Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Перспективы применения семейства амарантовые, биологические особенности, биохимический состав, регуляция процессов адаптации растений к стрессовым факторам (обзор научной литературы)
1.1. Амарант - многофункциональная культура 10
1.2. История происхождение и распространение культуры рода Amaranthus 13
1.3. Систематикаи морфология амаранта 15
1.4. Генетикаи филогения амаранта 19
1.5. Биохимический состав листовой массы амаранта 24
1.6. Рост и развитие амаранта, требования амаранта к условиям внешней среды 35
1.7. Свободные радикалы, окислительный стресс и низкомолекулярные антиоксиданты 40
1.8. Роль L- аскорбиновая кислоты как антиоксиданта в жизни растений и человека 1.8.1. Биосинтез L- аскорбиновой кислоты у высших растений: роль VTC2 48
1.8.2. Пути метабилизма L-аскорбиновой кислоты в
растениях 48
1.8.3. ГДФ - L - галактоза фосфорилаза - ключевой фермент биосинтеза L- аскорбиновой кислоты 53
1.8.4. VTC5: вторая ГДФ -L- галактоза фосфорилаза у Arabidopsis 54
1.8.5. Регулирование активности VTC2 и VTC5 з
ГЛАВА 2. Объекты, условия и методы проведения исследований
2.1. Объекты исследования 58
2.2. Условия и место проведения исследований
2.2.1. Агрометеорологические условия проведения опытов (Одинцовского района Московской области) 59
2.2.2. Условия и местопроведение опытов (Эквадор-Котопакси-Латакунга- Салаче) 63
2.3. Методика проведения наблюдений, учётов и анализов 65
ГЛАВА 3. Влияние климатических условий на морфофизиологические показатели растений амаранта разных видов и сортов при возделывании в нечерноземной зоне россии и эквадоре
3.1. Высота растений 68
3.2. Показатель числа листьев 70
3.3. Соцветия 72
ГЛАВА 4 Фенологические особенности сортов амаранта в условиях московской области и республики эквадор
4.1. Продолжительность периода посев-всходы 75
4.2. Продолжительность периода вегетации 76
4.3. Продолжительность периода до цветения 79
ГЛАВА 5. Молекулярный анализ полиморфизма генома у видов Amaranthus
5.1. Анализ последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2 и рибосомного гена 5.8S видов рода Amaranthus 84
5.1.1. Межвидовой полиморфизм представителей рода Amaranthus 85
5.1.2. Сравнительный анализ полиморфизма последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 родов Amaranthus и Celosia 87
5.1.3. Определение вторичной структуры 5.8S рРНК у амаранта и целозии 88
5.2. Анализ полиморфизма последовательностей пластомного генома видов Amaranthus 90
5.2.1. Полиморфизм последовательностей спейсераpsbArnH у представителей Amaranthus 94
5.2.2. Полиморфизм последовательностей хп ДНК спейсера trnTrnY
у представителей рода Amaranthus 96
5.2.3. Полиморфизм последовательностей хп ДНК спейсера trnCF ycfR у представителей рода Amaranthus 100
5.2.4. Полиморфизм последовательностей хлпДНК спейсера trnDR psbMF у представителей рода Amaranthus 102
5.2.5. Полиморфизм последовательностей хп ДНК спейсера tabDabC у представителей рода Amaranthus 105
5.2.6. Полиморфизм последовательностей хп ДНК спейсера ndhJabE у представителей рода Amaranthus 110
5.2.7. Дендрограмма, полученная на основе первичных нуклеотидных последовательностей шести участков хлоропластных генов 112
ГЛАВА 6. Биохимические показатели сортов амаранта
6.1. Динамика изменения содержания сухого вещества в листьях растения амаранта 114
6.2 Динамика изменения содержания Сахаров в листьях растения амаранта 115
6.3. Изменчивость содержания аскорбиновой кислоты в листьях растения амаранта 116
ГЛАВА 7. Идентификация новых генов контроля биосинтеза l-аскорбиновой кислоты vtc2 и анализ их полиморфизма у представителей рода Amaranthus
7.1. Полиморфизм гена ГДФ-L- галактозид фосфорилазы-1 VTC2
у представителей рода Amaranthus 118
7.1.1. Дизайн и создание праймеров для амплификации гена ГДФ-L галактозид фосфорилазы-1 VTC2 120
7.2. Полиморфизм аминокислотной последовательности VTC2
белка видов Amaranthus 126
7.2.1 Анализ внутриродового аминокислотного полиморфизма видов Amaranthus 127
7.2.2 Сравнение аминокислотной вариабельности VTC2 амаранта и различных представителей двудольных и однодольных растений 128
7.2.3 Филогенетический анализ последовательностей генов ГДФ-L галактозид фосфорилазы-1 видов Amaranthus 132
Выводы 135
Практические рекомендации 135
Список используемой литературы
- История происхождение и распространение культуры рода Amaranthus
- Агрометеорологические условия проведения опытов (Одинцовского района Московской области)
- Показатель числа листьев
- Продолжительность периода вегетации
История происхождение и распространение культуры рода Amaranthus
У каждого племени индейцев было свое название амаранта. Например, майя называли его "xtes" (кстес), ацтеки говорили "huautli" (уаутли), инки называли амарант "kiwicha" (киуича) ("pequeno gigante" - маленький гигант). Впоследствии растение приобрело единое название «amaranto» (амарант).
Название амарант происходит от греческого «амарантос», что означает «неувядающий» цветок (а - не, maraino - увядать, anthos - цветок).
Первые цивилизации (майя, ацтеки и инки) выращивали его как культурное растение с высокой урожайностью. Амарант имел огромную значимость как за его питательную ценность, так и за его целебные свойства.
Хуан Мануэль Варгас Лопес, исследователь из университета Сонора (Мексика), упоминает испанские хроники того времени, указывающие, что территория ацтеков более 5000 гектаров были засеяны амарантом и урожай составлял от 1,5 до 2 тонн зерна в год, что давало ему третье место по занимаемой площади, после кукурузы и бобов. Фермеры из 20 провинций выплачивали большие налоги, взимаемые ацтекской империей с порабощенных народов.
Археологические данные показывают, что Мексика является одним из центров происхождения и одомашнивания амаранта (Sauer, 1950), кроме того, представлено огромное количество различных как культивируемых видов, так и не культивируемых. Некоторые авторы провели исследования в области филогенетических взаимоотношений культивируемых видов и их возможных предков (Sauer 1967, Pal и Khoshoo 1974). Мексика остается самым важным центром биоразнообразия и одомашнивания, и наиболее вероятно, что центр происхождения культивируемых растений амаранта находятся в этом месте (Ortiz Ricardo, 1997 Мексиканец, 1990). Первые растения амаранта интродуцированные в Европу в период колониальной эпохи использовались в качестве декоративных, и давали, как правило, только черные семена. Позже, в одном из старейших гербариев Европы, который содержит много образцов выросших в Германии в шестнадцатом веке, был найден образец A. hypochondriacus с белыми семенами (Sauer, 1967). Это показывает, что, очевидно, белые семена были привезены в Европу в древние времена, но не сохранились в связи с конкуренцией с темными семенами растений, которые преимущественно использовались в качестве декоративных, а не как растения для производства семян.
В Азии, в старейших записях говорится о возделывании амаранта на Цейлоне и в Индии, начиная с восемнадцатого века. Считается, что голландцы получили семена амаранта от испанцев и привезли на Цейлон. В первой половине девятнадцатого века, культура амаранта распространялась через Деканское плоскогорье в Южной Индии и в горах Гималаев. Культура также появились в Китае и в Восточной Сибири в девятнадцатом веке (Sauer, 1967).
Второе рождение амарант получил, когда в 1972 году австралийский физиолог Джон Даунтон обнаружил, что семена амаранта содержат больше белка, чем у кукурузы, риса и других зерновых культур. Кроме того, было определено, что белок амаранта содержит аминокислоту лизин того же порядка, что и молоко, тогда как содержание лизина в других зерновых невысоко (Гине М.С. и др., 1995; Соловьева А.Е. и др., 1997; Тимонин А.К., 1984).
В настоящее время селекционерами созданы сорта амаранта, приспособленные к конкретным условиям возделывания. Они выращиваются во всех климатических зонах, кроме Крайнего Севера, широко распространены н Китае, Индии, Вьетнаме, Египте, США. Германии, Финляндии (Яблокова М.М. и др., 1989). Так, в Китае в последние в годы эта культура возде 15 лывается па площади более 80000 га, а производство семян в США в 1988 году оценивалось в 600 000 - 800 000 т. В СССР в 1989 году общая площадь посева амаранта составляла 24 000 га. В настоящее время интерес к данной культуре значительно вырос, но площади посевов почти не увеличились (Беликова СВ. и др., 1991; Любимов В.Ю. и др., 1991; Магомедов И.М. 2001; ТимонинА.К. 1985).
Род Amaranthus относится к отделу Magnoliophyta (Angiospermae) классу Magnoliopsida (Dicotyledones) подклассу Caryophyllidae надпорядку Caryophyllanae порядку Caryophyllales подпорядку Chenopodiineae семейству Amaranthaceae (Тахтаджян А.Л., 1987).
Род амаранта включает 70 видов, сгруппированных в три подрода (Mosyakm and Robertson 2003,). Из них наибольшее распространение имеют 55 видов. В России произрастают в диком виде 16 видов (Мироненко и др. 1990).
Подрод амаранта - Amaranthus состоит более 20 видов однолетних трав: A. brandegei (Standley), A. bigelowii (Uline и Bray), A. viscidulus (Greene), A. scariosus (Bentham), A. asplundii Thell (Hunziker, 1965), A. pallidijlorus F. (Sauer 1967), A. tricolor sensu lato, A. viridis L, и A. blitum L. A. caudatus L, A. quitensis Kunth, A. retrojlexus L, A. celosioides Kunth, A. asplundii Thell, A. hybridus L. (A. patulus Bertol.), A. powellii S. Watson (A. hybridus pp.sensu auct.), A. bouchonii Thell, A. hypochondriacus L, A. cruentus L, A. dubius Mart, , и Amaranthus spinosus L. которые однодомные (Mosyakin и Robertson, 2003), то есть, есть отдельные мужские и женские цветки. Виды являются родными для Северной и Южной Америки, за исключением только одного вида Европейского происхождения (Mosyakin и Robertson, 2003). Однодомный амарант в первую очередь самоопыляемый, так как женские и мужские цветки расположены близко друг к другу (Murray, 1940). Стебли обычно прямые и боковые и терминальные соцветия располагаются в цилиндрических колосках или метелках (Mosyakin и Robertson, 2003).
Подрод амаранта - Acnida включает в себя девять двудомных видов: Amaranthus cannabinus L. (Sauer), A. australis (A. Gray) Sauer, A. tuberculatus (Moquin) Sauer, A. floridanus (S. Watson) Sauer, A. rudis (A. tamariscinus sensu auct., поп Nutt., see Sauer 1972), A. palmeri (S. Watson), A. watsonii (Standley), A. arenicola (I. M. Johnston) и A. greggii S. (Watson) - то есть, таксоны с отдельными мужскими и женскими растениями - которые являются родными для Северной Америки и которые не имеют прямого эволюционного отношения с культивированным амарантом. Однако, недавние исследования (Тшссо др. 2005а) показывают, что обмен генами может происходить между Amaranthus tuberculatus (подрод Acnida) и A. hybridus. A. tuberculatus все чаще принимают в качестве модельного организма для изучения сорняков (Tranel и Trucco 2009).
Агрометеорологические условия проведения опытов (Одинцовского района Московской области)
Известно, что и ГДФ -D-манноза и ГДФ -L-галактоза используется не только для синтеза L-аскорбиновой кислоты, но также в синтезе полисахаридов клеточной стенки и/ или гликозилирования белков (Smirnoff, et al, 2000; Reuhs BL, et al., 2004). Реакция фосфорилазы является первой на этапе метаболизма L-галактозы и, таким образом, гены VTC2 и VTC5 являются хорошими потенциальными мишенями в регуляции синтеза L-аскорбиновой кислоты. С другой стороны L-аскорбиновая кислота, L-галактон-1 ,4-лактон (L-galactono-1 ,4-lactone) и L-галактоза не влияли на деятельность гена VTC2 показывая этим, что нет обратной связи в регулировании фермента (Dowdle J, et al, 2007). Тем не менее, добавка L-аскорбиновой кислоты снижает экспрессию VTC2 в растениях Arabidopsis, предполагая обратную связь в ингибировании синтеза L-аскорбиновой кислоты на уровне транскрипции (Dowdle J, et al, 2007). Установлено, что после 24 часов воздействия света на листья Arabidopsis наблюдалось увеличение содержания L-аскорбиновой кислоты, сопровождавшееся повышенной экспрессией VTC2, VTC5 и 20-кратным увеличением активности ГДФ -галактозефосфорилазы (Dowdle J, et al, 2007). Световая индукция синтеза мРНК гена VTC2 была также подтверждена и в двух других независимых исследованиях (Yabuta Y, et al, 2007; Muller-Moule, 2008). Кроме того, было показано, что уровень экспрессии VTC2 и VTC5 также вероятно контролируется циркадными ритмами (Dowdle J, et al., 2007). В добавлении к этому, было выявлено, что индуцированная транскрипция VTC2 и VTC5 может находиться под гормональной регуляцией жасмоновой кислоты (Sasaki-Sekimoto, et al, 2005).
Таким образом, все эти полученные данные позволяют предположить, что регулирование экспрессии VTC2 и VTC5 играет важную роль в управлении биосинтезом L-аскорбиновой кислоты. Это подтверждается также тем фактом, что временная сверх экспрессия гомолога VTC2 в листьях киви привела к трехкратному увеличению содержания L-аскорбиновой кислоты, еще раз доказывая, что именно этот продукт гена является определяющим в синтезе L-аскорбиновой кислоты в клетке (Laing, et al., 2007).
В последнее время также были получены предварительные данные о возможной ядерной локализации белка гена VTC2, в дополнение к его цитозольной локализации (Muller-Moule, 2008).
Таким образом, контроль синтеза и накопления L-аскорбиновой кислоты в растениях потенциально предполагает регулирование биосинтеза, катаболизма, переработку и транспортировку этого соединения. В данном обзоре обсуждается только регулирование биосинтеза аскорбиновой кислоты, а современные данные о катаболизме, переработке и транспортировке L-аскорбиновой кислоты рассмотрены в работах других исследователей (Hancock и Viola, 2005; Ishikawa, 2006; DeBolt, et al, 2007). Несмотря на это показано, что несколько ферментов метаболического пути синтеза витамина С могут оказывать влияние на конечный продукт, и, в итоге, оказывается, что основной контроль синтеза L-аскорбиновой кислоты происходит на стадиях, катализируемых VTC2 и VTC5. Необходима дальнейшая экспериментальная работа, которая позволит понять механизмы экспрессии генов VTC2 и VTC5 и их регулирования на стадии транскрипции, постранскрипции и трансляции. Более того их ферментативная активность может потенциально модулироваться аллостерическим регулированием и взаимодействием с другими белками.
Отдельная задача это идентификация и изучение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты цикла АК, прежде всего, полиморфизма генов VTC2 и VTC5, их аллельных вариантов у различных видов растений. Понимание генетической регуляции и выявление аллельных вариантов этих генов может быть перспективным в контроле содержания L-аскорбиновой кислоты у растений. Этот подход позволит проводить селекцию сортов с повышенной устойчивостью к окислительному стрессу, с длительными сроками хранения и большей питательной ценностью для человека.
Экспериментальные исследования по выращиванию коллекции видов амаранта проводились в течение 2012-2014 годов на демонстрационном участке в ВННИССОК, а также в отделе физиологии и биохимии растений Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур. Опыт по генетической части был проведён в Центре «Биоинженерии» Российской Академии Наук и в институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, а также с 2013 по 2014 годов проводились исследования по выращиванию коллекции амаранта районированием для московской области на экспериментальных полях Эквадора.
В основу районирования Московской области положены термические ресурсы периода вегетации и степень обеспеченности влагой. По термическим условиям периода вегетации область можно разделить на три агроклиматических района: первый - менее теплый, второй - теплый и третий более теплый. Второй район охватывает всю центральную часть, а также возвышенную часть юга области. В него входят полностью многие административные районы и в частности Одинцовский, территория которого равна 225 км2. Этот район (на его территории расположены опытные поля ВНИИССОК) характеризуются следующими агроклиматическим условиями. Сумма положительных температур за период с температурой более 10С (активных) составляет 1900-1950. Продолжительность безморозного периода - 120 суток (с 20 мая по 20 ноября), с температурой более 15С - 60-65 дней. Переход среднесуточных температур воздуха через 15С - начало 10 июня, конец - 20 августа; 10С - начало 5 мая, конец 15 сентября; 5С начало 20 апреля, конец 10 октября. Дата полного оттаивания почвы: ранняя - 22 апреля, средняя - 30 апреля, поздняя - 5 мая (Агроклиматический справочник по Московской области, 1954, 1967).
Почвы района дерново-слабоподзолистые, характеризуются отсутствием сплошного подзолистого горизонта, по своему механическому составу относятся к группе легких почв. Суглинистые разновидности встречаются небольшими пятнами. Почвы опытных участков ВНИИССОК дерново-подзолистые, тяжелосуглинистые, содержание гумуса невысокое: 2,5-3,2%. Почвы характеризуются слабокислой и близкой к нейтральной реакцией среде: рН 5,9-6,9%. Реакция почвенного раствора на опытных участках ВНИИССОК близка к нейтральной или слабокислой, содержание фосфора достаточное (Р2О5 21,5-64 мг на 100 г почвы), бедны калием (К2О 20-37,5 мг а 100 г почвы). По данным агрохимического обследования почвы ВНИИССОК достаточно обеспечены обменным кальцием (5,6-11,8 мг-экв. а 100 г почвы), а содержание обменного магния в них колеблется в пределах 1,4-2,9 мг-экв. на 100 г почвы (Пояснительная записка к агрохимическому обследованию почв ВНИИССОК, 1979).
Метеорологическая характеристика вегетационных периодов за годы проведения исследований приведена в таблицах 7 и 8 (по данным meteo-infospace, eurometeo)
Анализ метеорологических данных за вегетационные периоды трех лет исследований показывает, что в целом, погодные условия были благоприятны для выращивания разновидностей амаранта на зеленую массу и созревания семян для 9 из 14 изученых видов амаранта.
Показатель числа листьев
Таким образом, был проведен анализ последовательности ITS1-5.8S-ITS2 у 11 образцов шести видов амаранта (Amaranthus caudatus, A. cruentus, А. hybridus, A. tricolor, A. paniculatus, A. hypohondriacus) и представителя родственного рода Celosia. Показано, что вариабельность последовательности межгенных спейсеров ITS1, ITS2 и гена 5.8S рРНК анализируемых видов амаранта крайне низка. Впервые определена вероятная вторичная структура молекулы 5.8S рРНК, идентифицированы три консервативных мотива, которые необходимы для поддержания правильной вторичной структуры данной молекулы РНК, а также для сборки большой субъединицы рибосомы. Выявленная единичная нуклеотидная замена у А. hybridus не изменяла топологию петель. У образца Celosia cristata, взятого в качестве внешней группы, выявлена 4-нуклеотидная инсерция в 5 -конце гена, а также однонуклеотидная делеция в четвертой шпильке, не оказывающая влияния на общую топологию молекулы 5.8S рРНК. 5.2. Анализ полиморфизма последовательностей пластомного генома видов Amaranthus.
В настоящее время полиморфизм последовательностей хлоропластной ДНК широко используется для выявления степени вариабельности пластома, определения филогенетических отношений у различных семейств и родов растений, а также для уточнения таксономического статуса отдельных образцов (Stech et al, 2003; Borsch et al, 2003; Shaw et al, 2007; Smedmark et al, 2008, Мартиросян и др., 2008).
Одной из целей данного исследования было проведение оценки внутривидового и межвидового полиморфизма хлоропластной ДНК, выявление филогенетических отношений и определение возможных спейсеров: trnH-psbA, trnCF-ycfR, trnDR-psbMF, tabDabC, ndhJabE, trnTrnY. Выбор участков генома хпДНК, взятых для анализа, основывался на работе Shaw et al. (2005) по исследованию вариабельности различных фрагментов пластома и установления возможностии их использования для проведения филогенетических работ у различных таксонов растений.
Ранее для анализа межвидового и внутривидового полиморфизма пластома Amaranthus были использованы только области интрона matk/trnK и межгенный спейсер trnCmD (Waselkov.et al., 2013), поэтому представлялось интересным взять в анализ другие, ранее не исследованные участки хлоропластной ДНК амаранта.
Для анализа полиморфизма всех отобранных участков хлоропластного генома был составлен набор из 22 образцов рода Amaranthus, представляющих 18 видов: в качестве внешней группы использовался образец родственного рода - Celosia L (Celosia cristata (сорт Вера) (табл.20).
Для определения полиморфизма хпДНК Amaranthus все взятые в анализ последовательности 23 образцов (включая представителя рода Celosia) были амплифицированы с использованием стандартных праймеров (табл.21) и секвенированы впрямую с 5 и 3 - концов с использованием тех же праймеров. Для построения дендрограмм использовали программу MEGA 5.0.
Спейсерный участок trnH-psbA ранее был использован в ряде работ по определению геномной вариабельности и филогении растений и было показано, что спейсер trnH-psbA характеризовался достаточным количеством информативных признаков (Jephris Gere et al., 2013, Xiaohui Pang et al, 2012, Degtjareva GV et al, 2012). Последовательность даннного спейсера была неизвестна для амаранта и поэтому представлялось интересным получить и проанализировать этот участок пластома у видов Amaranthus.
В анализе межгенного участка trnH-psbA были взяты 16 образцов анализируемых видов Amaranthus, а также образец Celosia cristata (сорт Вера) (табл 20).
В целом последовательности межгенного участка trnH-psbA для представителей видов Amaranthus были сходны, однако, были обнаружены и видоспецифичные точковые замены. Так у представителей вида A.gangeticus характерна видоспецифичная дупликация АССТААААТТ, а также были обнаружены видоспецифичные трансверции в положении Азоэ, Т322, А377. В положении А320 находились нуклеотидные замены специфичные для видов А. mangostanus и A. oleraceus. У представителей A. mantegazzianus и A. caudatus (сорт Булава) также были выявлены замены (С401) специфичные только для данных видов (табл. 23).
Впервые была охарактеризована последовательность спейсера trnTrnY амаранта. Межгенный спейсер trnTrnY рода Amaranthus был амплифицирован (рис. 5) и секвенирован с использованием соответствующих праймеров (табл. 21).
Проведенное прямое секвенирование полученных фрагментов показало, что общая длина выровненной последовательности спейсерного участка trnTrnY составила 835 п.н. Размеры спейсерного участка trnTrnY у видов Amaranthus и Celosia cristata значительно варьировали: от 659 п.н. у представителей видов A. tricolor (сорт Валентина), A. hypochondriacus (сорт Крепыш), A. hypochondriacus (сорт Кизлярец), A. bicolor, A. floridavus, А. aureus, A. kempsay, A. gangeticus до 757 п.н. у вида С. cristata сорт Вера), то есть различия составляли 98 нуклеотидов. В анализируемом наборе вариабельным был 61 нуклеотидный сайт, что составило 7,30% от всей длины выровненной последовательности. Количество консервативных сайтов составило 615 (73,65%). Из числа вариабельных сайтов парсимони-информативными были 14 (1,67%), а состав АТ=67,5 (Табл. 24).
При анализе последовательности участка trnTrnY у видов А. mantegazzianus, A.caudatus (сорт Алегрия, ЕСШ7020, Булава и Зеленая Сосулька), в положении 239 была выявлена 5-нуклеотидная вставка, которая образовалась у этих двух видов в результате тандемного повторения последовательности TGGAA. У остальных анализируемых видов, эта последовательность (TGGAA) присутствовала только один раз (рис.6). Необходимо отметить, что это замена является видоспесифической для всех четырех сортов придналежащих виду A.caudatus. Интересно, что вид А. mantegazzianu тоже имеет эту вставку, что указывает на возможную близость между этими видами.
Продолжительность периода вегетации
На основе выбранных из базы данных последовательностей была разработана пара праймеров к участкам ГДФ-Ь-галактозид фосфорилазы-1, которые имеют гомологию с выбранным участком генов-гомологов VTC2 у всех в анализируемых последовательностей растений, включая однодольные, а значит с высокой долей вероятности будут иметь гомологию и с последовательностью гена амаранта (рис. 26). При этом, так как доступные гены принадлежат очень филогенетически далеким группам растений, в состав разработанных праймеров были добавлены вырожденные нуклеотиды (табл. 34).
При выборе сайтов отжига праймеров на последовательности гена руководствовались степенью консервативности участков и возможностью получения функциональных гомологов гена у широкого круга различных растений (рис.27).
Разработка последовательностей праймеров проводилась с учетом длины, температур плавления и отжига праймеров, а также GC-состава. Тотж праймеров рассчитывалась по формуле: Т = 69.3+(0.41(%[G+C]) - 650/L), где L- длина праймера.
Амплифицированные последовательности 17 генов-гомологов VTC2 секвенированны с обоих концов, с использованием праймеров VTC3F, VTC6R.
В результате впервые получены последовательности экзон Ш-экзон VI гена VTC2 для 17 образцов 12 видов амаранта , caudatus, A. hypochondriacus, A. tricolor, A. hybridus, A. cruentis, A. paniculatus, A. hypochondriacus, A. flavus, A. Kempsay, A. giganteus, A. aureus, A. mantegazzianus, A. molten jire (табл. 35)
Длина полученных первичных нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ГДФ-Ь-галактозид фосфорилазы-1 составила от 735 до736 п.н. Все полученные фрагменты VTC2 включали в себя полную последовательность интрона III -экзон IV - интрон IV - экзон V - интрон V.
Последовательности были полиморфны, и содержали как единичные нуклеотидные замены (SNPs), так и индели. Общий уровень вариабельности составил 7.19%, при этом, как и ожидалось, полиморфизм интронных последовательностей (10.35%) более чем в два раза превосходил полиморфизм экзонов (4.90%).
Все экзоны анализируемого участка гена ГДФ-Ь-галактозид фосфорилазы-1 имели одинаковую длину - 428 п.н. Различия в длинах амплифицируемого участка были связаны с инделями, локализованными в интронах. При этом все индели являлись исключительно о днонуклеотидными.
Помимо инделей было идентифицировано 53 нуклеотидные замены (SNP), 21 SNP из которых локализовались в экзонах. Важно отметить, что наибольшее число уникальных нуклеотидных замен (37 SNPs) было идентифицировано в последовательности VTC2 у вида A. hybridus сорт Неженка. Последовательности остальных исследуемых образцов были практически инвариантны.
Полиморфизм аминокислотной последовательности VTC2 белка видов Amaranthus. Представлялось интересным проанализировать, будут ли мутации, выявленные в экзонных последовательностях идентифицированных генов-гомологов VTC2, приводить к аминокислотным заменам в последовательностях соответствующих белков. Для этого полученные нуклеотидные последовательности были транслированы и проанализированы на наличие аминокислотных замен.
Протяженность всех 17 полученных последовательностей составила 143 а.о. В пределах изученных нуклеотидных последовательностей не было обнаружено мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания или мутаций, вызывающих появление преждевременных стоп-кодонов.
Анализ енутриродоеого аминокислотного полиморфизма видов Amaranthus. Всего в изученных последовательностях экзонов была выявлена 21 полиморфная нуклеотидная позиция, однако в 11 случаях обнаруженный SNP не приводил к появлению аминокислотной замены. Тем не менее, 10 SNPs приводили к образованию 7 консервативных и 3 радикальных аминокислотных замен (табл.37).
По представленной таблице видно, что наиболыпе количество замен характеризует вид A. hybridus сорт Неженка, нуклеотидная последовательность которого, как было описано ранее, являлась наиболее вариабельной. Среди аминокислотных замен большинство являются специфичными для отдельных образцов, а замена лейцина на серии является общей для образцов A. cruentus Duimovochka, A. hypohondriacus Don Pedro, A.caudatus Bulava, A.caudatus ECU17020. Интересно, что данная замена присутствует в последовательности VTC2 образцов, характеризующихся низким содержанием витамина С, таким образом, выявленная корреляция может быть использована для создания молекулярных маркеров. Однако, у сорта A. hypohondriacus Don Pedro содержание витамина С достаточно высокое, это можно объяснить наличием другого гена биосинтеза витамина С, например, VTC4, кодирующего L-галактоза-І-Р фосфатазу, который может иметь влияние на аккумуляцию витамина С (Conklin, et al., 2000).
Внутри рода Amaranthus аминокислотные последовательности были достаточно консервативны, что объясняется близкими филогенетическими связями между выбранными образцами и их принадлежностью к общему роду. Кроме того, как нуклеотидная последовательность гена VTC2, так и кодируемая им полипептидная последовательность рассматривались впервые. Поэтому представлялось интересными провести анализ аминокислотной вариабельности белка VTC2 не только внутри рода Amaranthus, но и определить, какое место данный род занимает в системе растительного мира, и найти аминокислотные позиции, характерные исключительно для представителей данного рода. Поэтому был проведен анализ аминокислотного полиморфизма белка VTC2, который включал в себя все полученные последовательности VTC2 амаранта, а также гомологичные аминокислотные последовательности представителей других двудольных растений (Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Arabidopsis thaliana, Cucumis sativus, Prunus persica, Fragaria vesca, Vitis vinifera), помимо них в анализ также был добавлен образец однодольного растения (Brachypodium distachyori).
На представленном рисунке 30 видно, что исследуемый участок полипептидной последовательности является высоко консервативным не только у амаранта, но и у других представителей двудольных, и даже у однодольного растений. Можно предположить, что именно в этом участке полипептидной цепи локализуется функциональный домен и активный центр белка. Поэтому велика вероятность, что замены, выявленные у впервые полученных последовательностей амаранта, могут иметь прямое влияние на функционирование белка.
