Введение к работе
з 1
1.1 Актуальность темы. Важнейшей составной частью питательных
сред, содержащих факторы роста клеточных популяций, является сыворотка
крови животных. Чаще всего для этой цели используют сыворотку крови
крупного рогатого скота (Т.И. Дроздова и др., 1983; Л.П. Дьяконов и др.,
2009 и т.д.). Из литературных источников (Е. Evege et al., 1985; D. Jayme et
al., 1988 и т.д.) следует, что лучшей является сыворотка крови плодов
крупного рогатого скота, однако широкое ее использование ограничивается,
прежде всего, дефицитом и высокой стоимостью.
Ограниченность применения кроличьей сыворотки в биотехнологии связана, вероятно, с первоначальным, необъективным, на наш взгляд, определением ее возможностей в этой области И.И. Подоплеловым и др. (1965). Данная биологическая добавка была оценена авторами негативно при выращивании культуры клеток CaVe. Между тем, в последние годы об использовании сыворотки крови кроликов при культивировании клеток животных тканей стали упоминать чаще и с позитивных позиций (Дьяконов Л.П., 2000; каталог-справочник «Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук» фирмы «Sigma-aldrich», США, 2004-2005; сайт компании «Abkam», США, , 2009). Существенным преимуществом ее перед сывороткой крови крупного рогатого скота, является гетеровидовой характер по отношению к большинству возбудителей вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных.
Исходя из вышеизложенного, нами изучены биохимический состав сыворотки крови кроликов, а также ее биологические эффекты на пролиферацию перевиваемых культур клеток и репродукцию на них вирусов.
1.2 Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в изучении
возможности применения кроличьей сыворотки в качестве биологический
добавки в питательные среды при выращивания культур клеток и
репродукции на них вирусов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Найти наиболее приемлемый метод взятия крови у кроликов на
кролиководческих предприятиях в условиях производственного их убоя.
Получить кроличью сыворотку, достаточную по объему для проведения вирусологических и биотехнологических исследований на культурах клеток.
Определить вариабельность биохимического состава сыворотки крови кроликов от их половой принадлежности и сезона года.
Оценить ростовые свойства сыворотки крови кроликов на перевиваемых культурах клеток MDBK, ВНК-21/13-02, LEK, SPEV, Vero, при непродолжительной адаптации к данной биологической добавке в культуральных средах.
Установить особенности репродукции вирусов на перевиваемых культурах клеток LEK и Vera, выращенных на средах с добавлением кроличьей сыворотки.
1.3 Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность
введения сыворотки крови кроликов в практику культивирования клеток.
Дается ее физико-биохимическая характеристика в зависимости от половой
принадлежности кроликов. Показаны особенности ее влияния на рост и
морфологию перевиваемых культур клеток животных разных видов (SPEV -
почки эмбриона свиньи, MDBK - почки эмбриона крупного рогатого скота,
ВНК-21/13-02 - почки новорожденного сирийского хомячка, LEK - легкого
эмбриона крупного рогатого скота, Vero - почки африканской зеленой
мартышки). Впервые проведена оценка репродукции вирусов инфекционного
ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота на
культуре клеток LEK, а также реовируса типа 1 штамм «Lang» на линии
клеток Vero, при их выращивании с использованием кроличьей сыворотки.
1.4 Практическая ценность работы. Разработана технология
получения сыворотки крови кроликов в производственных условиях и
показана возможность ее применения в средах для культивирования перевиваемых клеток и репродукция на них вирусов. Кроличья сыворотка, являющаяся гетеровидовой по отношению практически ко всем культурам клеток, хранящимся в криобанке ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВЙ», применяемая в качестве ростстимулирующего фактора, позволяет снизить вероятность вирусной контаминации культур клеток и повысить репродукцию вирусов на них.
На основе полученных данных разработана «Временная инструкция по получению и контролю качества сыворотки крови кроликов для культивирования клеток животных тканей» (2010 г).
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на следующих научных форумах: Научно-практические конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» (Казань, 2007) и «Достижения молодых ученых - в производство», посвященная 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдулина (Казань, 2008); Международные научно-практические конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященная 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008); «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», к юбилею кафедры органической и биологической химии МГАВМиБ (Москва, 2008); «Современные тенденции развития ветеринарной медицины и инновационные технологии в ветеринарии и животноводстве» (Казань 2009); Московская международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.
1.7 Основные положения, выносимые на защиту:
усовершенствование технологии получения сыворотки крови кроликов применительно к условиям производственного их убоя;
зависимость биохимического состава сывороток крови кроликов от половой принадлежности и сезона года;
пролиферативная активность перевиваемых культур клеток MDBK, ВНК-21/13-02, LEK, SPEV, Vero на среде с сывороткой крови кроликов;
стабильная репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на перевиваемой культуре клеток LEK, и высокая при репродукции реовируса на линии клеток Vero, выращенных на среде с использованием сыворотки крови кроликов.
1.8 Реализация результатов исследований. Результаты выполненных
исследований используются в лаборатории культур клеток и гибридомной
технологии ФГУ «ФЦГРБ - ВНИВИ» при культивировании перевиваемых
линий животных клеток для изготовления вакцин.
1.9 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа
изложена на 124 страницах компьютерного текста, состоит из следующих
традиционных разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы
исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение,
заключение, выводы, практические предложения, список использованной
литературы. Работа содержит 14 таблиц, проиллюстрирована 22 рисунками.
Список литературы включает 188 библиографических источников, в том
числе 75 на иностранном языке.
