Содержание к диссертации
Введение
1 .Литературный обзор
1.1. Основные этапы развития пыльника и пыльцы 6
1.2. Мужская стерильность 26
1.3. Факторы, влияющие на гиногенез в культуре неопыленных семяпочек in vitro 35
1.4. Гаметная селекция сельскохозяйственных растений 54
1.5. Факторы, влияющие на андрогенез в культуре
пыльников и микроспор in vitro 58
1.6. Способы регенерации растений 78
Цель и задачи исследований 93
2. Материалы и методы исследований 95
3. Результаты исследований 104
3.1. Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений 104
3.2. Мужская стерильность у овощных растений 153
3.3. Гаметная селекция овощных растений 182
3.4. Культура неопыленных семяпочек лука in vitro 196
3.5. Культивирование пыльников и микроспор
овощных растений in vitro 212
3.6. Клональное микроразмножение овощных растений 257
Выводы 305
Практические рекомендации 308
Список использованной литературы 310
- Основные этапы развития пыльника и пыльцы
- Факторы, влияющие на гиногенез в культуре неопыленных семяпочек in vitro
- Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений
- Гаметная селекция овощных растений
Введение к работе
Репродукция (воспроизводство) растительного материала является центральным вопросом селекции. Генетики, селекционеры и семеноводы используют половую и вегетативную репродукцию на различных этапах селекционного процесса, включая создание исходного материала, отбор, поддержание и размножение перспективного сортолинейного материала или сортов и гибридов сельскохозяйственных растений.
В современной селекции овощных культур сформировалось и получило приоритетное направление создание гибридов F], которые отличаются от сортов высокой урожайностью, выравненностью растений по срокам созревания, размерам и качеству продуктивных органов. Основой селекционного процесса при создании гибридов является выведение родительских линий, в результате скрещивания которых получают гибридные семена. Непрерывность производства таких семян обеспечивается размножением родительских линий. Наиболее сложным звеном в этом процессе является создание родительских линий. Основой для создания родительских линий служит мужская стерильность или самонесовместимость. Ограничением в получении и поддержании таких линий является процесс их размножения. В связи с этим методы культуры тканей приобретают большое значение для построения рациональных систем создания гибридных семян в селекции овощных культур. Важными предпосылками экономически выгодного использования методов культуры тканей являются высокие коэффициенты размножения при сохранении генетической стабильности, а также экономия времени при размножении in vitro, что дает возможность включать их в селекционный процесс.
С другой стороны, репродуктивная фаза жизненного цикла растений представляет своеобразную природную систему «генетической инженерии», в которой новые комбинации генов, собранные в гаметах, проверяются в системах гаметофитного отбора. Затем отселектированные гаметы собираются в новые индивидуальности, представляющие собой предмет для процессов отбора на спорофитном уровне.
Понимание того, как влияют способы репродукции на изменчивость растений, как происходит развитие репродуктивной системы у растений, является основой генетического процесса. Известно, что мейоз растений объединяет воспроизводительные и преобразовательные функции. Ограниченность знаний о репродуктивных особенностях растений - основная причина недостаточного использования процессов гаметогенеза. В естественных условиях отбор мужских гаметофитов представляет собой широко распространенное явление у высших растений.
Исследования репродуктивного цикла растений тормозятся микроскопическими размерами клеток, их расположением и быстрым развитием. Пока предметом коммерции и науки не стали рекомбинация, мужская стерильность, самонесовместимость и апомиксис, технология их изучения отсутствовала. Толчком к усиленному изучению репродуктивных клеток в последние годы послужило то, что, во-первых, они являются превосходной моделью для многих аспектов клеточного развития, то есть целое поколение может изучаться на пыльцевых зернах.
Мужской гаметофит имеет два преимущества перед спорофитным поколением - это микроскопические размеры и гаплоидный генотип. Первые дают возможность в лабораторных условиях проводить исследования, и анализу может быть подвергнуто большое количество генотипов.
Гаплоидное же состояние генома в отличие от диплоидного позволяет обнаружить редкие рецессивные аллели, а получение дигаплоидных растений из микроспор и клеток зародышевого мешка - реализовать гаметоклональную изменчивость в индивидуальные растения.
Основой успешной разработки методов оценки и отбора генотипов на микрогаметофитном уровне является способность пыльцы прорастать и расти на искусственной питательной среде, что дает возможность быстро и эффективно оценить как жизнеспособность пыльцы, так и реакцию мужского гаметофита на стрессовое воздействие.
Вопросы опыления-оплодотворения играют основную роль в практической работе по гибридизации и семеноводству. Успех скрещивания зависит от знания поведения пыльцевых зерен на рыльцах пестиков, закономерности взаимоотношения пыльцевых зерен с секреторной деятельностью рыльца. В селекционной работе большое значение имеет возможность предварительной оценки жизнеспособности пыльцы, используемой в скрещиваниях, особенно в тех случаях, когда растение выращивали в стрессовых условиях (повышенная или пониженная температура, недостаток или избыток влаги и т.д.) и при опылении пыльцой, хранившейся в течение какого- либо промежутка времени. Кроме того, оценка на уровне пыльцы представляет самостоятельный интерес, так как в значительной степени характеризует чувствительность к тому или иному фактору внешней среды самой репродуктивной системы растения.
Таким образом, приведенные аргументы со всей очевидностью показывают, что необходимы научные исследования, направленные на детальное изучение процессов микроспорогенеза, микрогаметогенеза, опыления, андрогенеза, гиногенеза и клонального микроразмножения ценных овощных культур.
Основные этапы развития пыльника и пыльцы
Развитие пыльника может быть разделено на два больших периода (Goldberg et al., 1993). В течение первого периода устанавливается морфология пыльника, происходит дифференцировка клеток и тканей, и материнские клетки (микроспороциты) подвергаются мейозу. В конце его пыльник содержит большинство специализированных клеток, тканей и тетрады микроспор, находящиеся в пыльцевом мешке. В течение второго периода микроспоры дифференцируются, развиваются пыльцевые зерна, пыльник увеличивается в размерах. Ткани его дегенерируют, он раскрывается и происходит выпуск пыльцы. Клеточные процессы, которые регулируют дифференциацию клеток, развитие специализированных пыльниковых тканей и заставляют пыльник переключаться со специфической программы формирования тканей к их деградации и рассеиванию пыльцы, неизвестны. Однако ход событий, ведущих к формированию пыльника и выпуску пыльцы, происходит в точном хронологическом порядке.
Дифференцированный пыльник имеет несколько высокоспециализированных тканей, которые являются ответственными за выполнение нерепродуктивных и репродуктивных функций. Нерепродуктивные ткани включают эпидермис, эндотеций, средний слой, тапетум, связник. Каждая из этих тканей и типов клеток выполняет специализированные задачи. Для примитивных покрытосеменных характерна толстая стенка пыльника (Brandari, 1977). Обычно это связано с тем, что у них много средних слоев. Иногда значительная толщина стенки пыльника обусловлена двухслойным строением тапетума. У продвинутых семейств стенка пыльника достаточно тонкая и содержит всего один средний слой. Как правило, обсуждая строение стенки пыльника, о всех слоях, кроме тапетума, обычно упоминают лишь мимоходом, отмечая наличие или отсутствие фиброзных тяжей в эндотеций и непродолжительность существования среднего слоя (Подцубная - Арнольди, 1976).
Эпидермис. В процессе созревания пыльника наружный слой его стенки может сохраняться без изменений (Brandari, 1977, Davis, 1966). В других случаях эпидермальные клетки могут растягиваться, сжиматься, утрачиваться или полностью сбрасываться (Tames, 1960; Johri and Bhatnagar, 1955;Mathur, 1968), а у некоторых растений (Chelone glabra) вся поверхность пыльника покрыта волосками эпидермального происхождения (Arekal, 1963). В клетках эпидермиса также могут формироваться фиброзные тяжи, аналогичные тяжам эндотеция (Bhandari and Nanda, 1968). Эпидермальные клетки могут быть похожи на клетки тапетума и содержать по два ядра (Karnath et al., 1979). На поверхности клеток эпидермиса возможно развитие кутикулярных фибриллярных выростов (Yoffe, 1965; Bhandari and Khosla, 1982).
Эндотеций - наружный слой стенки микроспорангия, расположенный под эпидермисом. В молодом пыльнике клетки эндотеция мало отличаются от клеток эпидермиса и клеток среднего слоя. В мейотический период у одних, а чаще в постмейотический период у других растений клетки эндотеция значительно увеличиваются, а со стадии первого митоза в пыльцевом зерне в процессе развития пыльника в клетках эндотеция формируются утолщения оболочек, так называемые фиброзные утолщения. Фиброзные ленты начинаются обычно на внутренней тангентальной стенке микроспорангия, поднимаются в направлении наружной тангентальной стенки и заканчиваются поблизости от неё. Иногда они могут охватывать и наружную тангентальную стенку, заключая пыльник в кольцо (Yoffe, 1965). Обзор структурных вариаций фиброзных утолщений приведен в работе А. Имс (Eames, 1960).
Цитоплазма клеток эндотеция в период, предшествующий их старению на стадии зрелых пыльцевых зерен, содержит шероховатый эндоплазматический ретикулум, имеющий вид длинных канатообразных нитей, полисомы и пластиды, в которых иногда обнаруживается крахмал (Bhandari et al, 1981). Чаще всего эндотеций однослойный. Многослойный эндотеций типичен для относительно примитивных семейств. Эндотеций образуется из париентального слоя и не заходит на выступающую часть пыльника. Как правило, в формировании аналогичного ему образования на внутренней стороне пыльника участвует и ткань связника (Bhandari, 1971). У большинства покрытосеменных утолщения стенок эндотеция состоят из целлюлозы (Vasil, 1968). В то же время в утолщениях обнаружены небольшие количества пектина и лигнина (Biddle, 1979). Функция эндотеция состоит в раскрытии пыльника.
Средний слой. Он назван так по расположению между тапетумом и эндотецием и является производным первичного или вторичного париентальных слоев. Число средних слоев в стенке пыльника варьирует от полного отсутствия до 5 - 7.
На ранних стадиях клетки среднего слоя не отличаются от клеток эпидермиса и эндотеция, часто содержат крахмал. В меиотическии период наблюдается уплощение клеток и ядер среднего слоя с последующим их разрушением и лизисом в постмейотический период (Swamy and Krishnamurthy, 1980) или частичным увеличением и разрастанием клеток после деструкции тапетума (Bhandari et al., 1976; Reznickova and Willemse, 1980).
Факторы, влияющие на гиногенез в культуре неопыленных семяпочек in vitro
В современной селекции одной из важнейших задач является быстрое достижение константности селекционного материала. Наиболее остро эта проблема возникает при создании гетерозисных гибридов, для которых требуются гомозиготные линии с высокой комбинационной способностью. Однако последнее качество линий проявляется довольно редко. Например, у кукурузы из приблизительно 100000 инбредных линий практическое применение нашли лишь 60 (Турбин, 1971). Отсюда возникает необходимость в получении большого количества линий, а это в свою очередь заставляет искать пути их ускоренного создания. Обычно линии получают путем длительного инбридинга (5- 10 поколений).
Первые гаплоидные растения дурмана обыкновенного обнаружены в 1921 году (Bergner, 1921), а через три года Блейксли А. и Беллинг Дж. (Blakeslee, Belling, 1924) впервые предложили использовать такие растения в селекции. Ими было отмечено, что гаплоидия дает «.... быстрый метод превращения гетерозиготной формы в чистую линию».
Возможность получения гомозигот из гаплоидов и использование их в селекции известна со времени выделения сорта томата Мэрглоуб (Morrison, 1932). Однако систематическое применение этого метода началось лишь с 1949 года, когда Чейз С.С. (Chase, 1949) использовал его в своей работе с кукурузой. В дальнейшем наибольшее число работ по получению гаплоидов и линий у них было проведено на кукурузе, как за рубежом, так и в нашей стране (Юдин и др., 1966; Чумак, 1977; Комформе, 1985; Тырнов и др., 1994;; Chalyk, 1994)
Было показано, что по комбинационной способности линии, происходящие из гаплоидов, не уступают инбредным (Thomson, 1956). Путем самоопыления практически невозможно достичь гомозиготности у самонесовместимых аллогамных видов и гетерогамных двудомных. Путем диплоидизации гаплоидов можно решить эту проблему (Handelman, Wilberg, 1975).
Однако встречаемость гаплоидов в естественных популяциях очень низкая от 0,1 - 0,01 % (Тырнов, 1998). Гаплоиды могут возникать спонтанно в результате апомиксиса или партеногенеза при отдаленных скрещиваниях ячменя и пшеницы (Subrahmanyam, Kasha, 1973; Barclay, 1975; Laurie, Bennett, 1990). Опыление пыльцой гаплопродюсера часто используется для индукции апомиксиса in situ (Bohanes et al., 1994; Bordes et al., 1997). Для того, чтобы усилить процесс апомиксиса, применяются обработка растений ионизирующим излучением, химическими веществами, повышенными температурами, опыление облученной пыльцой, но, несмотря на это, выход спонтанных гаплоидов остается низким (Chalak, Legave, 1997; Musial, Przywara, 1998).
Положение изменилось с появлением экспериментальной гаплоидии in vitro. Источником получения гаплоидных каллусных тканей или эмбриоидов стали при этом либо микроспоры, либо клетки зародышевого мешка при культивировании соответственно пыльников или семяпочек на питательных средах.
Гаплоиды различаются по своим генетическим и цитологическим процессам образования. В связи с этим в литературе имеются некоторые разногласия по классификации и терминологии гаплоидов. Саратовская школа предлагает следующую классификацию (Тырнов, 1998).
1. Матроклинные - развивающиеся из клеток женской половой сферы (зародышевого мешка) и имеющие ядро и цитоплазму от одной особи.
2. Андрогенные - развивающиеся из клеток женской половой сферы, у которых собственные хромосомы замещены хромосомами спермия и, следовательно, имеющие цитоплазму от одной особи, а ядро от другой.
3. Андроклинные - развивающиеся из пыльцевых зерен; этот тип получают в культуре пыльников или микроспор.
Однако как в отечественных, так и зарубежных работах чаще всего используется другая терминология.
Андрогенез - получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор. Гиногенез - получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек.
Партеногенез - получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.
Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений
Пыльник представляет собой целостную интегрированную систему, в которой все процессы направлены на развитие мужского гаметофита, являющегося непосредственным объектом селекции. Знание закономерностей развития мужского гаметофита служит основой для понимания проявления стерильности у растений, создания методов, ускоряющих селекционный процесс, и способствующих увеличению генетического разнообразия исходного материала.
Проводимые нами исследования направлены на изучение особенностей развития пыльников и образование фертильной пыльцы у целого ряда овощных культур таких, как капуста, редис, дайкон (семейство капустные), морковь (семейство сельдерейные), лук (семейство луковые), томаты, перец (семейство пасленовые), огурец (семейство тыквенные), спаржа (семейство спаржевые).
Строение пыльника. Пыльник у растений рода Brassica четырехгнездный, состоит из четырех микроспорангиев (гнезд или пыльцевых мешков), в полости которых формируется пыльца (рис.1). Гнезда попарно объединены в две теки. Стенки пыльцевого гнезда развиваются по однодольному типу.
Стенки пыльника капусты к концу первого периода развития состоят из эпидермиса, эндотеция, клеток среднего слоя и тапетума секреторного типа. На ранних стадиях микроспорогенеза клетки эндотеция и среднего слоя мало дифференцированы (рис. 2). Ядра в клетках центрально расположены, вакуоли мелкие, оболочки не имеют утолщений. Наиболее дифференцированными являются клетки тапетума, они интенсивно окрашиваются ацетокармином, сильно вытянуты в радиальном направлении. По мере развития микроспор и пыльцевых зерен происходит дальнейшая дифференциация тканей с последующей их деградацией (рис.3). Ядра занимают пристеночное положение, у клеток эндотеция формируются фиброзные утолщения, клетки среднего слоя уплощаются, клетки тапетума резорбируются. На момент растрескивания пыльника стенки его состоят из эпидермиса и эндотеция.
При неблагоприятных условиях среды, у капусты брокколи можно наблюдать аномальное развитие пыльников. Это образование микроспорангиев на плодолистиках, лепестках и остановка развития тычинок (рис.4).
Микроспорогенез и микрогаметогенез. Мейоз в микроспороцитах происходит тогда, когда длина бутонов достигает 2 мм. Первое и второе деления мейоза протекают, как правило, нормально, в результате чего формируется тетрада (рис. 5 а). Микроспоры располагаются изобилатерально или тетраэдрально. Мейоз происходит по симультанному типу.
Микроспоры, образовавшиеся сразу после распада тетрад, имеют ядро, расположенное в центре клетки, плотную цитоплазму, тонкую оболочку. По мере роста они приобретают наиболее характерную форму. До первого митоза форма микроспор у капусты трехлопастная (рис. 5 б - г). Приобретение характерной формы связано с синтезом клеточной стенки. Стенки зрелой пыльцы имеет два слоя, внешний - экзину и внутренний - интину. Интина в значительной степени состоит из пектоцеллюлозы, а экзина - из спорополленина, вещества очень стойкого к разрушению (Brooks, Shaw, 1978; Bediger, 1992).
Для следующего этапа характерно появление крупной вакуоли (рис.5 в, г) и смещение ядра от центра к стенке. Оно занимает пристеночную позицию, максимально удаленную от поры (рис.5 д). Это поздняя стадия развития микроспоры. На этом этапе она завершает свое существование и вступает в ассиметричный митоз, в результате которого образуется новая структура - пыльцевое зерно. Оно состоит из вегетативной и генеративной клеток (рис.5 е). Вскоре после первого митоза генеративная клетка перемещается в центр пыльцевого зерна, где она подвергается следующему митотическому делению с образованием двух спермиев (рис. 5 ж). Зрелая пыльца у капусты трехклеточная. За этот промежуток времени диаметр пыльцевого зерна увеличивается почти в 1,7 раза. Однако незадолго до растрескивания пыльника объем пыльцы уменьшается, происходит её дегидратация.
Гаметная селекция овощных растений
Метод гаметной селекции включает в себя несколько этапов: выбор селектирующего фактора и методики оценки его воздействия, подбор дифференцирующей концентрации, позволяющей отселектировать пыльцевые зерна с устойчивым генотипом и, наконец, непосредственно сам селекционный процесс.
Исследование устойчивости различных сортов лука к бактериозу, вызываемому бактериями Erwinia carotovora, проводили по нескольким схемам.
Первая - изучение влияния условий выращивания лука репчатого на образование жизнеспособной пыльцы (табл.16).
Сравнивалась пыльца растений выращенных на инфекционном фоне и открытом грунте без инфекционной нагрузки. Учитывалось количество проросшей пыльцы, из них процент пыльцевых зерен с нормальной и деформированной пыльцевой трубкой. У лука были следующие типы деформации пыльцевой трубки: заканчивающиеся пузыревидным или шаровидным образованиями, лопастной формы (удлиненной или укороченной) и в виде шарика. Иногда наблюдались гигантские, длинные тонкие пыльцевые трубки, длина трубки превышала диаметр зерна в 20 - 25 раз, в отдельных случаях 40 раз.
Из таблицы 16 видно, что на прорастание пыльцы в большей степени влияют условия внешней среды, чем сам инфекционный фон, поэтому в следующей серии опытов изучалось непосредственное влияние бактерий на способность пыльцевых зерен прорастать. В связи с тем, что на формирование жизнеспособной пыльцы сильное влияние оказывают абиотические факторы и трудно создать одинаковые условия для контрольных и опытных растений в естественных условиях, нами использовалась следующая серия опытов.
Цветоносы срезали в начале цветения и переносили в лабораторию, где контрольные растения помещали в емкость с водой, а опытные в суспензию бактерий с плотностью 10+7и 10+6. Через сутки на опытных цветоносах появились некрозы 5,5 см высотой при плотности 10+? и 0,5 - 0,7 см при плотности 10+6. При оценке пыльцы на жизнеспособность достоверных отличий не было выявлено: контроль -72%, опыт 1 - 74%. опыт 2 - 68%, поэтому цветоносы были оставлены в растворах ещё на 5 суток. При следующем просмотре препаратов пыльцы, окрашенной аце-токармином, были обнаружены единичные пыльцевые зерна с двумя одинаковыми ядрами. Такие нарушения мы наблюдали у растений после обработки их низкими температурами или раствором 2,4 Д, то есть проявились отклонения в цикле развития микроспор. Попытка укоротить цветоносы и сделать соцветия более доступными для бактерий и продуктов их жизнедеятельности были безуспешными, поэтому нами была выбрана третья схема опытов по оценке устойчивости мужского гаметофита у различных сортов лука репчатого.
Для определения наличия реакции у пыльцы лука репчатого использовали непосредственный контакт её с суспензией трехсуточной культуры Erwinia caroto-vora в концентрации 10t7 клеток. Эта концентрация полностью подавляла способность пыльцы к прорастанию. Для дифференциации пыльцы по устойчивости к воздействию бактерий использовали ряд разведений: исходная суспензия (10+7); 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; дистиллированная вода. Полученную суспензию наносили на поверхность питательной среды с только что посеянной на нее пыльцой. В контроле капали дистиллированную воду. Через два часа препарат фиксировали дифференцирующим красителем, в состав которого входит фенол, подавляющий дальнейшее развитие бактерий, и подсчитывали число проросших пыльцевых зерен (табл. 17). У различных образцов наблюдалась зависимость изменения жизнеспособности пыльцы от бактериальной нагрузки: чем выше концентрация бактерий в суспензии, тем меньше число проросших микроспор. По характеру этих изменений сорта можно разделить на устойчивые и восприимчивые. К устойчивым сортам относятся Штуттгартер ризен, Одинцовец, последний отличается большой гетерогенностью, к восприимчивым - Даниловский 301 и Стригуновский. Полученные нами результаты являются обнадеживающими, так как при соответствующем подборе селектирующего фактора (ферменты или токсины) можно выделить наиболее устойчивые генотипы к бактериальной инфекции и наиболее успешно использовать его в гетерогенной популяции.
