Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Распространение микроскопических грибов и микотоксинов в природе 9
1.2 Краткая характеристика наиболее опасных микотоксикозов животных 15
1.3 Методы снижения содержания микотоксинов в кормах 20
1.3.1 Физические методы обезвреживания кормов 21
1.3.2 Химические методы обезвреживания кормов 23
1.3.3 Биологические методы обезвреживания кормов 26
1.4 Пробиотики и их характеристика 27
1.4.1 Микробиологический состав пробиотиков 31
1.4.2 Показания для применения пробиотиков 32
1.4.3 Классификация пробиотиков 33
1.5 Спорообразующие аэробные бактерии рода Bacillus 35
1.5.1 Механизм действия пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus 36
1.5.2 Преимущества бактерий рода Bacillus от других видов пробиотических бактерий 38
1.6 Заключение по обзору литературы 39
2. Собственные исследования 43
2.1 Материалы и методы исследования 43
2.2 Результаты исследований 47
2.2.1 Краткие сведения о природно-климатических условиях Якутии и характеристика отрасли коневодства 47
2.2.2 Изучение распространенности плесневых и токсигенных грибов в Республике Саха (Якутия) 49
2.2.3 Анализ результатов микологических исследований кормов Амгинского района 53
2.2.4 Результаты микробиологических и агрохимических исследований почвы тебеневочных пастбищ Амгинского улуса Республики Саха (Якутия)
2.2.5 Микологические исследования тебеневочных пастбищ Республики Саха (Якутия) 60
2.3 Разработка мер профилактики микотоксикозов лошадей табунного содержания в условиях Якутии 65
2.3.1 Изучение фунгицидной активности штаммов бактерий Bacillus subtilis по отношению к токсигенным и плесневым грибам 65
2.3.2 Разработка способа борьбы с плесневыми и токсигенными грибами 68
2.3.3 Испытание препарата из штаммов бактерий Bacillus
subtilis, адсорбированных на овсе для борьбы с плесневыми и токсигенными грибами 73
2.3.4 Санитарно-микологические исследования обработанного сена 79
2.3.5 Изучение влияния сена, обработанного препаратом Сахабактисубтил, на организм лошадей 82
2.3.6 Испытание биопрепаратов Сахабактисубтил и Лактобифадол для борьбы с плесневыми и токсигенными грибами 85
2.3.7 Производственное испытание и экономическая эффективность способа борьбы с плесневыми и токсигенными грибами 91
3. Обсуждение результатов 94
4. Выводы 102
5. Практические предложения 104
6. Список сокращений и условных обозначений 105
7. Список литературы 106
- Физические методы обезвреживания кормов
- Показания для применения пробиотиков
- Изучение распространенности плесневых и токсигенных грибов в Республике Саха (Якутия)
- Изучение влияния сена, обработанного препаратом Сахабактисубтил, на организм лошадей
Физические методы обезвреживания кормов
Проблема микотоксинов известна с глубокой древности. Письменные упоминания о микотоксинах содержатся в Ветхом завете, литературе раннего буддизма, сельскохозяйственных трактатах Древнего Египта, Греции, Рима. Периодически случались отравления людей и животных при употреблении продуктов, содержащих микотоксины. Наиболее известна гибель 14 тысяч человек в Париже в 1129 году при употреблении хлеба, содержащего микотоксин (эрготоксин) спорыньи злаков (Claviceps purpurea). В России также отмечены случаи массового отравления людей и животных зерном и хлебом, содержащим микотоксины возбудителя фузариоза - F. graminearum. С каждым годом проблема микотоксикоза обостряется, токсигены (грибы, образующие токсины) быстро приспосабливаются к новым технологиям и современным пестицидам, при этом увеличивают образование микотоксинов в сотни раз (Е.Л. Матвеева, 2008).
Основным источником распространения грибов, поражающих корма, является почва. Частицы почвы, попадая на сено, солому и другие виды растительности во время их уборки, являются носителями спор многочисленных грибов и обрывков их мицелия, которые при наличии благоприятных условий прорастают и поражают эти корма. Поэтому на влажных кормах встречаются также многие виды грибов тех почв, на которых произрастали данные кормовые растения до их уборки (А. Иванов, 2008).
Проведенный микологический анализ в различных регионах республики Татарстан показал, что микобиота почвы в зоне повышенного антропогенного воздействия менее разнообразна по видовому составу. Содержание в почве и кормах опасных микромицетов родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium более высокое, чем в экологически благополучном регионе. Микромицеты, выделенные из зон антропогенного воздействия, обладают более выраженными токсическими свойствами (P.P. Мусин и др., 2004).
При исследовании образцов почв чернозема Западной Сибири были выделены микроскопические грибы рода Aspergillus (A. fumigatus, A. flavus, A.niger, A. ustus), Fusarium (F. Oxysporum, F. solani) и др. Обнаружено, что разнообразие этих видов несколько выше в зонах расположенных южнее. Черноземы Западной Сибири в составе микоценозов содержат гораздо больше токсичных форм грибов, чем в Европейской части страны, где, по данным ВНИИСХ микробиологии, их количество колеблется в пределах 15-26% от числа выделенных. Токсичные виды микромицетов распространены больше в освоенной почве. Согласно материалам Новосибирской областной лаборатории, отравления животных микотоксинами составляют 34% от числа всех зарегистрированных алиментарных токсикозов (А.В. Иванов и др., 2010).
В России по распространенности наибольшее санитарное значение имеют фузариотоксины - вомитоксин (дезоксиниваленол), Т-2 токсин и зеараленон (A.M. Смирнов, Г.А. Таланов, 1999; М.Я. Тремасов, 2002). Так, вомитоксин, продуцируемый грибом F.gramine arum, чаще выявляют в зерновых кормах из юго-западного региона европейской части России (Ставропольский и Краснодарский края, юг Ростовской области) (В.А. Русанов и др., 2007).
F. sporotrichiella в регионах Среднего Поволжья выделяют как наиболее частый контаминант пищевой продукции и кормов. Микромицеты были выделены в 70% случаев из образцов кормов, отобранных в различных регионах Республики Татарстан, при этом около 40% изолятов обладали токсическими свойствами, 14% -продуцировали трихотеценовые микотоксины (А.И. Сергейчев, 1998).
Проведена оценка токсического потенциала популяции основных возбудителей фузариоза. Для всех обследованных популяций вида F. sporotrichiella (Центральный, Волго-Вятский, Центрально-Черноземный, Уральский, Западно-Сибирский, Восточно-Сибирский регионы) установлена высокая токсигенность в отношении Т-2 токсина, для вида F. graminarum (Центрально-Черноземный, Дальневосточный регионы) в отношении ДОНа и зеараленона.
Проведенные исследования частоты встречаемости штаммов - суперпродуцентов фузариотоксина (Fusarium graminearum) в агроценозах Северного Кавказа показали, что в начале 90-х годов их распространение достигало 100%, а к 1999 г. снизилось до 34,8%.
Проведенный мониторинг содержания ДОН и зеараленона в продовольственном зерне пшеницы, кукурузы, ячменя, ржи и овса урожаев 1999-2001 гг. из разных районов России, а также фумонизинов в зерне кукурузы и продуктов его переработки, подтвердил существование постоянной вероятности загрязнения фузариотоксинами продовольственного зерна.
Результаты микотоксикологического анализа показали, что в сухие годы F. moniliforme достигает широкой распространенности в Якутской и Амурской областях, а в Омской области и в Алтайском крае входит в группу доминирующих видов (О.А. Монастырский, 2001; А.А. Былгаева, 2009).
Массовые микотоксикозы животных отмечались на птицефабриках Атемарская, Октябрьская в Мордовской Республике; Казанская, Пестречинская, Тукаевская в Республике Татарстан; в свиноводческих хозяйствах Красноармейского района Республики Чувашия, Сабинском, Тукаевском районе Республики Татарстан, Медведевском, Звениговском районе Республики Марий-Эл (М.Я. Тремасов, 2000).
В период с 2000 по 2010 гг. было происследовано более 12000 образцов проб кормов, полученных из различных регионов Поволжья: Республик Марий-Эл, Чувашия, Татарстан, Башкортостан, Мордовия, а также Ульяновской, Самарской, Саратовской областей. Содержание микроскопических грибов в них за этот период значительно варьировало, в зависимости от температуры и влажности воздуха. В засушливые годы с небольшим количеством осадков наблюдалось значительное увеличение числа грибов рода Aspergillus и Penicillium. В более влажные годы доминирующими были грибы: F.sporotrichiella, F. graminearum, F. moniliforme, F.culmorum (A.B. Иванов и др., 2010).
Показания для применения пробиотиков
За последние десятилетия в Республике Саха (Якутия), по данным ветеринарно-испытательных лабораторий Республики Саха (Якутия), Департамента ветеринарии PC (Я) отмечено значительное контаминирование кормов растительного происхождения плесневыми грибами.
Так, по отчетным данным Департамента ветеринарии МСХ и ГШ PC (Я) за последние 10 лет (2003-2012 гг.) из 53126 проб сена при микологическом исследовании пораженность плесневыми грибами отмечена в 6936 пробах. При микологическом исследовании 1904 проб сочных кормов, положительный результат зарегистрирован в 360 пробах; при исследовании 18159 проб концентрированных кормов, положительный результат - у 1354 проб, что составляет соответственно сено - 13,01%, сочные корма - 18,09% и концентрированные корма - 7,45% от исследованных проб (табл. 4).
Из данных таблицы 4 видно, что наибольшее выделение микроскопических грибов отмечено у сочных - 18,09% и грубых кормов 13,05%. Это объясняется тем, что природно-климатические условия Республики Саха (Якутия) в период заготовки и длительного хранения сена являются наиболее благоприятными для роста и развития грибов.
Таким образом, анализ статистических данных Департамента Ветеринарии МСХ PC (Я) по микологическим исследованиям показал, что наиболее выделяемыми являются грибы, относящиеся к группе плесневых. Данное явление подтверждается проведенными санитарно-микологическими исследованиями кормов. Улус входит в состав заречной группы районов и граничит на севере и северо-западе с улусами: сельскохозяйственными - Чурапчинским, Мегино-Кангаласским, Хангаласским, на юге и востоке с промышленными - Усть-Майским и Алданским. Он обладает достаточно выгодным географическим положением, потому что находится в Центральной Якутии, граничит с промышленными районами и имеет сравнительно развитую транспортную сеть. В улусе 14 наслегов, 23 сельских населенных пункта.
Ведущее место в экономике улуса занимает сельское хозяйство. Главная отрасль - животноводство (мясомолочное скотоводство, мясное табунное коневодство), а так же возделываются зерновые, картофель, овощи и кормовые культуры. Общая площадь сельскохозяйственных угодий составляет 105,5 тыс. га, из них пашни - 15,6 тыс. га, сенокосы - 46,8 тыс. га, пастбища - 39,9 тыс. га, залежи - 3,2 тыс. га (О.М. Кривошапкина, 2011).
За последние пять лет в Амгинском районе Республики Саха (Якутия), Управлением ветеринарии с ветеринарно-испытательной лабораторией Амгинского района при Департаменте ветеринарии Республики Саха (Якутия) отмечено увеличение контаминирования кормов растительного происхождения и патологического материала плесневым грибами.
Так, по отчетным данным Управлении ветеринарии с ветеринарно-испытательной лабораторией Амгинского района за последние 5 лет (2008-2012 гг.), из 2079 исследованных проб сена, при микологическом исследовании, положительный результат отмечен в 348 пробах. При микологическом исследовании 55 проб сочных кормов, положительный результат зарегистрирован в 7 пробах, при исследовании 899 проб концентрированных кормов, положительный результат - у 88 проб, что составляет соответственно сено 54 16,7%, сочные корма - 12,7% и концентрированные корма - 9,7% от исследованных проб (табл. 6).
Из данных таблицы 6 видно, что наибольшее выделение микроскопических грибов за период исследования (2008-2012 гг.) отмечено у грубых кормов - 16,7% (сено).
Как показывают данные таблицы 7 и рисунка 3, проведенный за 5 лет анализ (2008-2012 гг.) показал, что чаще всего встречаются плесневые грибы рода Мисог -52,6% (2183 проб), Aspergillus - 19,7% (818 проб), Fusarium - 15,3% (636 проб), Penicillium - 10,23% (424 проб) и другие микроскопические грибы - 2% (83 проб).
Таким образом, проведенный анализ результатов микологических исследований заготовленных кормов Амгинского района РС(Я) за период 2008-2012 гг. (по данным УВ с ВИЛ) показал доминирование плесневых грибов рода Мисог, а также контаминирование кормов токсигенными грибами рода Aspergillus, Fusarium и Penicillium. Таблица 7 - Распространение плесневых и токсинообразующих грибов в кормах Амгинского района Республики Саха (Якутия) в период 2008-2012 гг.
Пробы образцов почвы взяты 27.07.2012 года, на глубине 0-10, 10-20, 20-40, 40-60 см - для проведения микробиологических и агрохимических исследований, в соответствии с ГОСТом 17.4.3.01-83 и ГОСТом 17.4.4.02-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб». Почвы брали по 5 образцов из 4 горизонтов и анализировали отдельно. Схема отбора проб конвертом приведена на рисунке 4.
Результаты исследований образцов почвы тебеневочных пастбищ из территории Амгинского улуса (табл. 8) показали повышение - рН, как водного и солевого (8,3±0,1, 7,3 ±0,1), калия (259,7±5,6 мг/кг), г/кислотности (0,7±0,1 мг/100 г), снижение азота-нитратного (0,1 ±0,01 мг/100 г), гумуса (3,3±0,1%), хлоридов (0,5±0,1 мг/100 г), щелочности (0,6±0,1 мг/100 г), фосфора (143,6±8,4 мг/кг). Снижение содержания микроэлементов йода (0,5±0,1 мг/кг) и отсутствие микроэлемента селена.
Малое количество микроорганизмов, использующих минеральные формы азота (3,5x10 КОЕ/г) по сравнению с общим числом бактерий усваивающих органические формы азота (4,08x104 КОЕ/г), а также невысокое содержание гумуса, показывает очень замедленную степень минерализации органического вещества, коэффициент минерализации составляет всего 0,8.
Изучение распространенности плесневых и токсигенных грибов в Республике Саха (Якутия)
Заражение кормов микотоксинами, являющимися продуктами плесневых грибов рода Fusarium, Penicillium и Aspergillus, представляет значительную проблему, так как микотоксикозы - болезни, возникающие в результате поедания таких кормов, могут привести к снижению продуктивности, заболеваниям и гибели животных (А.В. Иванов и др., 2008).
Имеется около 250 видов различных грибов, производящих до 300 типов микотоксинов. Основные микотоксины, представляющие интерес в животноводстве, можно разделить на три группы: первая производные грибов рода Aspergillus (Афлатоксин); вторая - Fusarium (Зеараленон, Фумонизин, ДОН, Т-2), третья - Penicillium и Aspergillus (Охратоксин). Разные виды грибов, продуцирующих микотоксины, развиваются при различных погодных условиях, поэтому уровень микотоксинов может отличаться от года к году (А. Мартинес, 2011). Высокий уровень микотоксинов возможен при низком уровне поражения зерна грибами и наоборот. Наиболее благоприятный период для развития грибов - когда растения испытывают стрессовую ситуацию: засушливое, дождливое, холодное лето, недостаток удобрений, наличие вредителей посевов (зерна). В животноводстве микотоксины влияют на весь производственный процесс, начиная от дополнительных затрат на производство комбикорма и заканчивая снижением производственных показателей и повышенным падежом (Л.Е. Матросова и др., 2011).
Россия, США, Канада, Европейские государства и многие другие страны имеют свои стандарты по предельно допустимому содержанию каждого из микотоксинов в комбикормах. Одни и те же микотоксины воздействуют на сельскохозяйственных животных по-разному, так, например, свиньи более чувствительны к ДОН, лошади - к фумонизину. Таким образом, имеется своя «шкала чувствительности» для каждого вида животного. Также многие микотоксины обладают синергетическим действием (П.В. Трефилов, 2011). Анализ результатов отчетных данных Департамента ветеринарии Республики Саха (Якутия) за 2003-2012 гг. показывает на значительную пораженность кормов плесневыми грибами. Так обсемененность этими опасными грибами сена составляет 13,01%, сочных кормов - 18,09% и концентрированных кормов - 7,45%. При этом наиболее часто отмечаются плесневые грибы: Мисог (44,21%), Aspergillus (22,1%) и Fusarium (9,36%).
Микологический анализ кормов, заготовленных в Амгинском улусе, где проведены производственные опыты, также показал контаминацию сена, сочных кормов и овса плесневыми грибами. Следует отметить высокие показатели пораженности кормов плесневыми грибами Мисог (52,6%), Aspergillus (19,7%) и Fusarium (15,3%).
Микологическими исследованиями кормов из тебеневочных пастбищ, проведенными нами в 2010-2013 гг в 9 районах Республики Саха (Якутия) установлено значительное распространение грибов рода Aspergillus (67,1%) и Fusarium (51,9%). Отмечено, что токсигенные грибы Aspergillus nidulans и Aspergillus niger являются доминантными в комплексе грибов - контаминантов растительности тебеневочных пастбищ.
Полученные нами результаты не согласуются с результатами исследований Якутской Республиканской ветеринарно-испытательной лаборатории. Это можно объяснить тем, что данные лаборатории показывают исследования кормов, заготовленных в разное время и для всех видов животных, а не пробы от растительности тебеневочных пастбищ.
Ряд авторов (И.Н. Гребенюк, 1970; СВ. Петрович, 1989; А.Н. Маянский, М.И. Заславская, Е.В. Салина, 2000; О.А. Монастырский, 2001; Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди, 2001; Я.В. Зачиняев, А.В. Зачиняева, 2005) отмечали о значительном распространении плесневых и токсигенных грибов в кормах животных.
По данным Управления по сельскому хозяйству и продовольствию при ООН (FAO) около 25% всего собираемого в мире зерна поражено микотоксинами (Д.О. Сулливан, 2005). В нашей стране более 30% кормов и другой сельскохозяйственной продукции загрязнены микотоксинами. В Республике
Татарстан 32,3% кормов поражены токсигенными грибами и их токсинами. Плесневые грибы снижают качество и питательность кормов (потеря влаги, углеводов, липидов, белков), а их метаболиты - микотоксины опасны для здоровья животных и человека (М. Тремасов, А. Щеков, Е. Тарасова, 2013). При употреблении лошадьми кормов обсемененных токсигенными грибами возможны серьезные отравления (микотоксикозы) вплоть до гибели животного. Токсигенные грибы и их микотоксины могут быть причиной массовых абортов лошадей табунного содержания (П.И. Николаев, 1989).
Проблема распространения плесневых грибов и их метаболитов особо актуальна в нашей стране, когда из-за недостаточности средств на проведение микологических исследований непроверенные на качество корма нередко поступают в организм животных и негативно влияют на сохранность и продуктивность животных. В условиях Якутии, вероятно одним из основных причин низкой продуктивности лошадей (деловой выход 50-55%) табунного содержания является низкое качество добавочного и тебеневочного корма, пораженного плесневыми и токсигенными грибами.
Таким образом, анализ микологических исследований Республиканской ветеринарно-испытательной лаборатории, собственных результатов и литературных данных показывает необходимость разработки в табунном коневодстве научно обоснованных мер борьбы с токсигенными грибами, потенциальными продуцентами микотоксинов опасных для лошадей и человека.
В последние годы большое внимание уделяется использованию биопрепаратов в борьбе с плесневыми и токсигенными грибами. В отличие от химических методов биологический способ активизирует жизнедеятельность полезной микрофлоры, развитие которой необходимо для поддержания баланса кишечного микробиоценоза (О. А. Монастырский, 2002; R.S. Applebaum, Е.Н. Marth, 1981; J. Reiss, 1983).
Изучение влияния сена, обработанного препаратом Сахабактисубтил, на организм лошадей
Обработка сена препаратом Сахабактисубтил, повышает сохранность протеина, клетчатки, фосфора и углеводов. При этом отмечалось уменьшение условно-патогенных бактерий и снижение в 8-10 раз плесневых грибов Aspergillus, Mucor и Penicillium по сравнению с контролем. В течение срока наблюдения в необработанном сене снижается питательность, повышается содержание условно-патогенных бактерий и плесневых грибов.
Таким образом, обработку сена пробиотиком можно использовать в качестве способа профилактики микотоксикозов и для сохранения качества кормов.
Включение в рацион сена, обработанного препаратом Сахабактисубтил, способствует повышению содержания бифидобактерий, лактобактерий, уменьшению количества условно-патогенных микроорганизмов и повышению живой массы по сравнению с контролем. У лошадей, получавших необработанное сено, отмечены нарушение кишечного микробиоценоза с признаками дисбактериоза и в 3,4 раза ниже среднесуточные привесы.
Следовательно, обработку сена пробиотиком Сахабактисубтил можно использовать в качестве способа профилактики микотоксикозов и для профилактики дисбактериозов.
В литературе есть данные, указывающие на эффективность пробиотика СпаС (на основе Lactobacillus plantarum) при микотоксической диарее (Р.Т. Хайруллов, 2007). Данилевская Н.В. с соавторами (2008, 2009) предлагают пробиотик Лактобифадол для стимуляции продуктивности коров, профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней поросят и птиц. Исходя из вышеизложенного нами проведены сравнительные испытания пробиотиков Сахабактисубтил и Лактобифадол при борьбе с плесневыми грибами.
Нами подтверждена эффективность пробиотика Сахабактисубтил для борьбы с плесневыми грибами. Следует отметить, что пробиотик
Сахабактисубтил обладает более высокой стимулирующей активностью по отношению к лактобактериям кишечника, чем пробиотик Лактобифадол. Установлено, что пробиотик Лактобифадол не подавляет рост и развитие плесневых грибов.
Наши результаты согласуются с данными А.В. Иванова с соавторами (2011), отметившими, что лакто- и бифидобактерий обладают слабой антагонистической активностью в отношении возбудителей кишечных инфекций и патогенных грибов.
В последние годы предложены ряд пробиотиков для животноводства: Бифидумбактерин, Зоокорм, Энтеробифидин, СпаС, Лактобактерин, Ромякол, Лактобифадол, Бификол, Фитобациллин, Субалин, Энтероспорин, Спорозит и другие. Однако некоторые из них недостаточно эффективны. Пробиотик должен обладать следующими качествами: стабильность, высокая выживаемость, термостабильность, отсутствие генетически модифицированных микроорганизмов, высокая и широкая антагонистическая активность, устойчивость к пищеварительному соку. Пробиотики из лакто- и бифидобактерий не обладают этими важными качествами. И следовательно малоэффективны в борьбе с плесневыми грибами. Наиболее перспективными в борьбе с плесневыми грибами являются препараты из спорообразующих микроорганизмов (А.И. Нигматуллин и др., 2005; А. Гинзбург, И. Елизаров, 2009; А.В. Иванов и др., 2011; А.А. Ильина и др., 2013; И. Елизаров, С. Глюшин, 2013).
Наши результаты по испытанию сена и овса, обработанного пробиотиком Сахабактисубтил, подтверждаются данными Л.А. Ильиной с соавторами (2013), которые установили эффективность биопрепарата на основе Bacillus subtilis при консервировании плющеного зерна. Так при добавлении биопрепарата полностью отсутствуют энтеробактерии, актиномицеты и клостридии, повышается содержание молочнокислых бактерий.
Таким образом, препарат Сахабактисубтил положительно влияет на качество корма, улучшает гематологические, иммунобиологические показатели сыворотки крови, нормализует кишечный микробиоценоз, повышает привесы, задерживает рост и развитие плесневых грибов. Способ профилактики деконтаминации кормов лошадей плесневыми и токсигенными грибами с использованием препарата Сахабактисубтил экономически обоснован. Экономический эффект на 1 рубль затрат - 3 рубля 80 копеек, на 1 голову - 450 руб.
