологических изменений при стрептококкозе крупного рогатого скота 66
3.2.3.Выделение и идентификация стрептококковых культур, циркулирую-щих в организме крупного рогатого скота .72
3.3. Разработка технологии производства и контроля инактивированной вак-цины против стрептококкоза крупного рогатого скота .76
3.3.1. Разработка технологии получения и оценка качества биосырья для из-готовления инактивированной вакцины против стрептококкоза крупного ро-гатого скота 76
3.3.2. Изучение параметров инактивации возбудителя стрептококкоза .78
3.3.3. Изучение иммунологических свойств вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в экспериментальных и производственных услови-ях .83
3.3.3.1. Изучение иммунологических свойств инактивированной вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в экспериментальных усло-виях .83
3.3.3.2. Разработка параметров контроля вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота .87
3.3.3.3. Изучение эффективности инактивированной вакцины против стреп-тококкоза крупного рогатого скота в производственных условиях 89
3.4. Разработка ветеринарных мероприятий по профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота 93
3.5. Экономическая эффективность применения вакцины против стрептокок-коза крупного рогатого скота в производственных условиях 97
3.6. Обсуждение результатов исследований 102
4. Выводы .112
5. Предложения производству 114
6. Список использованной литературы
- Характеристика возбудителей стрептококкоза
- Эпизоотический процесс при стрептококкозе
- Нозологический профиль и место стрептококкоза в инфекционной па-тологии крупного рогатого скота
- Изучение патологоанатомических и гистологических изменений при стрептококкозе крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность темы. Животноводство является важной отраслью народного хозяйства. Однако успешное развитие животноводства сдерживает возникновение и распространение в хозяйствах инфекционных болезней. У крупного рогатого скота среди бактериальных и вирусных инфекций чаще регистрируют: инфекционный ринотрахеит, рото- короновирусные инфекции, парагрипп-3, эшерихиоз, сальмонеллез, стрептококкоз, псевдомоноз, стафилококкоз и другие. Эти болезни наносят выраженный экономический ущерб, который складывается из падежа, снижения продуктивности животных и денежных затрат на проведение лечебных и профилактических мероприятий (Бурова Л.А., 2000; Есепенок В.А., 2006; Шевченко А.А. с соавт., 2009; Черных О.Ю., 2010).
В последнее время в животноводстве получили распространение факторные инфекционные болезни, в этиологии которых основная роль принадлежит условно-патогенным микроорганизмам, в том числе и стрептококкам.
Стрептококкоз – инфекционная болезнь животных разных видов, в основном молодняка, вызываемая патогенными стрептококками. При остром течении болезнь характеризуется септицемией, у новорожденных – омфалитом, при подостром и хроническом течении - поражением органов пищеварения, респираторной системы, глаз, суставов и т.д. У взрослых коров отмечаются аборты, метриты и маститы. Летальность молодняка может достигать 70%. Возбудитель патогенен и для человека. Стрептококки наносят хозяйствам колоссальный ущерб. При анализе данных, полученных из литературных источников, видна вся важность стрептококков и в развитии маститов (Брагина Э.П., 1972), и энтерококковой инфекции у телят (Панин А.Н., 1992), и при развитии эндометритов у коров (Турченко А.Н., 1999, 2001).
Надежной защитой поголовья от инфекционных болезней является вакцинопрофилактика. Применение вакцин в хозяйствах способствует уменьшению стрессовых ситуаций у прививаемых животных, снижает трудозатраты и способствует созданию напряженного иммунитета в сжатые сроки (Вачугов В.И., 1989). Многие исследователи полагают, что инактивированные вакцины, произведённые из штаммов микроорганизмов, выделенных в эпизоотическом очаге, обладают высокой специфичностью, иммуногенностью и способствуют созданию напряженного иммунитета (Маннапова Р.Т., 1998; Шевченко Л.В., 2008; Шевченко А.А. с соавт., 2009; Черных О.Ю., 2010).
Изучение инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, разработка эффективных средств для защиты животных, совершенствование мероприятий по профилактике и ликвидации данных болезней имеет важное значение для ветеринарии.
Цель и задачи исследований. Цель исследований – изучить особенности эпизоотического процесса в животноводческих хозяйствах на территории Краснодарского края. Изучить клинические симптомы и патологоанатомические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота, разработать систему эффективных мероприятий для профилактики и ликвидации данного заболевания.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Провести изучение нозологического профиля бактериальных инфекций крупного рогатого скота за 2004-2013 гг. на территории Краснодарского края, и определить удельный вес стрептококкоза в нем;
провести эпизоотологический мониторинг по стрептококкозу крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах на территории Краснодарского края за последние 10-ть лет;
провести изучение территориальных границ, возрастных особенностей, сезонности стрептококкоза крупного рогатого скота;
изучить клинические симптомы и патоморфологические изменения у животных при стрептококкозе крупного рогатого скота;
выявить источники и главные причины распространения стрептококкоза крупного рогатого скота на территории хозяйств Краснодарского края;
разработать инактивированную противострептококковую вакцину для использования в комплексе противоэпизоотических мероприятий для крупного рогатого скота;
провести изучение иммунобиологических свойств созданной противострептококковой вакцины для крупного рогатого скота;
разработать комплекс профилактических и ликвидационных мероприятий при стрептококкозе крупного рогатого скота для животноводческих предприятий Краснодарского края.
Научная новизна. Впервые было проведено изучение эпизоотической ситуации по инфекционным болезням бактериальной этиологии у крупного рогатого скота на территории Краснодарского края. В нозологическом профиле установлено место, удельный вес, территориальные границы, возрастные особенности, сезонность, заболеваемость, характер проявления эпизоотического процесса, превалентность, инцидентность, клинические симптомы, патологоанатомические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота.
Разработана и применена технология по производству новой инактивированной противострептококковой вакцины для крупного рогатого скота, изучены её свойства, в том числе и иммуногенность.
Были апробированы и внедрены в ветеринарную практику рекомендации, включающие мероприятия по профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота в условиях животноводческих предприятий Краснодарского края. Научная новизна проведённой работы подтверждена двумя патентами на изобретение (№ 2406532, № 2406533).
Теоретическая и практическая значимость. На основании выдвинутых теорий, а так же данных, полученных в ходе проведённой работы, в том числе и в производственных условиях, были разработаны и предложены для использования в ветеринарии:
- система противоэпизоотических мероприятий, в которую включён эпизоотологический, бактериологический, серологический мониторинг, диагностика, проведение мероприятий по предупреждению, и при возникновении - по ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота на животноводческих предприятиях Краснодарского края;
- «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота» (2014);
- создана новая противострептококковая вакцина для крупного рогатого скота, которая предложена для применения в крае;
- разработан и утвержден в установленном порядке проект нормативно-технической документации на производство и применение новой вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота. Вакцина производится на ФГУП «Армавирская биофабрика»;
- подготовлены учебные пособия «Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов» (2013), «Профилактика и мероприятия по ликвидации стрептококкоза животных» (2013).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Нозологический профиль по инфекционным болезням крупного рогатого скота на территории Краснодарского края за 2004-2013 гг., удельный вес стрептококкоза в нем имел тенденцию к увеличению;
2. Особенности эпизоотического процесса при стрептококкозе: факторы возникновения, распространения, превалентность, инцидентность, сезонность, заболеваемость у крупного рогатого скота на территории Краснодарского края;
3. Клинические симптомы и патологоанатомические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота в Краснодарском крае имеют свои особенности;
4. Применение новой инактивированной противострептококковой вакцины способствует улучшению эпизоотической обстановки в хозяйствах, неблагополучных по стрептококкозу крупного рогатого скота.
Реализация результатов исследований. Результаты исследований: комплекс противоэпизоотических мероприятий, включающий систему диагностики, профилактики, ликвидации стрептококкоза у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах на территории Краснодарского края.
Рекомендации по проведению диагностических и профилактических мероприятий, в случае возникновения стрептококкоза у крупного рогатого скота в Краснодарском крае, используются государственным управлением ветеринарии Краснодарского края при планировании и проведении противоэпизоотических мероприятий.
Новая эффективная безвредная вакцина предложена для применения в крае.
Использование в ветеринарной практике на территории Краснодарского края системы профилактических мероприятий может способствовать сохранению поголовья крупного рогатого скота и оздоровлению его от стрептококкоза.
Результаты проведённой работы, в том числе и подготовленные учебные пособия: «Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов», «Профилактика и мероприятия по ликвидации стрептококкоза животных», применяются в учебном процессе на кафедре микробиологии, эпизоотологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины Кубанского госагроуниверситета, в государственных ветеринарных учреждениях и животноводческих предприятиях края.
Апробация работы. Отчёт о полученных в ходе проведённой работы данных был представлен на всероссийских и международных научно-практических конференциях (г. Горки, республика Беларусь, 2010 г.; г. Владимир, 2013г.; г. Покров, 2014 г.; г. Краснодар, 2009-2014 гг.); на заседаниях ученого совета Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2008-2014 гг.); на студенческих научных конференциях факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2010-2014 гг.).
Публикации. По теме диссертации было опубликовано 10 научных работ. Из них 3 напечатаны в журналах, которые рекомендованы ВАК РФ. Кроме статей опубликованы два учебных пособия и рекомендации.
Структура и объем работы. Изложение диссертационной работы представлено на 141 странице компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, состоящий из 135 источников, 30 из которых принадлежат зарубежным авторам, и приложения. В работу включены иллюстрации, в том числе 35 рисунков, 10 таблиц.
Характеристика возбудителей стрептококкоза
Str. pyogenеs, Str. dysagalactiae, Str. equisimilis имеют гиалуронидазу, способствующую разрушению соединительной ткани и инвазии возбудителя. Фибринолизин обнаруживают у Str. pyogenеs, Str. dysagalactiae, Str. equisimilis, а также у стрептококков группы G. Нейраминидазу синтези-руют Str. dysagalactiae и пневмококки. Дезоксирибонуклеазу (разрушитель клеток в стрептококковом гное) синтезируют Str. pyogenes, Str. dysagalactiae, Str. equisimilis, а также стрептококки группы G. У Str. pyogenes и стрептокок-ков группы G имеются эритрогенные токсины с пирогенным действием, от-ветственные за летальный шок. Исходя из данных А.А. Конопаткина и соавт. (1993), в откормочных комплексах крупного рогатого скота Белгородской, Тульской, Московской областей, стрептококки, относящиеся к патогенным видам, выделялись в смеси с другими энтеробактериями при проведении смывов из носовой по-лости у клинически здоровых телят в среднем в хозяйствах - 38,8%; из носо-вых смывов больных телят - 62,9%, легких - 59,3%, лимфоузлов - 49,2%, се-лезенки - 30,7%, суставной жидкости - 17,2%, печени - 8,1%, почек - 19,5%, крови - 32,5%. В чистом виде стрептококки у телят выделяли из легких- 17,8%, из крови - 13,1%, из суставной жидкости - 11,8%, из селезенки - 5,6%, из почек - 9,7% случаях. От павших животных и вынужденно убитых удава-лось выделить культуру через 1- 5, 10- 20, 60- 80 и 90- 120 дней после посту-пления в откормочные комплексы из проб легких в 50,0 - 60,0%, 60,0- 66,2%, 65,2 - 72,9% и 66,2 - 70,8% случаев. Выделяли стрептококки штаммов Str. agalactiae в 38,7%, Str. dysagalactiae и Str. zooepidemicus в 53,2%, Str. faecalies в 80,0% случаев.
Обнаруживаются стрептококки у клинически здоровых животных на ко-же, слизистых оболочках пищеварительного тракта, дыхательных путей, поло-вых органов. По причине несоблюдения зоотехнических нормативов по содер-жанию и кормлению коров в период беременности и после родов, бактерионо-сительство стрептококков переходит в клинически выраженные заболевания – развиваются маститы и эндометриты, что неминуемо приводит к понижению молочной продуктивности и увеличению сервис-периода (Ивченко В.М., 1991; Турченко А.Н., 1999; Шевченко А.А. и соавт., 2009). Профилактика бак-териальных маститов у коров способствует сохранению молочной продуктивно-сти и высокой экономической эффективности предприятий (Oliver S.P с соавт., 1992).
На предприятиях Северного Кавказа у нутрий выделялись следующие культуры: стрептококки - Streptococcus pneumoniae, Streptococcus zooepidemicus группы С, эшерихии - Escherichia coli серогруппы 01 и 055, сальмонеллы - Salmonella typhimurium, энтерококковой инфекции - Enterococcus faecalis (Шевченко Л.В., Шевченко А.А., Черных О.Ю., 2008; Шевченко Л.В., 2008; Черных О.Ю., 2010).
Исходя из вышесказанного можно сделать вывод, что из-за существования большого видового и серогруппового разнообразия культур, слабости или невы-раженности иммунной защиты, восприимчивости многих видов животных, эпизоотическая ситуация плохо поддаётся контролю. Следовательно, по-прежнему является актуальной проблема изучения отдельных серологиче-ских групп и видов стрептококков, разработки методик для их идентифика-ции, и средств для профилактики и борьбы с ними.
Патогенные виды микроорганизмов рода Streptococcus повсеместно распространены в природе и вызывают стрептококкоз у животных. Развитие заболевания может происходить и эндогенно (аутоинфекция), в случае пони-жения естественной резистентности, и экзогенно – при попадании стрепто-кокков из вне на чувствительные органы и ткани. По данным исследователей (Конопаткин А.А. с соавт., 1992), течение болезни может быть сверхострым, острым, подострым и хроническим. У заболевших отмечается вялость, по-вышение температуры тела, снижение или отсутствие аппетита, гиперемия слизистых, выделение катарального экссудата из носовой полости, появление кашля. Развиваютя симптомы поражения органов желудочно-кишечного тракта, дыхание учащается. Наиболее выраженной была лихорадка у телят при заражении их стрептококками группы D и С. Гибель животных происхо-дила от септицемии на 4- 6 день после заражения, и сопровождалась выра-женными признаками одышки и сердечно-сосудистой недостаточности.
У животных с острой формой стрептококкоза регистрируют высокую температуру тела, поверхностное дыхание, катарально-гнойные истечения из носовой полости, обильное слезотечение, полное отсутствие аппетита. У не-давно родившихся телят отмечают воспаление пупочного канатика. При этом из него выделяется гнойный, зловонный экссудат. При нарастающей слабо-сти животные погибают с выраженной картиной септицемии спустя один - два дня. При вскрытии находят гнойно-фибринозный полиартирит, а так же множественные абсцессы в почках, головном мозге, лимфатических узлах, печени.
Подострое течение клинически проявляется огромным количеством самых разнообразных симптомов из-за включения в инфекционный процесс секун-дарной микрофлоры, поэтому возникает смешанная инфекция, при которой поражаются респираторные органы, суставы, центральная нервная система, желудочно-кишечный тракт (Жаков М.С.,1992). В брюшной полости при па-тологоанатомическом вскрытии выявляют геморрагический экссудат, печень увеличена, селезёнка увеличена и отёчна, находят кровоизлияния на слизи-стой оболочке сычуга, отмечается отёк всех органов. Находят спайки сердеч-ной сумки и плевры. В легких – гнойники, уплотнения. В суставной сумке находят скопления фибринозной массы, отмечается изъязвление хрящевой ткани.
Эпизоотический процесс при стрептококкозе
Иммунитет при стрептококкозе подразделяют на постинфекционный и поствакцинальный. При всех видах иммунитета в организме образуются ан-титела против возбудителя или продуктов его метаболизма, а также возни-кают и дифференцируются иммунокомпетентные клетки, включая Т- и В-лимфоциты (Шевченко Л.В., 2008; Черных О.Ю., 2010).
По мнению У.Д. Герберта (1984), большое значение для защиты орга-низма от стрептококков имеют опсонины. Гладкая поверхность капсулы у стрептококков препятствует фагоцитам поглощать их. Только тогда, когда благодаря действию антител, поверхность этих бактерий меняется, приобре-тает шероховатость, фагоциты могут активно захватывать их и уничтожать. Некапсулированные диплококки (шероховатая форма) могут фагоцитиро-ваться без участия специфических антител. Стимуляция фагоцитов антите-лами выражается не только в изменении поверхности бактерий, но и в ад-сорбции цитофильных антител на фагоцитах, что способствует хемотаксису и последующему поглощению возбудителя фагоцитом. Вирулентные гемо-литические стрептококки могут фагоцитироваться в крови полиморфноядер-ными лейкоцитами. Однако в фагоцитах они уничтожаются неполностью и снова высвобождаются из них. Такая резистентность стрептококков обуслов-лена М-белками, которые у каждого типа стрептококков имеют разную структуру. Я.Е. Коляков (1986) тоже считает, что своеобразие противострептокок-ковой иммунной защиты связано с тем, что клеточная стенка стрептококков обладает активной токсической субстанцией (М-протеин) и нетоксическим компонентом (гиалуроновая кислота стрептококка группы А), активно по-давляющими защитные механизмы организма.
Противоинфекционную защиту организма обеспечивают неспецифиче-ские факторы (анатомо-физиологические), а так же органы и ткани иммунной системы, осуществляющие иммунологическую функцию. Однако неспеци-фические механизмы и факторы играют большую роль в способности орга-низма животных сопротивляться действию патогенных микроорганизмов. К ним относятся: бактерицидность секретов, слизистые и кожные барьеры, комплемент, лизоцим, и др. (Герберт У.Д., 1984; Есепенок В.А., 1993). По их мнению, в течение латентного периода, неспецифические субстанции орга-низма и являются теми факторами, которые предотвращают прогрессирова-ние инфекционного процесса. Следовательно, очень важно изучать противо-стрептококковый иммунитет и, на основании полученных результатов, раз-рабатывать защитные препараты против данной инфекционной болезни жи-вотных.
Для проведения специфической профилактики стрептококкоза крупно-го рогатого скота на территории нашей страны вакцина не выпускается. Ра-нее были разработаны и предложены исследователями инактивированные вакцины: формолвакцина против стрептококкоза телят, ягнят, поросят (Че-пуров К.П., 1943); поливалентная вакцина против диплококковой инфекции, сальмонеллеза и пастереллёза свиней (Малявин А.Г.,1956). Формолвакцина против стрептококкоза телят, ягнят, поросят содержит инактивированную культуру стрептококков серологической группы D. Вакцина применяется для профилактической иммунизации против энтерококковой инфекции соответ-ствующих видов животных в хозяйствах, где регистрируется возбудитель Enerococcus faecalis. А.Н. Панин в 2002 году запатентовал разработанную им вакцину, содержащую стрептококки серогрупп В, Д и С.
С помощью данных вакцин нельзя защитить животных от стрептокок-коза крупного рогатого скота, так как в них другие виды микроорганизмов.
В.А. Есепёнок (1998) разработал несколько инактивированных вакцин и предложил их для ветеринарной практики: против стрептококкоза и пасте-реллеза нутрий, против стрептококкоза нутрий, против стрептококкоза круп-ного рогатого скота. Особый интерес представляет вакцина против стрепто-коккоза крупного рогатого скота, которая содержит антиген - штамм Str. zooepidemicus, чаще выделяемый и вызывающий заболевание у птиц. Разра-ботанная вакцина испытывалась в производственных условиях в России. По мнению автора, применение данного биопрепарата позволяет оздоровить хо-зяйства, в которых регистрируется возбудитель стрептококкоза штамм Str. zooepidemicus.
В нашей стране исследователями разработаны и применяются различ-ные инактивированные вакцины, в том числе ассоциированные вакцины про-тив пастереллеза и вирусной геморрагической болезни кроликов, против ви-русной геморрагической болезни кроликов, против стрептококкоза, колибак-териоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий (Шевченко А.А., 1993; 1994; 1995; Шевченко Л.В., 2008; Черных О.Ю., 2010).
На территории нашей страны, для проведения специфической профи-лактики инфекционных болезней у различных видов животных, и птиц на-шли применение живые и инактивированные вакцины. В большей мере при-меняются инактивированные вакцины, так как они содержат убитых возбу-дителей инфекционных болезней, поэтому безопасны для животных.
Вакцина – биологический препарат, содержащий ослабленные или уби-тые патогенные микроорганизмы или продукты их жизнедеятельности, ис-пользуемые для создания иммунитета к инфекционным болезням.
Все вакцины по применению делятся на противобактериальные, проти-вогрибковые, противовирусные; по способности микроорганизмов к размно-жению – живые, инактивированные, в том числе анатоксины; по сырьевым компонентам – корпускулярные (у вирусов цельновирионные), субъединич-ные, вакцины из анатоксинов.
В практике ветеринарной медицины широко применяются корпуску-лярные инактивированные вакцины, которые зарекомендовали себя с поло-жительной стороны. Технология изготовления корпускулярных инактивиро-ванных вакцин включает различные этапы: получение производственных штаммов; подбор питательной среды для культивирования микроорганизмов; получение матровой расплодки; выращивание микроорганизмов; получение биосырья; инактивирование бакмассы; концентрирование биоматериала; стандартизация баксырья; адсорбирование антигена на адъюванте; фасовка вакцины и контроль вакцины (Тутов И.К., Ситьков В.И., 1997; Алимов А.М., 1999; Шевченко Л.В., 2008; Шевченко А.А. и соавт., 2009; Черных О.Ю., 2010).
Для выбора производственных штаммов при изготовлении вакцин не-обходимо включать наиболее часто выделяемые серотипы микроорганизмов. Поэтому вакцина, которая могла бы быть эффективна против всех сероваров возбудителя, должна была бы содержать большинство из них. Главным требованием к производственным штаммам является высокая антигенность и иммуногенность. Антигенность штаммов оценивается путем определения титра антител в кровяной сыворотке у восприимчивых живот-ных через конкретный период после заражения их исследуемой кльтурой возбудителя. Антигеннось штаммов оценивают в серологических реакциях, постановку которых ведут в сравнении с референс-штаммами и иммунными специфическими сыворотками к ним.
Нозологический профиль и место стрептококкоза в инфекционной па-тологии крупного рогатого скота
В ходе проведения лабораторной диагностики были получены результа-ты бактериологического исследования. Данный тип исследований совмешал многие манипуляции: выделение возбудителя от больных животных в исход-ном материале согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагно-стике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. ГУВ СССР, «Методическим указаниям по бактериологической диагностике смешанных кишечных инфекций» (Москва, 2000) с использованием биохимических тест-систем фирмы «Pliva-Lachema Diagnostika»: ENTEROtest 24, NEFERMtest 24, EN-COCCUStest, STREPTOtest 16. Определение уровня антител в сыворотке крови проводили в РП согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике стрептококкоза животных (М., 1990), утвержденным Главным управлением ветеринарии (ГУВ). Для исследования использовали патологический материал от больных и павших животных, свежие трупы телят, паренхиматозные органы: сердце, перевязанное лигатурой у аорты, долю печени с желчным пузырем, почку, селезёнку, трубчатую кость, брыжеечные лимфоузлы, при необходимости и головной мозг. Диагностика проводилась и при жизни животных, патологи-ческий материал в данном сличае был представлен фекалиями и кровью.
А далее, из полученного малериала по общепринятой методике в мик-робиологии были подготовлены материалы, а именно мазки-отпечатки, кото-рые были окрашены по методу Грама и микроскопированы под иммерсион-ной системой микроскопа. При проведении микроскопии, в поле зрения были обнаружены кругловатые, расположенные попарно и в виде коротких цепо-чек мелкие кокки. Микроорганизмы имели фиолетовый цвет, что характерно для бактерий рода Streptococcus.
Культуральные свойства возбудителя исследовали путём проведения высевов культуры на питательные среды из патологического материала, а именно на обогащённый, до 0,2 % концентрации глюкозой и 10% инактиви-рованной сыворотки лошади, мясо-пептонный бульон (МПБ), а так же, на обогащённый 5% дефибринированной крови кролика и глюкозой до 0,2% концентрации, агар (МПА). Далее культуру инкубировали при 37С в течение 18-20 часов в усло-виях термостата. Спустя необходимое время провели счёт информации. При визуальном осмотре МПБ было установлено, что в нём наблюдается диффуз-ное помутнение. На плотной питательной среде, а именно на чашке петри был отмечен рост колоний, которые имели ровные края, были слегка мутно-ватыми и походили на росинки. Вокруг колоний была заметна зона гемолиза. Она имела зеленоватый цвет и располагалась в виде ободка. Полученные данные свойственны стрептококкам.
Далее нами была проведена дифференциация микроорганизмов. Необ-ходимо было выявить наличие стрептококков или стафилококков. Подобное исследование проводится с помощью каталазной пробы.
Данное исследование заключиется в том, что на предметное стекло не-обходимо нанести каплю 3% свежеприготовленной перекисис водорода, туда же бакпетлёй наносят снятую исследуемую колонию. При внесении стрепто-кокков не выделяется пена, так как стептококки не выделяют каталазу. А вот при внесении колонии стафилококков, из-за наличия каталазы, можно на-блюдать обильное пенообразование. В нашем случае пенообразование отсут-ствовало.
Далее нам предстояла предварительная дифференциация энтнрококков от стрептококков. Для проведения данного исследования производили высев культур в пробирки с желчью, процентное содержание которой в бульоне со-ставляло 10% и 40%. Аналогично, высев проводили в пробирки с 6,5% хло-ристого натрия. Для полной дифференциации необходимо было учитывать и реакции с углеводами (сорбитом, раффинозой, маннитом), Полученные ре-зультаты совмещали с результатми на обогащённых МПА с кровью и МПБ.
Далее производили запись полученных результатов, а именно: в про-бирке, содержащей 10% желчь диагностировали просветление среды, была отмечена ферментация маннита. На плотной питательной среде – МПА во-круг колоний наблюдалась зона неполного гемолиза (альфа гемолиза), имеющая зеленоватый цвет. Полученные результаты указывают на наличие стрептококков.
Далее стрептококки дифференцировали путём проведения серологиче-ского исследования, а именно в реакции преципитации (РП) в капиллярах по известной методике. Для подтверждения патогенности использовали белых беспородных мышей масса которых составляла 16-18 г.
В ходе проведения лабораторных исследований патологического мате-риала, полученного от больных и павших животных, мы выделяли разные виды микроорганизмов рода Streptococcus, доля которых составила: Str.pneumoniae 78%, Str.septicum- 7%, Str.pyogenes- 6%, Str.uberis- 2%, Str.bovis- 1%, Str.vestibularis- 1%, Str.zooepidemicus- 1%, Str.salivarus- 2%, Str.mutans- 1%, Str.gallolyticus- 1%.
Изучение патологоанатомических и гистологических изменений при стрептококкозе крупного рогатого скота
На территории нашей страны не производится выпуск вакцин для специ-фической профилактики стрептококкоза крупного рогатого скота, хотя ущерб, наносимый животноводческим хозяйствам данным заболеванием не вызывает сомнений. Всвязи с вышесказанным, нами были изучены наиболее часто выде-ляемые 112 сероваров микроорганизмов рода Streptococcus по основным биоло-гическим свойствам. Далее, для изготовления вакцины был выбран штамм Str. Pneumoniae по иммуногенным, антигенным свойствам и иммунологической ста-бильности. При культивировании штамма Str. Pneumoniae на обогащённых пи-тательных средах (Левина, Эндо, кровяном МПА, селенитовой, глюкозо-сывороточном МПБ), проводили контроль накопления микробных клеток (м.к./см3). Накопление клеток составило 10 – 20 млрд м.к./см3. Следующим эта-пом в работе был подбор питательной среды для выращивания бактериального сырья. Для этих целей нами был обогащённый глюкозой МПБ, вследствие его доступности, низкой сибистоимости в сравнении с другими средами. Данная среда позволяет получать оптимальную концентрацию клеток возбудителя.
При производстве опытных серий инактивированных вакцин проводили освежение вирулентного возбудителя стрептококкоза штамма Str. Рneumoniae в пробирках с биофабричным МПБ, в который был добавлен 40%-ый раствор глюкозы, что бы конечная концентрация в среде составляла 1%, рН бульона со-ставил 7,2–7,4. Культивация проходила при 37С в условиях термостата. Период культивации составил 18-20 ч. Чистоту выращенной культуры определяли на МПБ, МПА, агаре и бульоне Сабуро, среде Китта-Тароцци, Плоскирёва, Эндо. Окрашивание микроорганизмов проводили по методике Грама.
Далее проводили выращивание матровой расплодки. Для данных целей использовали флаконы, ёмкость которых составляла 250 мл. В каждый флакон была внесена питательная среда - обогащённый до 1% концентрации глюкозой мясо - пептонный бульон, в количестве 80 – 100 мл, рН 7,2–7,4. В питательную среду вносили культуру возбудителя - вирулентный штамм Str. Рneumoniae с содержанием не менее 4109 микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича в объёме 1–2 мл. Культивацию посевов осуществляли в термостате при температурном режиме, равном 37С. Продолжительность куль-тивации составляла 18-20 часов. Определение чистоты выращенных микроорга-низмов осуществляли на МПБ, МПА, агаре и бульоне Сабуро, среде Китта-Тароцци, Плоскирёва, Эндо. Окрашивание микроорганизмов проводили по ме-тодике Грама.
Следующим этапом в проведении нашей работы стало получение бакте-риологического сырья, используемого для изготовления вакцин. Выращивание микроорганизмов осуществляли в бутылях, ёмкость которых составляет 3-5 лит-ров. Для этого в них вносили питательную среду – обогащённый 40% глюкозой до 1% окончательной концентрации мясо - пептонный бульон и матровую рас-плодку. Объём матровой расплодки от общего колличества питательной среды ра составил 5-10%.
Период культивации составил 18-20 ч. В термостате при температуре 37С, рН 7,2–7,4. Для контроля чистоты роста использовали обогащённый 5% дефибринированной крови кролика мясо - пептонный агар и бульон, среду Кит-та-Тароцци, агар и бульон Сабуро, окрашивание выращенных микроорганизмов проводили, используя методику Грама. Выращенное бактериологическое сырьё подлежит инактивации. Для этого в полученную культуру возбудителя, в которой концентрация микробных клеток по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича в одном кубическом сантиметре составила 4109, вносили формалин, конечная концентрация которого соста-вила 0,3-0,5%. Период проведения инактивации составил 48-96 часов, темпе-ратура +37С. Для контролирования полноты инактивации осуществляли вы-сев бактериальной массы на твёрдые и жидкие питательные среды: Плоски-рёва, Эндо, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар. Контроль за сре-дами проводят в течении 10-ти суток. При сомнительных результатах осуще-ствляли инфицирование исследуемым материалом лабораторных мышей, масса которых – 16-18 г. Наблюдение за животными продолжали 10 суток.
Изучение параметров инактивации возбудителя стрептококкоза Чтобы создать инактивированную вакцину потребовалось определиться с выбором инактиватора. Он должен быть эффективным, т.е. сохранять иммуно-генные свойства возбудителя, при этом лишать его патогенности. В качестве та-кого препарата был выбран формалин. Следующим этапом работы было созда-ние методики инактивации культуры возбудителя. Для осуществления данной цели в исследуемую культуру - штамм Str. рneumoniae, в которой напопление микробных клеток составило не менее 4109 м. к./см3 по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича, производили внос формалина. Использовали инактиватор в виде растворов различной концентрации, а именно, по активности формальдегида от 0,1 до 0,4%. Куль-туру возбудителя с формалином при температурных режимах 37±2С и 22±2С оставляли на 15 суток, осуществляя периодически помешивание. Для контроля полноты проведения инактивации изучаемую культуру высевали на питательные среды – мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон, готовили препараты, окраску которых производили по методике Грама. В течение 10 суток проводился их просмотр. В сомнительных случаях проводили биопробу, при которой проводили заражение белых лабораторных мышей исследуемым материалом. Наблюдение за подопытными животными, контроль их состояния осуществляли в течение 10 сут. Полученные резуль-таты представлены в таблице 1.
