Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перспективы использования цитологических методов и культуры изолированных клеток, тканей и органов в селекционной практике 12
1.1. Роль отдаленной гибридизации в создании биоразнообразия растений 12
1.2. Цитоэмбриологические методы в решении проблем повышения эффективности отдаленной гибридизации 23
1.3. Развитие и становление методов клеточных и тканевых культур растений 35
1.4. Клеточные технологии в решении селекционных проблем 57
Глава 2. Цель, задачи, объекты и методика проведения исследований 70
2.1. Цель и задачи 70
2.2. Объекты исследований 71
2.3. Методика проведения исследований 77
Глава 3 Повышение эффективности отдаленной гибридизации на основе цитоэмбриологических методов 90
3.1. Уровень плоидности гибридного потомства при инконгруэнтных скрещиваниях представителей рода Prunus Mill 90
3.2.Сравнительная оценка развития женской генеративной сферы аллополип-лоидов сливы (диплоид х тетраплоид) и их исходных форм 99
3.3.Сравнительная оценка развития женской генеративной сферы аллополип-лоидов сливы (диплоид х гексаплоид) и их исходных форм 114
3.4.Анализ прогаммной фазы оплодотворения аллополиплоидов сливы (диплоид х тетраплоид) при интрогрессивной гибридизации 130
3.5. Анализ прогаммной фазы оплодотворения аллополиплоидов сливы (диплоид х гексаплоид) при интрогрессивной гибридизации 142
Глава 4. Метод эмбриокультуры в повышении эффективности селекци онного процесса некоторых плодовых растений 156
4.1. Культура изолированных зародышей в получении сеянцев отдаленных гибридов сливы разной степени стерильности 156
4.2.Влияние физиологически активных веществ на развитие зародышей яблони в культуре in vitro 177
Глава 5. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции земляники 190
5.1. Индукция и культивирование каллусной ткани, анатомические и ультраструктурные особенности клеток каллуса 191
5.2. Морфогенез адвентивных побегов из каллуса 199
5.3. Регенерация придаточных побегов непосредственно из исходных экспл антов 212
5.4. Тиражирование и укоренение побегов, полученных в культуре каллусных и листовых тканей 224
5.4.1. Оптимизация приемов технологии ускоренного размножения земляники in vitro 229
5.5.Анализ изменчивости растений-регенерантов 239
Глава 6. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции малины 248
6.1. Клональное микроразмножение сортов-доноров, источников эксплантов 249
6.2. Индукция и культивирование каллусной ткани, цитогенетические особенности клеток каллуса 253
6.3. Морфогенез в культуре каллусной ткани 258
6.4. Регенерация растений непосредственно из исходных эксплантов 269
6.5.Селекция тканевых культур, резистентных к солевому стрессу 276
Глава 7. Оценка экономической эффективности выращивания рассады земляники с использованием клонального микроразмножения 285
Выводы 289
Рекомендации для практической селекции 293
Список используемой литературы 295
- Развитие и становление методов клеточных и тканевых культур растений
- Уровень плоидности гибридного потомства при инконгруэнтных скрещиваниях представителей рода Prunus Mill
- Анализ прогаммной фазы оплодотворения аллополиплоидов сливы (диплоид х гексаплоид) при интрогрессивной гибридизации
- Тиражирование и укоренение побегов, полученных в культуре каллусных и листовых тканей
Введение к работе
Быстрые темпы роста населения Земного шара вызывают необходимость значительного увеличения производства продуктов питания, учитывая при этом, что в настоящее время в мире насчитывается примерно 1,5 млрд. голодающих людей. Известно, что около 93 % пищи человека составляют продукты растениеводческих отраслей, одной из которых является садоводство. Для решения проблемы продовольственной безопасности стран необходимо существенное повышение урожайности и улучшение качества основных сельскохозяйственных растений, в том числе, плодовых и ягодных культур.
В современных условиях ухудшающейся экологической обстановки возникает другая проблема - качественное, рациональное питание человека, обеспечивающее его здоровье и долголетие. Рацион человека должен в обязательном порядке содержать в необходимом количестве биологически активные природные вещества антиоксидантного действия, повышающие устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды и, как следствие, сдерживающие старение организма и поражение его болезнями (Гудковский,2000).
В связи с этим, плоды и ягоды садовых растений являются наиболее ценными и незаменимыми источниками витаминов, органических кислот, легкоусвояемых Сахаров, макро- и микроэлементов и других биологически активных веществ, которые обладают профилактическими и лечебными свойствами. По разработанным медицинским нормам годовая потребность человека в плодах и ягодах в нашей стране должна составлять 100-120кг, фактически производится лишь 18-20кг, что явно недостаточно для нормальной жизнедеятельности организма.
Интенсификация садоводства, направленная на увеличение производства высококачественных плодов и ягод, предъявляет высокие требования к сортовому составу. Сорта должны обладать совокупностью устойчивых хозяйственно ценных признаков. Меж тем, все возрастающая неста-
бильность климата приводит к тому, что существующий набор сортов нуждается в значительном пополнении или даже замене. Важная роль в совершенствовании сортимента, а следовательно, и в повышении продуктивности и экономической эффективности плодовых насаждений отводится селекционному улучшению сортов. Прирост урожайности у сортов за счет селекции может достичь 30-70% и роль этого фактора, в частности, в садоводстве, будет постоянно возрастать в связи с инерционностью сортового состава, необходимостью перехода к низкозатратным, экологически безопасным технологиям (Жученко, 2001).
К настоящему времени селекционерами достигнуты определенные успехи по созданию новых высокопродуктивных сортов плодовых и ягодных культур. Вместе с тем, не все из существующих сортов в полной мере отвечают возрастающим современным требованиям. Попытки улучшить сортимент на основе внутривидовой гибридизации не всегда приводят к желаемым результатам.
В решении задач по выведению высокопродуктивных, скороплодных сортов плодовых растений, с высоким потенциалом адаптации к экстремальным факторам внешней среды и ценным биохимическим составом плодов важное место принадлежит отдаленной гибридизации. По мнению Н.И. Вавилова (1960) Н.В. Цицина (1978) и других ученых, в методе отдаленной гибридизации заложены огромные потенциальные возможности, которые позволяют решать теоретические, прикладные и методические вопросы селекции и создания на базе этого новых хозяйственно ценных форм и сортов, более полно удовлетворяющих запросы производства.
И.В. Мичурин (1948) придавал важное значение межвидовым и межродовым скрещиваниям, как эффективным и действенным приемам в создании « ...совершенно новых видов плодовых растений с еще небывалыми формами и свойствами ». Метод отдаленной гибридизации позволяет конструировать новые генотипы, объединяющие наследственные факторы разных видов и родов, что способствует получению ценного исходного материала для целей селекции.
В исследованиях по отдаленной гибридизации используют конгруэнтные и инконгруэнтные скрещивания. В первом случае родительские формы имеют совместимые наборы хромосом и первое гибридное поколение обычно фертильное и нормально жизнеспособное. Во втором случае компоненты скрещивания имеют несоответствующие хромосомные наборы или разное их число. Это приводит к трудности получения гибридных семян. Однако инконгруэнтные скрещивания открывают широкие перспективы в создании видов, не существующих в природе и, видимо, не возникающих в естественных условиях.
В мейозе гибридов вследствие несоответствия геномов скрещиваемых видов, нарушается образование бивалентов, ведущее к частичной или полной стерильности. Различная степень выраженной стерильности гибридных сеянцев создает трудности получения последующих поколений для выяснения характера наследования признаков и проведения отбора.
Степень семенной продуктивности определяется состоянием женской генеративной сферы растения. Анализ состояния женских гаметофи-тов отдаленных гибридов в момент наступления цветения и сроков их формирования позволяет определить наиболее оптимальный период опыления гибридных форм. Аномалии в развитии зародышевых мешков в конечном итоге приводят к нарушению процессов оплодотворения и снижают семенную продуктивность гибридов. Изучение развития женской генеративной сферы, прогамной фазы оплодотворения, тесно связанных с функцией размножения растений, важно для повышения эффективности проведения селекционных работ. Выяснение причин стерильности аллопо-липлоидов может быть осуществлено посредством метода цитоэмбриоло-гического анализа.
Цитоэмбриологическая оценка нарушений формирования женской генеративной сферы отдаленных гибридов позволяет выявить степень стерильности конкретных гибридных форм и на основании этого более грамотно подойти к использованию их в селекции и наметить пути преодоления этого нежелательного явления. Вместе с тем наши сведения по цито-
эмбриологическому изучению отдаленных гибридов плодовых культур весьма ограничены, что свидетельствует об их важности и актуальности в решении прикладных и методических проблем отдаленной гибридизации.
Процесс создания сортов традиционными методами довольно длительный. Так, на получение нового сорта малины с учетом всех этапов его формирования требуется 10-12 лет (Казаков, 2004), косточковых культур -20 и более лет, при отдаленной гибридизации эти сроки еще увеличиваются.
В настоящее время для совершенствования традиционного селекционного процесса, в том чиле отдаленной гибридизации, важное значение приобретает использование высоких технологий, которые основаны на культивировании в системе in vitro клеток, тканей и органов растений и направленных на сокращение сроков создания ценных генотипов. Клеточные технологии в селекционной работе можно разделить на две группы: 1) облегчающие и ускоряющие традиционный процесс; 2) создающие генетическое разнообразие и скрининг генотипов с ценными признаками (Бутен-ко, 1986).
Важнейшими методами клеточной инженерии в получении нового исходного селекционного материала являются: эмбриокультура, индукция сомаклональных вариантов, тканевая селекция на устойчивость к срессо-рам, клональное микроразмножение отобранных в ходе селекции особо ценных элитных форм и др.
С помощью культуры зародышей можно существенно повысить эффективность инконгруэнтных скрещиваний. Культивирование незрелых зародышей используется в том случае, когда невозможно, в силу указанных причин, получить определенную комбинацию признаков в одном генотипе традиционными методами селекции. В ряде случаев возникает необходимость получения F2 отдаленных гибридов, формирующих маложизнеспособные семена, которые в обычных условиях не прорастают. Поэтому для повышения выхода сеянцев целесообразно выращивать зародыши в системе in vitro. Вызывает интерес возможность тиражирования и сохра-
нения ценных генотипов за счет получения от каждого зародыша нескольких дополнительных побегов, что особенно важно в работе по отдаленной гибридизации. Однако ряд методических вопросов практического выращивания сеянцев в культуре изолированных зародышей плодовых растений разработан ещё недостаточно. По сравнению с обычными приемами получения сеянцев эмбриокультура снижает риск потери селекционно-ценных генотипов, т.к. процесс их выращивания протекает в контролируемых условиях.
При культивировании соматических тканей в условиях in vitro можно получать растения - сомаклоны, которые отличаются определенными фено- и генотипическими признаками от исходных форм. В сомаклональ-ных вариантах наблюдается изменение не только моногенных, но и полигенных признаков. Было установлено, что использование сомаклонов может в два раза ускорить процесс создания нового сорта (Evans et al., 1984).
Метод тканевой селекции позволяет целенаправленно проводить в жестких селективных условиях скрининг стабильных каллусных линий, а затем и растений — регенерантов с повышенной резистентностью к конкретным абиотическим и биотическим стрессорам.
Клональное микроразмножение аналогично вегетативному способу размножения и различается лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro, где из эксплантов определенного типа можно ускоренно получать достаточно большое количество растений, идентичных исходному экземпляру. Хотя технология ускоренного размножения многих растений разработана достаточно хорошо, сведения отностительно техники кло-нального микроразмножения важных плодовых и ягодных культур далеко не полны. Поэтому этот прием имеет тенденцию к усовершенствованию отдельных этапов применительно к конкретным генотипам.
Несмотря на несомненную перспективность клеточных технологий, главная проблема, возникающая при практическом использовании культуры изолированных тканей и органов в селекционном процессе, заключается в разработке эффективных приемов надежного получения растений-
регенерантов из эксплантов различного происхождения. Изучению этого вопроса посвящен ряд работ отечественных и зарубежных авторов, что свидетельствует о большом значении проблемы регенерации для всей методологии культуры ткани, без решения которой становятся бесполезными исследования по культивированию тканей и органов in vitro для целей селекции. Способы индукции морфогенеза растений универсальны лишь только в общих закономерностях, поэтому хорошо разработанная система регенерации для конкретного генотипа не всегда подходит для других клонов данного вида и тем более представителей других видов.
На реализацию морфогенетического потенциала клеток и тканей оказывают влияние ряд факторов - внешние (химический и гормональный баланс питательной среды, физические условия культивирования) и внутренние (генотип растения- донора, его возраст, тип и физиологическое состояние экспланта). Все это необходимо учитывать при поиске оптимальных условий регенерации растений из соматических тканей при разработке базовых технологий. Однако сложность данной проблемы заключается в том, что морфогенетические потенции многолетних плодовых растений намного слабее по сравнению с однолетними культурами и поэтому труднее индуцировать регенераты из изолированных тканей. Отсюда и небольшое количество работ по плодовым культурам, что свидетельствует об актуальности решения проблемы. Совершенствование приемов стабильного получения растений-регенерантов позволит шире использовать методы культуры изолированных тканей и органов в создании исходного материала для селекции плодовых и ягодных растений.
Научная новизна исследований. Результаты исследований позволили расширить знания по биологии цветения и размножения отдаленных гибридов рода Prunus Mill. Выявлена степень стерильности женской генеративной сферы в связи с уровнем плоидности отдаленных гибридов сливы. Установлены сроки формирования зародышевых мешков, что дает возможность определить оптимальный период опыления. Проведена классификация основных структурных изменений в строении и развитии женской
генеративной сферы разнохромосомных гибридов. Методом люминесцентной микроскопии выявлена степень совместимости конкретных форм при интрогрессивной гибридизации. Показана целесообразность использования метода культуры зародышей для преодоления в разной степени выраженного бесплодия и повышения выхода сеянцев отдаленных гибридов сливы. Предложен оригинальный способ, позволяющий получать от каждого зародыша яблони по несколько идентичных растений. Методом электронной микроскопии проведено детальное изучение особенностей клеток каллуса и установлен тип морфогенеза in vitro (земляника). Выявлена вариабельность кариотипов каллусных клеток на примере малины. Разработаны и усовершенствованы приемы регенерации в культуре каллусных и листовых тканей земляники и малины. Показано, что морфогенный эффект цитокинина более активно реализуется при взаимодействии с конкретными регуляторами роста ауксиновой природы. Выявлена положительная динамика влияния контрастных температур и увеличения осмотического давления среды на регенерацию и ризогенез побегов. Показана эффективность двухэтапного получения побегов путем последовательного изменения условий культивирования эксплантов. Изучено влияние составов питательных сред, исходных концентраций источников азота, продолжительности периода освещения на коэффициент размножения и затемнения среды на формирование корневой системы регенерантов земляники. Установлена степень изменчивости регенерантов земляники, полученных в культуре каллусных и листовых тканей и разработаны методические вопросы, позволяющие провести скрининг каллусных линий малины резистентных к солевому стрессору.
Практическая значимость исследований. Впервые получено 52 сеянца F2 отдаленных гибридов, обладающих отдельными ценными признаками разных видов рода Prunus Mill, что способствует расширению генофонда сливы для выполнения селекционных программ. Результаты законченных исследований вошли в: «Методические рекомендации по применению искусственной культуры тканей и органов в генетико-
селекционной работе с плодовыми» (Мичуринск, 1987), «Методические рекомендации по применению цитологических методов в плодоводстве» (Москва, ВАСХНИЛ, 1988), «Программу и методику селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (Орел, 1995), рекомендации по «Индукции морфогенеза и тканевой селекции плодовых и ягодных культур» (Мичуринск, 1996). Разработан способ (А.С. №1045862), повышающий точность и упрощающий процедуру определения морозоустойчивости растений яблони. Заложена маточная плантация суперэлитным посадочным материалом перспективных сортов земляники на площади 0,1га (учхоз «Роща» МичГАУ). Результаты методических разработок используются при проведении работ в научно-исследовательских учреждениях по садоводству, в учебном процессе высших учебных заведений при подготовке специалистов по направлению агрономия, что подтверждено справками о внедрении.
Положения выносимые на защиту:
цитоэмбриологические особенности отдаленных гибридов разного уровня плоидности и прогамной фазы оплодотворения при интрогрес-сивной гибридизации;
способы повышения выхода сеянцев с использованием культуры изолированных зародышей;
приемы регенерации растений в системе in vitro (культура изолированных апексов, каллусов, листовых эксплантов);
изменчивость регенерантов в культуре каллусов и листовых дисков и тканевая селекция на устойчивость к засолению;
модель использования методов культуры тканей и органов для целей селекции.
Развитие и становление методов клеточных и тканевых культур растений
По данным А. Атанасова (1988), около 93% пищи человека составляют продукты растениеводства, а остальные - животноводства. Продукты животного происхождения также получают вследствие употребления животными растений. Быстрый рост населения Земного шара, и особенно в странах Азии и Африки, приводит к необходимости увеличения производства продуктов питания. Известно, что в настоящее время в мире насчитывается около 1,5 млрд голодающих людей. Поэтому проблема питания -одна из первоочередных проблем человечества, требующая скорейшего решения. Из этого следует, что повышение продуктивности растениеводства — необходимое условие увеличения производства продовольствия.
Для решения проблемы продовольственной безопасности стран необходимо существенное повышение урожая и улучшение качества основных сельскохозяйственных культур. Во второй половине XX столетия улучшение важнейших культурных растений как по урожайности, так и по качеству стремились решать за счет химизации, мелиорации и механизации сельскохозяйственного производства. Это в свою очередь привело к загрязнению окружающей среды, засолению и эрозии почв, уплотнению и нарушению структуры пахотного слоя, удорожанию единицы продукции и др.
Важная роль в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений и особенно в условиях изменяющегося климата, ухудшающейся экологической обстановки принадлежит селекционному улучшению сортов. Как отмечают Y.Straub (1978), А.А. Жученко (2001), прирост урожайности у сортов за счет селекции оценивается в 30-70%. Однако, про цесс создания принципиально новых сортов традиционными методами довольно длительный, и результатов приходится ждать не один год. Вместе с тем, улучшение важнейших сельскохозяйственных культур с использованием только классических методов селекции и генетики в ряде случаев не приносит должного эффекта.
B.C. Шевелуха (2003) отмечает, что попытки селекционеров создать комплексно устойчивые и урожайные сорта и гибриды с помощью этих методов не привели к желаемым результатам. Использование трансгрессивной селекции, основанной на отдаленной гибридизации, дало возможность решить ряд частных проблем повышения продуктивности культурных растений, в том числе устойчивости к стрессовым факторам окружающей среды. Поэтому крайне важен поиск новых, эффективных направлений, которые в перспективе позволили бы не только повысить урожай и качество культурных растений, но и были бы низкозатратными, экологически безопасными для растениеводства. В настоящее время одним из таких подходов является сельскохозяйственная биотехнология.
В растениеводстве до недавнего времени наблюдалось определенное отставание в использовании достижений биотехнологии. В последние годы, благодаря появлению новых методов, это направление стало одним из наиболее быстроразвивающихся, и во многих странах мира сельскохозяйственной биотехнологии придается первостепенное значение. Особенно перспективным для растениеводства представляется возможность получения высокопродуктивных генотипов растений с улучшенными показателями качества продукции и устойчивости к действию неблагоприятных абиотических и биотических стрессоров.
Не так давно большие надежды в решении проблемы производства продуктов питания для всего населения связывали с так называемой «зеленой революцией» (Харченко, Глазко, 2006). Однако сейчас этот энтузиазм переносится в область использования современных биотехнологических методов, что позволяет некоторым ученым говорить о второй «зеленой ре волюции». И это особенно актуально сейчас, в XXI столетии, когда человечество вступило в эру биологии (Жученко, 2006).
В отличие от клеток животных, растительные клетки обладают значительным преимуществом — способностью в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целые растения, что связано с явлением тотипотентности. В связи с этим одним из основных направлений сельскохозяйственной биотехнологии является клеточная инженерия растений, которая возникла в 50-е годы прошлого века. В основе клеточной инженерии лежит метод культивирования клеток, тканей и органов растений. Под этим методом принято понимать выращивание in vitro изолированных клеток, различных тканей, частей и органов растительного происхождения в стерильных, строго контролируемых условиях. Метод культуры клеток и тканей был разработан в сравнительно короткое время и теперь интенсивно развивается и внедряется в различные отрасли науки и практики. По общему мнению специалистов, вклад достижений клеточной инженерии в развитие современного растениеводства, которое немыслимо без поступательного развития селекции, с каждым годом все возрастает, что отражено в ряде научных статей и монографий (Morel, 1959; Cocking, 1960; Jones, 1973; Jones, 1974; Boxus, 1974, 1977; Бутенко, 1979, 1986, 1990; Lane, 1979; Рингерц, Сэвидж, 179; Лейке и др., 1980; Ницше, Венцель, 1980; Овчинников, 1982; Evans et al., 1984; Шевелуха, 1986, 1993, 2003; Брайт и др., 1987; Джонс, 1987; Хасси, 1987; Атанасов, 1988; Артамонов, 1989; Картель, 1989; Трофинец, 1991; Высоцкий, 2000; Жученко, 2006 и др.).
Наиболее ранними работами, в которых сделаны первые попытки выращивать изолированные от растения ткани, были исследования, проведенные немецкими учеными Н. Vochting, С. Rechinger, G. Haberlandt в период с 1892 по 1902 годы.
Н. Vochting делил растения на все более и более мелкие части и культивировал их в растворе сахарозы с целью изучения явления полярности. Он показал, что полярность - это свойство, которое присуще каждому фрагменту ткани (независимо от его размера), а следовательно, и отдельным клеткам растений.
Первым экспериментатором, поставившим опыты по определению «минимального предела» делимости растительных тканей, был C.Rechinger. Он помещал сегменты стеблей ясеня и тополя, корней свеклы и турнепса не на питательную среду, а на поверхность влажного песка, т.е. без соблюдений условий асептики. Автор пришел к заключению, что ткани размером менее 20мм иногда были способны продуцировать каллус и даже почки. С уменьшением толщины среза эта способность падала, и экс-планты тоньше 1,5мм не росли.
Уровень плоидности гибридного потомства при инконгруэнтных скрещиваниях представителей рода Prunus Mill
Цитологическими исследованиями рода Prunus Mill, проведенными F. Kobel (1927), С.Д. Darlington (1928, 1930), Н.В. Ковалевым, К.Ф. Костиной (1935) и рядом других авторов, установлен полиплоидный ряд видов, включающих диплоиды 2п (2х) =16, тетраплоиды 2п (4х) = 32 и гексаплои-ды 2п (6х)=48 с основным числом хромосом - х=8.
При цитологическом изучении отдаленных гибридов сливы, полученных в результате скрещивания между представителями различных видов и родов подсемейства Prunoideae Fock, рядом исследователей (Olden, 1955; Туровцева, 1965, 1968; Еникеев, Младенцева, 1966; Salesses, 1967 и др.) обнаружен большой размах генетической изменчивости, где встречаются гибриды с различным уровнем плоидности.
В исследованиях А.Г. Туровцевой среди гибридных сеянцев найден полиплоидный ряд представителей рода Prunus Mill от 2п (2х) =16 до 2п (6х) = 48, причем некоторые из них анеуплоиды (2п=23-46).
Э.Г. Рассветаева (1970), Г.В.Еремин и др. (1973) в своих работах показали, что фертильность межвидовых гибридов тесно связана с плоидно-стью. По данным Э.Г. Рассветаевой, триплоидные гибриды имеют больше нарушений в процессах микро- и макроспорогенеза, чем тетраплоидные формы и, отсюда меньшую плодовитость. Также замечено, что у гибридов с высоким уровнем плоидности (4х и выше), аномалии в ходе формирования гамет не так гибельны, поэтому эти формы более плодовиты (Еремин, 1977). А.Г. Туровцевой (1968) установлено, что к наиболее фертильным формам сливы относятся гексаплоидные (6х) и тетраплоидные (4х) межвидовые гибриды, к наименее плодовитым - триплоидные (Зх). Это объясняется тем, что триплоиды, имеющие нечетный набор хромосом, являются несбалансированными полиплоидами, поэтому у них отмечается неполная конъюгация хромосом в мейозе, что приводит к стерильности (Уильяме, 1968).
Из этого следует, что триплоидия косточковых гибридных растений, в частности сливы, в большинстве случаев характеризуется стерильностью, в то время как на определенную степень фертильности указывает тетраплоидия (Крен, Лоуренс, 1936; Жуков, 1970, 1973; Харитонова, 1973; Машкин, Буторина, 1973 и др.).
В связи с этим, цитологическое изучение при отдаленной гибридизации имеет большое значение. Результаты исследований позволяют определить уровень плоидности гибридных форм, что дает возможность прогнозировать степень плодовитости гибридов при проведении селекционных работ.
В настоящей работе нами проведен подсчет числа хромосом у ряда изучаемых отдаленных гибридов сливы. Уровень плоидности установлен у представителей отдаленных гибридов сливы Fi, полученных от двух групп скрещиваний:
Первая группа - диплоид (2х) х тетраплоид (4х), формы: 312-67, 67-66, 337-67, 325-67, 318-67, 345-67, 340-67.
Вторая группа - диплоид (2х) х гексаплоид (6х), формы: 73-66, 96-68, 405-67.
Анализ таблицы 2 показывает, что отдаленные гибриды сливы, полученные от скрещивания диплоид х тетраплоид (2х х 4х), имеют соматическое число хромосом 2п=24 и являются аллотриплоидами (Зх). Происхождение триплоидных гибридов можно объяснить как результат слияния нормально редуцированных женской гаметы диплоидного сорта Опата п(х)=8 с мужской гаметой тетраплоидного терна п(2х)=16. Подобные гибриды имеют нечетное число основных наборов хромосом (Зх) и являются несбалансированными аллополиплоидами. Следовательно, гибриды первой группы скрещивания характеризуются несбалансированным геномным составом (х+2х). Вследствие чего неполная конъюгация хромосом, очевидно, приводит к формированию массы функционально неполноценных гамет, что, в конечном итоге, значительно влияет на плодовитость. Подтверждением этого могут служить данные И.С.Руденко (1978) по изучению триплоидов, у которых подавляющее количество цветков не формирует плодов как при искусственном, так и при свободном опылении, что является результатом образования большого процента нежизнеспособных гамет.
Результаты учета завязываемости плодов у изучаемых триплоидов сливы в условиях свободного опыления показали, что за годы наших наблюдений не отмечено образования плодов ввиду полного осыпания цветков и завязей на разных стадиях развития. Однако при искусственном опылении некоторые триплоидные гибриды способны формировать плоды, но в небольшом количестве. Так, у триплоида 67-66 при скрещивании с терном завязывалось 1,3 % плодов, а у гибридной формы 340-67 - 1,7% (рисунок 1).
Анализ прогаммной фазы оплодотворения аллополиплоидов сливы (диплоид х гексаплоид) при интрогрессивной гибридизации
Опыты по изучению особенностей роста пыльцевых трубок в тканях пестиков аллотетраплоидов 96-68 и 73-66 были поставлены в 1980-1981 годах.
Предварительно был проведен анализ жизнеспособности пыльцевых зерен растений - опылителей. Были получены следующие результаты (1980г): жизнеспособность сорта вишнесливы сорта Опата составила 3,2%, сортов Ренклод тамбовский и Ренклод Альтана соответственно 46,7% и 3,4%. Очевидно, на жизнеспособность пыльцы сорта Ренклод Альтана оказал влияние тот факт, что пыльца была доставлена из Никитского ботанического сада.
Комбинации скрещивания тетраплоидных гибридов 96-68 и 73-66 с материнской формой Опата характеризовались очень слабой прорастаемо-стью пыльцевых зерен, низкими темпами роста пыльцевых трубок и их немногочисленностью. При этом, опытные варианты скрещивания различались между собой по скорости роста пыльцевых трубок в тканях пестиков.
Первые нарушения отмечались уже сразу после опыления и характеризовались задержкой или полным подавлением прорастания части пыльцы. При нанесении на рыльце аллотетраплоидов пыльцы сорта Опата, как правило, прорастали единичные, наиболее крупные пыльцевые зерна, хотя опыление было обильным. Так, единичные пыльцевые зерна в отдаленных пестиках в комбинации тетраплоид 96-68х Опата прорастали через 3 часа с момента опыления, тогда как при опылении гибрида 73-66 подобные картины наблюдали спустя сутки после нанесения пыльцы сорта Опата. Проросшая пыльца в этих комбинациях формировала короткие пыльцевые трубки длиной 1-2 диаметра пыльцевого зерна.
Наличие единичных проросших пыльцевых зерен приводило к тому, что лишь через двое суток после опыления в некоторых пестиках аллотет-раплоида 96-68 отдельные пыльцевые трубки прорастали рыльце, достигали проводниковой ткани столбика.
Через четыре дня с момента нанесения пыльцы на рыльце число пестиков, в которых пыльцевые трубки дорастали до столбика в комбинации 96-68 х Опата, возрастало. Установлено наличие в этот момент в области рыльца аномально растущих пыльцевых трубок. Аномалии заключались в следующем: пыльцевые трубки внедрялись в рыльце, росли в противоположную сторону от столбика, они изгибались и спиралевидно закручивались. В то же время, в некоторых пестиках отдельные пыльцевые трубки дорастали до средней части столбика, но здесь прекращался их рост (таблица 10). В более поздних фиксациях (через пять-шесть суток после опыления) увеличения длины пыльцевых трубок не наблюдали.
Замедленные темпы прорастания пыльцы (через 24 часа) на рыльце в комбинации тетраплоид 73-66 х Опата в дальнейшем оказывали свое влияние на рост пыльцевых трубок. Только на третьи сутки после опыления немногочисленные пыльцевые трубки врастали в рыльца. У некоторых пыльцевых трубок на концах образовывались разветвления, некоторые из них росли по поверхности рыльца, не внедряясь в него.
Изучение пестиков, зафиксированных через четыре дня после опыления, показало, что единичные, в некоторых случаях две пыльцевые трубки, проникали на глубину 1/3 длины столбика, при дальнейшем изучении рост пыльцевых трубок в столбике не наблюдался. Следовательно, барьерная зона несовместимости, в данном случае, находилась в верхней трети столбиков пестиков аллотетраплоида 73-66.
Проанализировав комбинации скрещивания триплоидов с сортом Опата, исследуемых ранее, мы предположили, что и в комбинации тетраплоид х Опата возможны нарушения взаимоотношений мужского гамето-фита с пестиком. Это могло выразиться в остановке роста пыльцевых трубок на разной глубине пестика. Поэтому, параллельно с вариантом скрещивания тетраплоид х Опата, мы опылили укороченные пестики аллотет-раплоидов (длина которых составила 7б столбика) пыльцой диплоидной материнской формы сорта Опата. Однако цитоэмбриологическими исследованиями укороченных пестиков установлено, что прорастание пыльцы сорта Опата на срезе пестиков аллотетраплоидов не наблюдали.
При интрогрессивной гибридизации тетраплоидов сливы 96-68 и 73-66 проводили опыление пыльцой исходных отцовских форм.
Первый тетраплоид был опылен пыльцой сорта сливы Ренклод тамбовский, второй - сорта Ренклод Альтана.
Продолжительность периода от опыления до начала формирования пыльцой единичных пыльцевых трубок в изучаемых вариантах скрещивания составила 3 часа.
Длина образовавшихся пыльцевых трубок равнялась 1-2 диаметрам пыльцевого зерна. Через шесть часов с момента опыления в комбинации скрещивания тетраплоид 96-68 х Ренклод тамбовский количество пестиков и число проросшей на них пыльцы увеличивалось. В комбинации 73-66 х Ренклод Альтана число пестиков с проросшей пыльцой возрастало в этот же период незначительно. При исследовании пестиков, зафиксированных через 24 часа после опыления, установлено, что в комбинации 96-68 х Ренклод тамбовский пыльцевые трубки, пройдя рыльце, проникали в ткань столбика на /j его длины. В то же время, в некоторых пестиках единичные пыльцевые трубки (одна- две) достигали длины столбика. Каллозных пробок заклады валось мало, в среднем, две-три на пыльцевую трубку. В комбинации скрещивания 73-66 х Ренклод Альтана через сутки с а б Рисунок 9 - Аномальные пыльцевые трубки в столбике гибрида 73-66: а,б-образование вздутий различных по форме и месту положения (ув. 20x3) момента нанесения пыльцы на рыльце сформированные пыльцевые трубки прорастали рыльце и достигали проводниковой ткани столбика. В отдельных случаях на концах пыльцевых трубок формировалось вздутие, однако через некоторое время такие пыльцевые трубки возобновляли свой рост (рисунок 9а). Аналогичные аномалии в строении и развитии пыльцевых трубок при межвидовых скрещиваниях сливы отмечали Г.А. Седышева (1969), Г.А. Курсаков, Л.А. Дубовицкая (1974) и др.
Наблюдения показали, что в изучаемых комбинациях скрещивания, как правило, в рыльце врастало большее число пыльцевых трубок, чем мы видели их в столбике. Реакция несовместимости отдельных пыльцевых трубок с тканями пестика проявлялась, видимо, сразу же после прорастания пыльцы. Такие пыльцевые трубки прекращали свой рост в тканях рыльца, образуя на концах разветвления, вздутия (рисунок 96). В отдельных случаях, пыльцевые трубки не формировали разветвлений, но рост их прекращался в рыльце, в то время как другие росли уже по тканям столбика.
Тиражирование и укоренение побегов, полученных в культуре каллусных и листовых тканей
При регенерации в культуре каллусных тканей и листовых дисков земляники индуцированные побеги - регенеранты представляют несомненный интерес для селекционно-генетических исследований, поскольку могут быть мутантными и отличаться от прототипа качественными и количественными признаками.
Поэтому для того чтобы избежать возможной потери и сохранить для дальнейшего изучения сформировавшиеся генотипы, проводили тиражирование и укоренение побегов в системе размножения in vitro. В результате проведенных мероприятий были получены идентичные копии.
Технология клонального микроразмножения растений земляники разработана достаточно хорошо, однако имеет тенденцию к усовершенствованию отдельных этапов. Это, прежде всего, связано с генетическими особенностями размножаемых сортов, их реакцией на состав питательной среды, экзогенные регуляторы роста, культуральные условия и другие факторы (Boxus, 1974; Попов, 1977; Высоцкий, 1998; Деменко, 2005 и др.).
Тем не менее, применяя уже отработанные приемы, мы получили необходимое для исследований количество растений-регенерантов.
Поэтому в этом разделе мы остановимся на основных этапах проведения работ по клональному микроразмножению опытных растений земляники (размножение, укоренение и перенос пробирочных растений в почвенный субстрат).
Индуцированные побеги в ламинар-бокс отделяли от каллуса или листового диска и пересаживали на агаризованную питательную среду микроразмножения. Каждый исходный побег переносили в отдельную пробирку диаметром 21мм с целью создания селекционных линий растений. Побег представлял собой проросток с несколькими небольшими листьями на коротких черешках. Так как побеги перед проведением процедуры размножения находились в асептических условиях культуры in vitro, то применения приемов стерилизации не требовалось.
Полученные в экспериментах адвентивные побеги указанных сортов выращивали на основной среде Мурасиге-Скуга, модифицированной по гормональному составу. В одном из вариантов использовали среду по прописи Андерсона. На этапе размножения в культуральную среду вводили цитокинин 6-БАП в количестве от 0,5 до 1,0 мг/л. Результаты опытов показали, что оптимальной являлась концентрация 1,0 мг/л. Таблица 24 - Размножение в системе in vitro побегов, индуцированных в культуре каллусных и листовых тканей сортов земляники (среда Мурасиге-Скуга с 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л, 1991 -1994 гг.) Культивирование на среде размножения проводили при t = 25 ± 2 С и 16-часовом фотопериоде.
Примерно через 25-30 суток после введения в культуру in vitro в основании побега отмечали пролиферацию первых придаточных почек, которые быстро росли и формировали конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью. Образовавшиеся почки разделяли и суб-культивировали на свежую питательную среду того же состава, где продолжалась пролиферация адвентивных почек.
В таблице 24 представлены результаты по микроразмножению адвентивных побегов, полученных из каллусной ткани и листовых дисков сортов земляники. Коэффициент размножения после первого пассажа по сортам составил в среднем 4,7 - 8,3 дополнительных побега на эксплант. У некоторых введенных в культуру микропобегов формировалось до 30 и более адвентивных почек, из которых в дальнейшем образовывались побеги.
Следующий этап клонального микроразмножения заключался в укоренении размноженных побегов. Однако в некоторых культуральных сосудах формирование корней можно было наблюдать при нахождении микропобегов на среде размножения. На этапе ризогенеза применяли среду Му-расиге-Скуга, но при этом уменьшали в два раза концентрацию макро- и микросолей основного состава среды. Уменьшали и количество добавляемой сахарозы с 3,0% до 2,0 %.
Корнеобразование стимулировали введением в состав питательной среды регуляторов роста с ауксиновои активностью, полностью, исключая цитокинин. Накопленный опыт экспериментальной работы показал, что в качестве индуктора процесса ризогенеза у регенерировавших побегов предпочтительнее использовать ИМК в концентрации 0,5 мг/л. При отсутствии или экономии ауксинов можно рекомендовать проводить укоренение побегов земляники и на безгормональной среде.
Для эффективного укоренения и последующего развития растений отбирали побеги-регенеранты высотой 15 мм и более. Неукорененное растение состояло из укороченного стебля с двумя- тремя листьями на коротких черешках. Побеги меньшей длины менее активно образуют корневую систему, регенеранты слабо растут, что снижает выход укорененных растений при переводе их в нестерильные условия.
Манипуляции по переносу микропобегов на среду укоренения осуществляли с соблюдением правил строгой асептики. В биологические пробирки, в основном, пересаживали по одному побегу, а в колбы объемом 100 мл- до 10 штук. Побеги культивировали при t= 25 ±2 С и 16 - часовом световом дне.
Примерно через 30 суток выращивания в основании побегов наблюдали формирование корней. Побеги - регенеранты анализируемых сортов, в целом, имели довольно высокий процент укоренения. Однако по сортам этот показатель незначительно отличался (приведен средний %): Урожайная ЦГЛ - 97,2%, Фейерверк - 96,6%, Консервная плотная - 93,3%, Рубиновый кулон - 92,6%, Холидей - 87,2%. При этом, в расчет не брали укорененные побеги, которые по разным причинам погибали на среде укоренения.
В результате проведенных работ сформировывались растения - регенеранты земляники в количестве 4423 штук. Из них из тканевых культур сорта Фейерверк получено 2048 растений, сорта Урожайная ЦГЛ-1171, сорта Рубиновый кулон-727, сорта Консервная плотная- 232, сорта Холи-дей-245.
Растения - регенеранты необходимо адаптировать к выращиванию в нестерильных условиях - почвенном субстрате. Перенос пробирочных растений в почвенный субстрат играет важнейшую роль в исследованиях с применением методов культуры ткани. Поскольку, в случае отрицательного результата адаптации растений к почвенным условиям произрастания полностью перечеркивается вся предшествующая работа.
