Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Использование методов культуры in vitro органов и тканей для селекционно-генетических целей 7
1.2. Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур13
1.3. Влияние ряда факторов на андрогенез in vitro 14
1.3.1.Влияние генотипа 15
1.3.2. Стадии развития пыльцы и влияние состава питательных сред 16
1.4. Культура in vitro листовых эксплантов 25
1.5. Клональное микроразмножение растений .27
1.6. Методы адаптации пробирочных растений к нестерильным почвенным условиям 34
1.6. Биологические особенности колонновидных форм яблони .37
CLASSГлава 2. Цель, задачи, объекты, методика и условия проведения исследованийCLASS 41
2.1. Цель и задачи исследования .41
2.2. Материалы и методы исследования 42
Глава 3. Влияние различных факторов на процесс культивирования in vitro пыльников яблони48
3.1. Генотип растений-доноров .48
3.2. Влияние условий формирования пыльников in vivo донорных растений яблони на индукцию андрогенеза in vitro50
3.3. Стадии развития пыльцы 54
3.4. Инфицированность пыльников яблони в условиях in vitro .57
3.5. Холодовая предобработка пыльников 60
3.6. Подбор питательных сред для индукции каллусогенеза 62
3.7. Морфологические особенности андрогенных каллусов 68
Глава 4. Индукция процессов морфогенеза в культуре листовых эксплантов яблони.72
4.2 Разработка приемов стерилизации листовых эксплантов и введение их в культуру 72
4.3. Индукция каллусо- и морфогенеза у различных генотипов яблони75.
Глава 5. Микроклональное размножение колонновидных слаборослых генотипов яблони 81
5.1. Возраст и состояние маточных растений, сроки изоляции,
размер инициальных эксплантов 82
5.2. Введение в культуру in vitro апикальных меристем.85
Глава 6. Разработка приемов размножения побегов-регенерантов колонновидных форм яблони в условиях in vitro89
6.1. Собственно микроразмножение 89
Глава 7. Укоренение микропобегов in vitro колонновидных форм яблони 93
7.1. Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта... 97
Глава 8. Экономическая эффективность выращи-вания посадочного материала колонновидных слаборослых генотипов яблони с помощью метода клонального микроразмножения102
Выводы 104
Список литературы 107
- Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур
- Влияние условий формирования пыльников in vivo донорных растений яблони на индукцию андрогенеза in vitro
- Индукция каллусо- и морфогенеза у различных генотипов яблони
- Введение в культуру in vitro апикальных меристем
Введение к работе
Актуальность темы. Колонновидные слаборослые генотипы яблони занимают особое место в современном плодоводстве, так как имеют большие биологические преимущества по сравнению с обычными сортами - небольшую высоту и особый тип кроны – без боковых ответвлений, раннее вступление в плодоношение и высокую продуктивность в 5-6 раз превышающую обычные сорта (Кичина, 2006). В связи с этим изучение их биотехнологических особенностей является весьма актуальным.
В селекционно-генетических исследованиях, проводимых в настоящее время с плодовыми растениями, все шире применяются современные биотехнологические методы и приемы, в том числе и такие, как культура in vitro изолированных пыльников, листовых эксплантов, меристем. Их использование позволяет успешнее решать многие как фундаментальные, так и прикладные задачи. Культура изолированных пыльников (метод андрогенеза in vitro) является одним из распространенных методов получения гаплоидных, а на их основе гомозиготных растений. Использование таких растений в селекционно-генетической практике ускоряет процесс получения новых сортов, повышает эффективность генетических исследований, расширяет существующий генофонд. Это показано на ряде овощных и зерновых культур, у которых с использованием метода культуры пыльников уже получены новые высокоэффективные сорта (Орлов, 1998; Анапиляев, 2000; Бобков С. В., 2002; Шмыкова Н. А., 2006; Муравлев, 2007). Однако у плодовых культур, в частности яблони, андрогенез in vitro мало изучен. Лишь у отдельных генотипов получены андрогенные каллусы, эмбриоиды и растения-регенеранты с небольшой частотой (Хамукова, 1994; Высоцкий,1998, 2005; Hfer M., 1999, 2004). У колон-новидных слаборослых генотипов яблони такие исследования не проводились.
В настоящее время в биотехнологической работе используется также культура in vitro листовых эксплантов. Этот метод применяется в области генной инженерии, для выделения изолированных протопластов из мезофилла и гибридизации соматических клеток, для изучения действия физиологически активных веществ, механизма перехода клеток к дедифференциации, в системах микроразмножения и оздоровления ценных генотипов. Для этого необходимо наличие надежных методов регенерации растений из листовых эксплантов. В связи с этим данное направление исследования является, также актуальным для колонновидных слаборослых генотипов яблони.
Метод клонального микроразмножения служит для оздоровления и быстрого размножения ценных генотипов растений. Основными преимуществами данного метода являются возможность получения необходимого числа растений из небольшого количества исходного материала и сокращение сроков его получения до одного года, в то время, как при использовании традиционных вегетативных способов размножения у плодовых растений требуется обычно более 3 лет. Имеется ряд исследований по клональному микроразмножению яблони (Верзилин, Иванов и др., 1998; Самусь, Семенас, 2006; Матушкина, 2008). Однако для колонновидных слаборослых генотипов яблони метод клонального микроразмножения разработан недостаточно.
Цель и задачи исследований. Цель работы - разработать эффективные методы получения регенерантов из эксплантов различного происхождения колонно-видных слаборослых генотипов яблони в культуре in vitro.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
1. Изучить влияние генотипа, состава питательных сред, стадии развития
пыльцы, холодовой предобработки пыльников на андрогенез in vitro.
-
Выделить генотипы с высоким андрогенетическим потенциалом.
-
Подобрать условия успешной стерилизации листовых эксплантов в культуре in vitro.
4. Индуцировать в культуре листовых эксплантов морфогенетические про
цессы.
5.Определить факторы культивирования, обеспечивающие высокую эффективность микроклонального размножения.
6. Разработать условия для активного размножения и укоренения in vitro
7. Определить морфогенетический потенциал колоновидных слаборослых
генотипов яблони
8. Усовершенствовать условия адаптации растений-регенерантов к открыто
му грунту.
На защиту выносятся следующие основные положения.
-
Приемы индукции каллусо- и морфогенеза в культуре in vitrо изолированных пыльников колонновидных слаборослых генотипов яблони.
-
Условия получения регенерантов в культуре листовых эксплантов.
3. Микроклональное размножение, укоренение и адаптация к условиям in
vivo.
Научная новизна. Впервые для колонновидных слаборослых генотипов яблони разработаны биотехнологические приемы получения первичных андроген-ных новообразований, а также регенерантов из листовых эксплантов и почек.
Выявлены генотипы с высокой, более 40% способностью, образования андро-генных каллусов. Определена наиболее благоприятная продолжительность хо-лодовой предобработки пыльников (6 и 9 суток), которая оказывает положительное влияние на выход андрогенных образований. Установлено, что стадия микроспоры является лучшей для индукции андрогенеза in vitro у колонновид-ных слаборослых генотипов яблони.
Подобраны оптимальные сочетания физиологически активных веществ, и на этой основе разработаны питательные среды, эффективные для высокого выхода каллусов и растений-регенерантов из листовых эксплантов и апикальных почек. Разработаны условия для активного размножения и укоренения in vitro колонно-видных слаборослых генотипов яблони.
Подобраны условия успешной адаптации in vivo регенерантов колонновидных слаборослых генотипов яблони.
Практическая значимость. Для практического использования в селекционно-генетической и биотехнологической работе рекомендуются колонновидные слаборослые генотипы яблони - IV, VII, VIII, обладающие способностью к андрогенезу in vitro, регенерации в культуре листовых эксплантов и микроклональ-ному размножению. Разработана методика получения регенерантов колонно-видных слаборослых генотипов яблони из эксплантов различного происхождения.
Апробация работы. Результаты исследований были поддержаны Фондом содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере (СТАРТ-2011) в виде гранта в 2011 году. Основные результаты исследований были доложены на конференции «Молодежное инновационное предпринимательство ЦФО» (Липецк, 2011). Там же в рамках заседания Общественного Совета при Полномочном Представителе Президента Российской Федерации в ЦФО награждена грамотой, как победитель Конкурса инновационных стартап-компаний, созданных молодежью ЦФО
Публикация материалов исследований. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ к защите кандидатских диссертаций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 листах компьютерного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов, рекомендаций производству, списка используемой литературы из 226 наименований (157 отечественных и 69 иностранных). Диссертация иллюстрирована 27 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 13 таблиц.
Андрогенез in vitro сельскохозяйственных культур
Согласно определению андрогенез in vitro – процесс образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры и клеток пыльцевого зерна (гаметофита высших растений). Это связано с тем, что в определенных условиях спорогенные клетки могут переключаться с характерного им гаметофитного на принципиально иной – спорофитный путь развития (Круглова, Горбунова 1997). Это явление было открыто в 1964 году Гуха и Махешвари, которые, изучая физиологию мейоза у пыльников Datura innoxsia, наблюдали образование эмбриоидов а затем и целых растений на искусственных питательных средах (Гуха, Mагешвари, 1964). В последующем было доказано, что они возникли из пыльцевых зерен и имели гаплоидный набор хромосом. С этого времени данное направление развивалось очень активно. Открытие андрогенеза in vitro относят к самым значительным в биологии второй половины прошлого столетия (Горбунова, Круглова, Батыгина 1993). У целого ряда одно- и двулетних культур андрогенез in vitro довольно хорошо изучен. При культивировании пыльников были получены эмбриоиды, каллусы, растения-регенеранты (Maheshwari et al., 1982; Шамина, 1981; Батыгина с соавт., 1992; Круглова, Горбунова, 1997; Тюкавин, 2006; Шмыкова, 2006; Муравлев, 2007). В результате проведенных исследований было установлено, что в условиях in vitro репродуктивные клетки пыльников могут развиваться по одному из следующих путей: 1. Прямой андрогенез (эмбриоидогенез) – репродуктивные клетки (микроспоры или клетки пыльцевого зерна) делятся и образуют зародышеподобные структуры – эмбриоиды, которые могут развиваються в гаплоидные растения. 2. Косвенный (непрямой) андрогенез – репродуктивные клетки дедифферинцируются, делятся и образуют недифферинцированный каллус, в котором после переноса на дифференцирующую среду возможна индукция растении-регенрантов. Часто такие растения бывают разной степени плоидности, что обусловлено невозможностью полного исключения размножения диплоидных клеток соматических тканей пыльника (Шамина, 1981; Маруненко, 1988; Горбунова, 1993; Konieczhy, Czaplicki, 2003).
Установлено, что на частоту каллусо-, эмбриогенеза и регенерацию растений из пыльников и пыльцы, влияют многие факторы, основными из которых являются: генотип растений-доноров, состав культуральных питательных сред, стадия развития пыльцы в момент инокуляции пыльников, предварительная подготовка бутонов, физические условия культивирования и условия внешней среды, в которых произрастали растения-доноры пыльников.
Важным фактором, который обуславливает переключение гаметофитной программы развития микроспор или пыльцевых зерен на спорофитную является генотип исходных растений доноров пыльников (Burbulis, Blinstrubiene, 2009; Круглова и др., 1999; Анапияев, 2002; Муравлев, 2008). Установлено, что не только виды внутри рода, но также сорта одного и того же вида, межвидовые и межсортовые гибриды, как правило, при культивировании in vitro пыльников дают существенные различия по выходу андрогенных новообразований – каллусов, эмбриоидов, растений-регенерантов (Maheshwari et al., 1982; Prakash, Giles, 1987; Атанасов, 1993; Шмыкова, 2006; Гончарова, 2008; Хомякова, 2009).
Еще T. W. Оуянг с соавторами (1983) детально исследовали влияние генотипа на индукцию гаплоидного каллуса и регенерацию растений in vitro. Они показали, что андрогенетический потенциал не зависит от материнской цитоплазмы и определяется большим числом генов. В модельном опыте с использованием двух родительских генотипов пшеницы с различной способностью к регенерации через культуру пыльников была выявлена наследуемость показателей интенсивности каллусообразования, регенерации проростков и зеленых растений. Установлено, что интенсивность регенерации проростков из зеленых растений контролировалась двумя доминантными генами (Wang Yu et al., 2007). Показано наличие эффекта материнского растения и комплементарный характер наследования способности к андрогенезу in vitro мягкой пшеницы (Данилова, 2000). В культуре in vitro пыльников риса степень индукции каллуса варьировала по видам от 0 до 11,8% (Ding-Ye-mei et al., 2003).
По отзывчивости пыльников на культуру in vitro, то есть по их способности образовывать андроклинные структуры (эмбриоиды, каллусы) исследователи, работавшие с яровой мягкой пшеницей, выделили сорта с высокой, средней и низкой отзывчивостью (Плотников, 1994; Анапияев, 2000; Золотов, 2003). Е. В. Белинская (2007) в коллекции ячменя по способности к андрогенезу in vitro выделила 5 групп генотипов. Так же выделены генотипы, как не образующие зеленые растения при культивировании пыльников, так и с высокой способностью к этому процессу (Masoje et al., 1993). В исследованиях, проведенных на целом ряде сельскохозяйственных культур, таких как пшеница (Горбунова, 2000; Данилова, 2000; Круглова и др., 2001; Дьячук и др., 2004; Сельдимирова и др., 2004; Лаврова 2006; Сельдьмирова, Титова, 2008), рис (Bishnoi, 2000), ячмень (Белинская, 2007); просо (Бобков, 2000, 2002), рожь (Flehing-Haus et al., 1995), кукуруза (Сатарова, 2001), огурец (Xie Miao et al., 2005), горох (Бобков, 2008), капуста (Roulund et al., 1990; Rudolf et al., 1999; Грищенко, 2001; Давыдова, 2008) томат и перец (Zagorska et al., 1998, Кучковская, Молканова, 2002), морковь (Тюкавин, 2006), рапс (Ferrie et al., 1995; Муравлев, 2007), люцерна (Асадова, 2005), земляника (Протасова, 2010) показаны значительные различия между генотипами по способности их пыльников к формированию андрогенных новообразований (каллусов, эмбриоидов, регенерантов).
Установлен эффект материнского растения и комплиментарный характер наследования способности к андрогенезу in vitro мягкой пшеницы. Показано, что цитоплазма материнского растения влияет на способность гибрида к андрогенезу in vitro (Данилова, Коновалов 2000). Генотип ячменя сильно влиял на способность пыльников к культуре in vitro, реакция пыльников на культивирование контролировалось доминантным и аддитивным эффектами, второй - был более значим (He Yu-Chi, Ge Ju et al., 2007). Китайские исследователи выделили три типа каллусов, полученных из пыльников земляники (Li Wei-dong, Ge Hui-do et al., 2004). Среди них наиболее ценным был эмбриогенный тип, в котором индуцировали эмбриоиды. Однако данный этап у плодовых растений, в частности яблони, изучен недостаточно. В результате чего нами были изучены факторы, оказывающие влияние на процесс каллусообразования. На результаты культивирования пыльников in vitro влияет стадия развития пыльцы. Иногда этот фактор может быть даже решающим. В основном исследователи культивировали пыльники на трех стадиях развития пыльцы - тетрады, одноядерная и двуядерная. Большинство авторов считают, что лучшей для культивирования in vitro пыльников является одноядерная (сильновакуолизированная микроспора) стадия развития пыльцы. На этой стадии у многих растений показатели эмбрио- и каллусогенеза наиболее высокие (Куксо, 2004; Зарянова, Горбунова, 2005;Тюкавин, Наумова, 2006; Протасова, 2010). Но так же хорошие результаты могут давать пыльники с 2-3 ядерной пыльцой (Шамина, 1981; А. Атанасов, 1993).
Влияние условий формирования пыльников in vivo донорных растений яблони на индукцию андрогенеза in vitro
Процесс индукции новообразований в культуре пыльников колонновидных форм яблони, как показали исследования, в значительной степени зависит от генотипа донорного растения. Однако проведенные исследования и литературные данные свидетельствуют о том, что в общем варьировании данного признака большая роль принадлежит не только генотипу, но и факторам внешней среды в период формирования пыльников, у однолетних растений – периодом выращивания донорных растений. Установлено, что факторы внешней среды влияют на физиологические процессы, которые опосредованно могут способствовать повышению или уменьшению андрогенетической реакции пыльников (Сатарова, Черноусова, 2003). Сведения о влиянии внешней среды и, в частности, погодных условий через донорное растение на андрогенез in vitro не многочисленны и относятся они к однолетним культурам. Исследователями было показано, что на индукцию андрогенных новообразований через донорное растения влияют температурные режимы и сумма осадков в определенные периоды времени (Сатарова, Столяренко, Бондарь 1996; Afele, Kannenberg, Keats et al. 1992).
Анализ полученных данных об активности каллусообразовательного процесса у пыльников колонновидных форм яблони за 2009-2012 гг. показал неодинаковую реакцию генотипов в разные годы. У половины изученных колонновидных форм яблони (I, III, IV, VII) самая высокая каллусогененная активность пыльников (34,2-46,9%) отмечена в 2009 году (табл. 3.2.1)
Эти генотипы, а также формы V и VIII, показали наиболее низкую активность каллусообразовательного процесса (7,6-16,0%) в 2010 году. У формы IV дальнейшее его снижение наблюдалось и в 2011 году. Только у двух генотипов – II и VI - в 2010 году активность каллусогенеза возросла в 1,5 раза и была самой высокой. Однако в 2011 году они показали наименьшую частоту каллусообразования – 5,4 и 10,2% соответственно. В 2012 году этот показатель у колонновидных форм имел более выровненные, чем в предыдущие два года значения, максимально низких показателей не отмечено. Лучшую способность не только восстанавливать, но и повышать андрогенную активность пыльников, после воздействия на донорные растения экстремальными факторами внешней среды показали формы V и VIII, которые в 2011 году вышли на свою самую высокую активность каллусообразования.
Чтобы объяснить полученные результаты, мы проанализировали основные показатели погодных условий с апреля по август 2009-2012 гг., то есть месяцы наиболее активной вегетации плодовых растений: апрель – начало вегетации и закладки генеративных органов, в том числе пыльников; в мае, преимущественно в первой его половине, у яблони проходят основные, завершающие этапы микроспорогенеза, в результате которых образуется одноядерная (микроспоры), двуядерная и полностью сформированная пыльца. Именно в этот период мы собирали бутоны и вводили пыльники в условиях in vitro. Летние месяцы – период наибольшей активности всех физиологических процессов у плодовых растений, которые оказывают основное влияние на их общее состояние, с которым они переходят осенью в период покоя, зимуют, а весной пробуждаются. Для характеристики погодных условий указанных выше месяцев мы взяли три температурных показателя, а также данные по количеству выпавших осадков и относительной влажности воздуха (табл. 3.2.2).
Анализ этих данных показал, что температурные режимы апреля резко не отличались по годам, а по количеству осадков самым влажным был апрель 2012 года. Май и летние месяцы 2010 года по температурным показателям были самыми жаркими, а лето экстремально жарким за все годы наблюдений. Максимальные температурные значения превышали 40С, в то время, как в другие годы этот показатель не превышал 35С. Средняя температура воздуха составила 24,9С, в другие годы она доходила только до 21С. Летний период 2010 года был также самым сухим за все годы исследований. Сумма выпавших осадков составила всего 41 мм, а относительная влажность воздуха 49,0%, в другие годы эти показатели были соответственно 189,2-253,9 мм и 62,3 – 68,0%. Таблица 3.2.2. – Метеоданные за апрель-август 2009-2012 гг.
Сорта яблони восстанавливают свое физиологическое состояние через год после экстремальных погодных условий, косвенным подтверждением этого является повышение каллусогенной активности их пыльников, которое произошло в 2012 году. Среди изученных колонновидных форм яблони следует отметить формы V и VIII, которые сразу после экстремального 2010 года, т.е. уже в 2011 году, показали свою самую высокую активность каллусообразования.
В исследованиях, проведенных в основном на однолетних сельскохозяйственных культурах, было установлено, что эффективность андрогенеза in vitro в значительной степени зависит от стадии развития пыльцы в момент введения пыльников в культуру. Для большинства растений наиболее благоприятной является стадия сильно вакуолизированных микроспор, на которой отмечается эмбрио- и каллусогенез, а иногда и формирование растений (Круглова, Горбунова, Батыгина, 1993; Куксо, 2003; Тюкавин, Наумова, 2006; Шмыкова, 2006; Бобков, 2010). У некоторых культур лучшие результаты дает культивирование пыльников с двуядерной пыльцой (Шамина, 1981; Атанасов, 1993). Такие исследования были впервые проведены на колонновидных слаборослых генотипах яблони.
В исследованиях при изучении влияния на андрогенез in vitro стадии развития пыльцы большое внимание было уделено отбору бутонов, предназначенных для культивирования пыльников. При этом учитывали время сбора, размер бутонов, условия их хранения до инокуляции пыльников, проводился также обязательный цитологический контроль стадии развития пыльцы путем приготовления временных ацетокарминовых препаратов. Было установлено, что бутоны яблони размером 6-8 мм, которые имеют слабо выраженный бело-розовый конус, как правило, содержат микроспоры от средней до поздней вакуолизированных стадий развития .
Наибольшее их количество у всех генотипов отмечено на стадии микроспор и составило от 16,8% (форма VI) до 34,5% (IV). Наименьший выход каллусов получен при культивировании пыльников на стадии тетрад от 7,2% (форма VIII) до 17,2% (IV). Двуядерная стадия развития по этому показателю заняла у всех форм промежуточное положение. Частота каллусообразования на этой стадии колебалась от 14,2 (VI) до 31,3% (IV).
Таким образом, установлено, что культивирование пыльников колонновидных форм яблони следует проводить на стадии микроспор c размером бутонов от 6 до 8 мм.
Известно, что стерилизация бутонов, предназначенных для инокуляции пыльников, может отрицательно сказаться на их дальнейшем поведении в условиях in vitro. В связи с этим, при проведении исследований использовали нестерильные бутоны. Важным преимуществом использования нестерильных бутонов является отсутствие побочного, отрицательного действия стерилизующих факторов на пыльники, а также экономия времени и материальных затрат. Чтобы избежать высокого уровня инфицированности пыльников сбор бутонов проводили в сухую солнечную погоду, не ранее 11 часов утра. Инфицированность пыльников, посеянных из таких бутонов в условиях in vitro, по данным исследований, в большинстве случаев не превышал 10 %, а у некоторых форм в отдельные годы полностью отсутствовала (табл. 3.4.1).
Для форм с генетически высоким уровнем инфицированности, а также в годы, когда в период взятия бутонов влажность воздуха превышает 60%, следует использовать их стерилизацию водным раствором гипохлорита натрия (5-9%) в течение 7-10 минут, а затем промывать в 4-5 сменах стерильной дистиллированной воды и подсушивать на стерильных бумажных фильтрах (Савельев, Жуков, Олейникова, 1990). Основным моментом данного процесса является отрицательное действие стерилизующих факторов на пыльники.
Индукция каллусо- и морфогенеза у различных генотипов яблони
Изучали способность листовых эксплантов колонновидных форм яблони к каллусо- и морфогенезу. В качестве культуральных было испытано 10 вариантов сред по прописи МС с добавлением ауксинов и цитокининов в различных соотношениях и следующих концентрациях: ИУК 0,5-1 мг/л, 2,4-Д 1-2 мг/л, НУК 0,5-1 мг/л, кинетин 0,5-1,5 мг/л, 6-БАП 1-3 мг/л, ИМК 0,5-1 мг/л. Среди них были выделены наиболее продуктивные. Лучшей для индукции и пролиферации каллусной ткани оказалась среда, содержащая ИУК 0,5 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, кинетин 0,5 мг/л, для органогенеза - ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3мг/л.
На среде каллусогенеза листовые экспланты всех изученных генотипов яблони образовали каллусные ткани. Однако интенсивность нарастания каллусной массы была различной (табл. 4.2.1): наибольшая – выше 4 баллов – отмечена у форм III, V, VII, наименьшая (менее 3 баллов) – у форм I, IV, в среднем этот показатель составил 3,6 балла. Таким образом, в результате культивирования листовых эксплантов колонновидных форм яблони у всех генотипов были на среде каллусогенеза индуцированы каллусы, а у форм VII и VIII на среде органогенеза содержащей ИУК 0,7 мг/л, ИМК 0,5 мг/л, 6-БАП 3 мг/л отмечено образование почек и получены регенеранты (форма VII).
Микроклональное размножение – одно из направлений в биотехнологии, которое используется для получения безвирусного посадочного материала, размножения растений, трудно размножаемых традиционными способами. Этот метод позволяет добиваться высоких коэффициентов размножения растений, проводить работы в течение всего года и экономить площади, необходимые для выращивания посадочного материала. Технологии ускоренного микроклонального размножения разработаны достаточно хорошо для многих сельскохозяйственных, плодовых и ягодных растений (Деменко, 2005; Медведева, Поливара, Подорожный, 2011; Райков, 2011; Фролова, 2011). Однако исследования по клональному микроразмножению такой плодовой культуры, как яблоня не так многочисленны (Матушкина, Пронина, 2008). Существующие разработки, как правило, выполнены на определенных генотипах и не всегда дают хороший эффект при использовании их на других формах. Колонновидные формы яблони занимают особое место в ее общем генофонде, так как имеют ряд только им присущих биологических особенностей. Одной из таких особенностей является слабое образование боковых побегов, а в отдельных случаях отмечается даже их отсутствие, это создает трудности в получении достаточного количества посадочного материала при использовании традиционных способов размножения – прививкой и окулировкой. В связи с этим весьма актуальным является разработка метода клонального микроразмножения для данной группы растений. 5.1. Возраст и состояние маточных растений, сроки изоляции апикальных почек и их стерилизация
Возраст исходных маточных растений имеет определенное значение для успешного микроклонадьного размножения. В связи с особенностями развития колонновидных форм яблони (они образуют мало боковых побегов, а значит и почек), почки, предназначенные для микроклонального размножения, брали в тот период, когда растения имели оптимальные размеры, чтобы не нанести ущерб их общему состоянию. Этот возраст составлял 4-5 лет. Растения-доноры были без видимых признаков поражения грибными и вирусными заболеваниями. Имеет значение также время сбора почек. Ряд исследователей считает, что наиболее благоприятным периодом для введения в культуру in vitro яблони является фаза выхода растений из состояния покоя (февраль-март) (Матушкина, Пронина, 2008; Муратова, 2008). Проведенные исследования показали, что для колонновидных форм яблони лучшие результаты дает введение в культуру in vitro меристем из апикальных почек, собранных в период начала вегетации растений. В зависимости от погодных условий этот период приходится на середину или конец апреля, когда происходит естественное набухание и распускание почек. Меристемы из почек, собранных в марте, не дали положительных результатов, как по выходу стерильного материала, так и по способности к дальнейшему развитию.
В культуру in vitro вводили меристематические верхушки размером 0,2-0,4 см, которые изолировали из развивающихся почек, освобождая их от покровных тканей, что обеспечивало достаточно эффективную стерилизацию. В качестве стерилизующего агента использовали 0,1 % раствор ртути (сулемы), было испытано две экспозиции продолжительностью от 40 сек до 1-й мин (табл. 5.1.1). Лучшие результаты по выходу стерильных эксплантов были получены у всех испытанных генотипов при экспозиции 1 мин. В зависимости от конкретного генотипа уровень инфицированности был различен. Наибольший выход стерильных эксплантов отмечен у форм VII (75,0%), VI (65,0%), V (69,6%), наименьший – у IV (46,4%) и I (39,1%).
Введение в культуру in vitro апикальных меристем
Изолированные апикальные меристемы помещали на питательную среду МС, содержащую 0,5 мг/л 6-БАП (0-вой пассаж). Введение в состав питательной среды данного цитокинина снимало апикальное доминирование и стимулировало заложение боковых почек. Регуляторы роста ауксиновой природы не добавляли, так как на данном этапе они негативно влияли на процесс морфогенеза и стимулировали нежелательный каллусогенез. Условия культивирования на этапе введения апексов: t = 23±2оС, 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения 2000-3000 люкс. Анализ полученных результатов показал, что в 0-вом пассаже
Развитие апикальных меристем у формы VII наиболее высокий уровень развития апексов отмечен у формы VII и VIII на среде МС, по показателям образования розеток листьев с зачатками почек (30%) (рис.17,18). Уже на инициальной среде у формы VII были образованы дополнительные побеги-регенеранты, что говорит о хорошем коэффициенте размножения и о дальнейшей работе в селекционной практике с этой формой (рис.19).
Образование дополнительных побегов-регенерантов на инициальной среде 0,5 мг/л 6-БАП у формы VII У других испытанных сортов в основном было отмечено слабое увеличение размера эксплантов и развитие 1-2 примордиев. Из испытанных форм наименьшей морфогенетической способностью характеризовалась IV. Для форм I, II, III, V (рис. 20), следует несколько оптимизировать гормональный состав питательной среды, за счет изменения концентрации экзогенного цитокинина или его сочетания с синтетическими аналогами ауксина.
Цель этого этапа – добиться максимального получения количества побегов от каждого экспланта путем последовательного культивирования уже имеющихся побегов на свежую питательную среду. При решении этого вопроса играют роль сортовые и видовые особенности растений, происхождение экспланта, состав питательной среды. Для регенерации дополнительных побегов плодовых культур используют различные сочетания и концентрации фитогормонов цитокининов и ауксинов (Роньжина, 2003). Установлено, что по скорости получения новых растений метод клонального микроразмножения дает существенные преимущества по сравнению с традиционным способом размножения (Райков, 2012).
На этапе размножения in vitro микропобегов семи генотипов колонновидных форм яблони нами были испытаны питательные среды с тремя различными концентрациями 6-БАП (0,5; 1,0; 2,0 мг/л).
В результате исследований, к концу четвертого месяца размножения микропобегов лучшие результаты по выходу дополнительных побегов у большинства форм кроме IV и V были получены при концентрации 6-БАП 0,5 мг/л (табл. 6.1.1)(рис.21). Самый высокий коэффициент размножения (19,0) был на этой среде у формы VIII. Данная среда оказалась наиболее благоприятной и для формы VII (8,2). Среды с 1 и 2 мг/л 6-БАП для большинства изученных генотипов были менее благоприятны. Только для формы IV среда с 2 мг/л оказалась лучшей (15,5) (рис. 22). Таблица 6.1.1. - Коэффициент размножения микропобегов яблони на средах с различными концентрациями 6-БАП
Размножение микропобегов колонновидной формы яблони IV на среде с 2,0 мг/л 6-БАП. В целом, можно отметить, что реакция инициальных побегов на концентрацию 6-БАП в среде размножения зависит от конкретного генотипа, то есть от его генетических особенностей. Для размножения in vitro форм VIII и VII следует использовать среды с 0,5 мг/л 6-БАП, а для IV – 2 мг/л. Остальные формы оказались мало отзывчивыми на испытанные среды (0,3 – 1,3). Форма V не образовала дополнительных побегов не на одной из испытанных сред. Очевидно, для этих генотипов требуется проведение дополнительных исследований в данном направлении.
Формы IV, VII, VIII, показавшие высокую способность к размножению, в дальнейшем использовались для изучения способности к укоренению in vitro колонновидных форм и слаборослых подвоев яблони. Укоренение микропобегов плодовых культур является следующим важным и трудоемким этапом, от которого зависит успех микроразмножения. Важное значение на этапе ризогенеза отводится регуляторам роста, в первую очередь – ауксинам. Различная их концентрация, тип и способ обработки влияют на процесс укоренения микропобегов в условиях in vitro. Индукцию корнеобразования проводят в основном двумя путями: 1) включение препаратов, в основном ауксиновой группы, способствующих корнеобразованию непосредственно в питательные сред; 2) обработка базальных участков побегов корнеобразующими препаратами с последующим культивированием на средах, свободных от регуляторов роста (Высоцкий, 1998 автореф; Матушкина, Пронина, 2008) Исследователи на этапе укоренения используют ИМК, преимущественно в диапазоне концентраций 0,5 – 2 мг/л (Деменко, 2005; Матушкина, Пронина, 2008; Расторгуев, 2009; Савельев, Олейникова, 2009). На этом этапе, как и на других этапах микроразмножения, следует учитывать и генотипические особенности растений. В исследованиях было изучено влияние различных концентраций ИМК – 0,5 мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л, 3 мг/л на укоренение микропобегов колонновидных форм и слаборослых подвоев, полученных в культуре in vitro из листовых эксплантов и апикальных почек (табл. 7.1).
Появление первых зачатков корней было отмечено в конце четвертой недели культивирования побегов, наиболее активное корнеобразование – на 6-7 недели. Проведенные исследования показали, что у всех изученных генотипов самое активное корнеобразование – от 31,0 до 54,1% - дает присутствие в питательной среде ИМК в концентрации 1 мг/л. Близкие показатели по укоренению (32,8 – 43,8%) получены также при концентрации 0,5 мг/л (рис. 23).
