Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 7
1.1. Использование гаплоидов в селекции 7
1.2. Генетическое улучшение растений на основе метода культуры пыльников и микроспор 9
1.3. Культура пыльников и микроспор 11
1.4. Роль соматических тканей пыльника 13
1.5. Пыльцевой диморфизм 15
1.6. Спорофитные пути развития в культуре in vitro 16
1.7. Эмбриогенные стадии микроспор 19
1.8. Факторы влияющие на эмбриогенез 21
1.8.1. Генетический фактор 21
1.8.2. Средовые факторы 26
1.8.2.1. Условия вьіраіігивайияразтнйй - доноров - 26
1.8.2.2. Температурная обработка 27
1.8.2.3. Центрифугирование 30
1.8.2.4. Химические реагенты 31
1.8.2.5. Состав питательной среды 33
II Материалы и методы исследований 41
III Экспериментальная часть 50
3.1.Развитие пыльников капусты in vivo и в культуре in vitro 50
3.1.1. Строение стенки пыльника брокколи in vivo 50
3.1.2. Развитие мужского гаметофита капусты in vivo 55
3.1.3. Изменения тканей стенки пыльника в культуре in vitro 67
3.1.4. Процесс микроспорогенеза при культивировании in vitro 75
3.2. Влияние питательной среды 82
3.3. Влияние генотипа донорного растения 90
3.4. Влияние предобработок соцветий на микроспорогенез 95
3.4.1. Влияние температурной предобработки соцветий на микроспорогенез 95
3.4.2. Предварительная оценка эффективности использования регуляторов роста для индукции андрогенеза 102
3.4.3. Изменение тканей пыльника под воздействием температуры и предобработки БАП 117
3.5. Культура микроспор 121
3.6. Действие центрифугирования на индукцию спорофитного развития микроспор капусты 126
3.7. Спорофитные пути развития микроспор и пыльцы в культуре in vitro128
IV Заключение 129
V Выводы 132
Список использованной литературы 134
- Генетическое улучшение растений на основе метода культуры пыльников и микроспор
- Строение стенки пыльника брокколи in vivo
- Влияние генотипа донорного растения
- Культура микроспор
Генетическое улучшение растений на основе метода культуры пыльников и микроспор
О гаплоидах и о возможностях их использования в селекции и в теоретических исследованиях известно давно, однако только в 70-х годах ученые оценили реальное значение гаплоидов в селекции и начали активно разрабатывать методы их получения в культуре in vitro, позволяющие увеличить их выход. Существуют различные способы получения гаплоидов, однако большинство из них являются достаточно трудоемкими, и не всегда удается получить достаточное для селекции количество растений. Одним из перспективных методов получения гаплоидов является метод культуры пыльников и микроспор. Причем потенциальные возможности теоретического и прикладного использования этого метода выходят далеко за рамки ускорения селекционного процесса с помощью гаплоидной технологии. Получаемые растения могут служить хорошей генетической базой для селекции, но вместе с тем возможно создание принципиально новых растений на основе методов клеточной селекции и генной инженерии.
Для культуры микроспор могут оказаться приемлемы принципьі клеточной селекции. Инкубируя микроспоры в присутствии различных химических мутагенов, патотоксинов, гербицидов, аминокислотных производных, солей и других агентов, можно отобрать клоны, выживающие на селективных средах, а затем регенерировать из них мутантные растения. Это позволит расширить генетическое разнообразие культивируемых микроспор в целях получения растений с полезными признаками (Рахимбаев и др. 1990).
Основным препятствием к использованию метода отдаленной гибридизации в селекции являются трудности переноса отдельных генов, контролирующих важнейшие хозяйственно ценные признаки. Культура пыльников в сочетании с отдаленной гибридизацией может значительно расширить спектр генетической изменчивости в результате хромосомных перестроек, мостов и т. д., что приведет к регенерации линий с дополненными и защищенными хромосомами. То есть культура пыльников является быстрым и эффективным методом получения материала для хромосомной инженерии (Дьячук Т., Дьячук П., 1989).
Существует также мнение, что споропласты (протопласты из микроспор) могут оказаться удачными объектами для переноса генов путем гибридизации или для непосредственного внедрения чужеродной генетической информации (Loewus, 1985; Tanaka, 1987; Рахимбаев и др., 1990). Для прямого переноса генов в растительную клетку применяют метод микроинъекции. Однако поскольку на ранних этапах невозможно идентифицировать компетентные к морфогенезу микроспоры, то удобнее работать уже с многоклеточными эндоспориальными образованиями. Эти образования имеют ряд преимуществ: во-первых, возрастает вероятность регенерации из них трансгенных растений, так как они обладают высокими морфогенными потенциями; и во-вторых, они имеют тонкую клеточную стенку, что облегчает процедуру микроинекции (Рахимбаев и др., 1990). По всей видимости, такие морфогенные образования в культуре микроспор могут оказаться более восприимчивыми к проникновению чужеродного генетического материала.
Культура пыльников и микроспор является ко всему прочему еще и удачной моделью и для изучения процессов деления и дифференцировки клеток. Отклонения незрелого гаметофита от нормального пути развития и переход к спорофитному пути развития в условиях in vitro позволяет изучать дифференциальную экспрессию и регуляцию генов в течении двух фаз жизненного цикла.
Несмотря на достигнутые успехи, высокоэффективных технологий получения гаплоидных растений в культуре пыльников и культуре микроспор еще не создано. Однако очевидно, что по мере усовершенствования существующих технологий, их роль в селекции важнейших сельскохозяйственных культур возрастет.
Строение стенки пыльника брокколи in vivo
У капусты, как и у других представителей рода Brassica, пыльники четырехгнездные. Гнезда попарно объединены в две теки. Стенка пыльцевого гнезда развивается по однодольному типу (центростремительно). В результате деления первичного париетального слоя появляются эндотеции и вторичный париетальный слой. Последний снова делится периклинально, и образуется средний слой и тапетум. Этот тип формирования клеточной стенки соответствует «типу Зонтичных» по классификации Т.Б. Батыгиной и соавторов (1963).
Исследование проводилось на пыльниках брокколи сорта «Тонус». Стенки сформированного пыльника состояли из 4 слоев: эпидермиса, эндотеция (фиброзный слой), среднего слоя и тапетума (рис. 1).
Эпидермис (экзотеций) — высокоспециализированный элемент покровной ткани пыльника. Клетки эпидермиса на первых этапах развития пыльников капусты по своему размеру мало отличаются от клеток других тканей стенки. Они имеют вид меристемы, и их характерной особенностью является только антиклинальное направление делений. Впоследствии клетки эпидермиса начинают увеличиваться в длину и ширину. На стадии тетрад (размер бутона примерно 2,5мм) клетки эпидермиса сильно уплощенные (рис. 1), позже с увеличением размера пыльника происходит увеличение клеток эпидермиса. При развитии пыльника, когда большинство микроспор находится на поздней вакуолизированной стадии (размер бутона 3,5мм), внешняя поверхность клеток эпидермиса, начинает покрываться кутикулярным слоем, который несколько увеличивается по мере дальнейшего развития пыльника (рис. 1). На двуядерной стадии развития (размер бутона примерно 6,0мм) клетки эпидермиса снова несколько уплощаются, при этом цитоплазма и ядро занимают пристеночное положение, а большая часть клетки занята вакуолью (рис. 1Г). Диаметр эпидермальных клеток стенки пыльника и в области связника сильно различается. В области связника клетки эпидермиса значительно крупнее и имеют округлую форму.
Эндотепий — внешний слой стенки пыльника, расположенный под эпидермисом. В оболочках эндотеция по мере дифференцировки микроспорангия развиваются вторичные утолщения. Эти утолщения имеют вид узких полос, или ребер, ориентированных перпендикулярно эпидермальному слою. Благодаря наличию утолщений, эндотеций называют фиброзным слоем. Считается, что образующиеся фиброзные утолщения способствуют раскрытию гнезд пыльника при помощи продольной трещины — стомиума, которая возникает между двумя микроспорангиями каждой половинки пыльника.
В молодом пыльнике капусты клетки эндотеция мало отличаются от клеток среднего слоя. Они имеют прямоугольную форму на поперечном срезе. Позже их форма меняется за счет увеличения радиального размера. Фиброзные утолщения появляются в пыльниках, содержащих преимущественно зрелую пыльцу (размер бутонов 6,0мм). При этом происходит перемещение ядра в пристеночный слой цитоплазмы, а основной объем клеток занимает большая вакуоль (рис. 1Д). Фиброзные утолщения в последующем становятся еще более заметными (рис. IE). Эндотеций сохраняется до конца существования пыльника.
Средний слой (назван по расположению между тапетумом и эндотецием; Coulter, 1898). На ранних этапах развития микроспорангия клетки среднего слоя не отличаются от эпидермиса и эндотеция. В пыльниках брокколи он представлен одним слоем клеток (рис. 1 А,Б). Развитие этого слоя характеризуется прогрессирующим уплощением клеток. Клетки этого слоя приобретают веретеновидную форму, ядра при этом в них сильно уплощены. Средний слой раньше других начинает подвергаться деструкции и практически полностью разрушается на стадии одно-двуядерной пыльцы (размер бутонов 5,5мм).
Тапетум — это внутренний слой стенки микроспорангия, находящийся в тесном контакте с развивающимися микроспорами. Он является одним из наиболее сложи їх типов растительной клетки и характеризуется значительной специализацией внутриклеточных компонентов (Резникова, 1984).
У капусты тапетум клеточный, секреторного типа. К моменту образования тетрад в пыльниках капусты, клетки тапетума уже становятся двуядерными (рис. 1А, 2). Они заполнены густой, темно окрашиваемой кармином цитоплазмой и вакуоли в них отсутствуют.
Клетки плотно прилегают друг к другу и на поперечных срезах имеют удлиненную в радиальном направлении форму. В дальнейшем тапетальные клетки увеличиваются и становятся почти квадратными в пыльниках, содержащих микроспоры на ранних одноядерных стадиях (размер бутонов примерно 3,5мм) (рис. 1 А, Б). В последующем форма клеток тапетума меняется, происходит уменьшение их радиального размера, клетки растягиваются и уплощаются (рис. 1Г, Д). Уже на стадии одно-двуядерных микроспор (размер бутонов примерно 5,0мм) в клетках тапетума начинают появляться первые признаки деградации. В верхней части клеток наблюдается появление большого числа мелких вакуолей, а цитоплазма становится менее интенсивно окрашенной. В последующем процесс деірадации клеток тапетума усиливается, они становятся плоскими (рис. 1Д, 3), а на внутренней тангентальной поверхности, обращенной в полость гнезда пыльника, наблюдается образование орбикул (в пыльниках из бутонов более 6,5 мм). К моменту раскрытия пыльника клетки тапетума полностью авизируются- Связник пыльника — соединяет два пыльцевых гнезда и занимает обширную среднюю часть пыльника. Он состоит из паренхимной ткани и имеет проводящий пучок, который является продолжением проводящего пучка тычиночной нити. У изучаемых пыльников брокколи со зрелой пыльцой, в клетках основной паренхимы связника было отмечено образование фиброзных утолщений.
Влияние генотипа донорного растения
Несмотря на то, что андрогенез у рода Brassica наиболее изучен по сравнению с другими овощными культурами, имеет место частая непредсказуемость получаемых результатов. Наиболее важным фактором в решении этой проблемы является генотип. Ввиду этого в эксперименты по культуре пыльников необходимо включать, возможно большее количество генотипов исследуемого вида.
Нами было проанализировано 45 генотипов различных видов капусты (табл. 12). У всех этих генотипов мы пытались индуцировать андрогенное развитие, используя 17 вариантов индукционных сред (табл. 2), разнообразные обработки и условия культивирования. Среди исследованных генотипов способность к индукции андрогенеза была выявлена у 6ти генотипов брокколи (Тонус, Аркадия Fb Лазер Fb Emerald Fb Green Valiant, Бр-21), 2х генотипов цветной капусты (ЦВ-1, ЦВ-4), 2х генотипов белокочанной капусты (К-124-0, К-221-9) и у китайской капусты сорта Ласточка. Таким образом процесс индукции андрогенеза в культуре in vitro генетически детерминирован.
Из литературных источников известно, что у цветной капусты одной из основных проблем является различный ответ на условия культивирования пыльников между растениями одного сорта или гибрида (Phippen, Ockendon, 1990). Аналогичная проблема была описана и для брюссельской капусты (Ockendon, 1984). В нашей работе мы решили изучить как влияет генотип индивидуального растения на эмбриогенез в культуре пыльников брокколи.
Это исследование было проведено на 56 донорных растениях сорта «Тонус», выращенных в условиях открытого грунта. На среду для культивирования № 1 высаживалось примерно по 120 пыльников из 20 бутонов, взятых с каждого из 56 растений. На 7 день культивирования был проведен цитологический анализ, для чего в каждом генотипе из 10 пробирок отбиралось по одному пыльнику и приготавливались временные препараты. При анализе этих препаратов определяли процент делящихся микроспор, по которому судили о процессе шщукции спорофитного развития в культуре пыльников in vitro (табл. 13).
Из таблицы 13 видно, что только у 14 из 56 растений (при культивировании пыльников на стандартной для представителей рода Brassica среде) на временных препаратах были обнаружены делящиеся микроспоры. Это составляет лишь 25% от общего количества исследованных растений данного сорта. Кроме того, доля индуцированных микроспор колебалась в очень широких пределах (от 31,2 до 0,3%). Эти данные указывают на то, что эмбриогенная способность может очень сильно различаться между растениями одного сорта, что согласуется с литературными данными, полученными на других видах семейства Капустных. Полученные результаты еще раз подтверждают решающее значение генотипа при эмбриогенезе in vitro и, возможно, объясняют те трудности с которыми сталкиваются при андрогенезе у различных видов капуст.
Эти данные могут также свидетельствовать о том, что используемый сорт не выровнен по андрогенной способности, что и объяснимо, поскольку, селекция велась по другим признакам, возможно, не сцепленным с генами андрогенеза.
Как было уже отмечено в главе 1, процесс андрогенеза находится под сложным генетическим контролем. Следовательно, если у исследуемого генотипа отсутствуют гены контролирующие различные этапы андрогенеза, то индуцировать андрогенез у таких растений без внесения генов андрогенеза путем комбинационного скрещивания с высоко андрогенными генотипами невозможно. В то же время, на наш взгляд, чаще всего на результатах эксперимента сказывается не отсутствие генов, контролирующих образование эмбриоидов, а сложность заключается в недоступности их экспрессии с помощью используемых индукторов эмбриогенеза. Примером могут также служить данные, полученные Шмыковой Н.А в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК при разработке методики клонального микроразмножения капусты, когда наблюдалось одновременное развитие корней из каллуса, образовавшегося из коровой паренхимы, почек из камбиального каллуса, и отсутствие дифференциации из каллусных клеток сердцевины на одном отрезке гипокотиля. В этом случае мы имели дело с одним генотипом, но находящемся на разных уровнях экспрессии генома, которая не выравнивается даже при каллусообразовании. Таким образом, анализ факторов, определяющих гаплопродукцию при андрогенезе in vitro у различных видов капуст, позволяет прийти к выводу, что технология получения андроклинных гаплоидов у любых генотипов должна включать и комплекс экспериментальных воздействий на ход микроспорогенеза.
Культура микроспор
В предыдущих наших экспериментах было показано, что при культивировании происходят изменения не только с микроспорами, но и с соматическими тканями пыльника. Причем, довольно часто, именно развитие соматических тканей приводит к ингибированию процесса андрогенного развития микроспор. Поэтому в дальнейшем были проведены исследования процесса индукции эмбриогенеза в культуре микроспор. Из литературы известно об успешном применении этого метода у Капустных. Впервые эта методика была применена на рапсе (Lichter, 1982), а позже она была опробована и на других представителях рода Brassica.
В эксперименте использовались донорные растения двух гибридов брокколи: Аркадия (Fi) и Лазер (Fi), выращенные в климатической камере при 22С/15С (день/ночь) с 16 часовым фотопериодом. Бутоны для культивирования отбирали с главных соцветий, когда первые цветочные бутоны на соцветии были открыты. Предварительно был подобран оптимальный для оптимальный для культивирования размер бутона, содержащий преимущественно микроспоры на поздней одноядерной стадии развития. Он составил 4,4 - 4,8 мм для обоих генотипов. Применяемая методика культивирования подробно описана в главе 2. На основании анализа литературы, в этом эксперименте мы использовали четыре наиболее часто применяемые в культуре микроспор у представителей рода Brassica среды: 1/2NLN; NLN; ВМ-10; В-5. Цитологический анализ проводили на 21 день культивирования. Его результаты представлены в таблице 21. Часть микроспор за три недели культивирования стала стерильной, в другой же произошли морфогенные изменения (рис. 29), лишь незначительная часть осталась без изменений. Соотношение этих процессов было различным в зависимости от используемой питательной среды и генотипа донорного растения. В культуре микроспор образование эмбриоидов происходило, как за счет делений микроспоры на две равные клетки, так и за счет делений вегетативной клетки (рис. 30). Последний путь развития преобладал в культуре микроспор. В тоже время были обнаружены микроспоры с поделившейся 1-2 раза генеративной клеткой, однако последующих делений в таких структурах не наблюдалось. Образовавшиеся на 21 день культивирования в культуре микроспор эмбриоиды находились на разных стадиях развития - от 2-4 клеток до многоклеточных образований (рис. 31).
Наибольшее количество морфогенной пыльцы образовалось на среде NLN (у Аркадии - 57.03%) и на 1/2NLN (у Лазера - 49.7%) (табл. 21, рис. 32), а меньше всего на среде В - 5, причем у обоих генотипов. Эмбриоиды на этом этапе развивались до глобулярной стадии. Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал (табл. 22), что сила влияния фактора генотипа в данном эксперименте составляет всего лишь 0,87%, а вот сила влияния фактора питательной среды - 92,79%.
Таким образом на процесс индукции эмбриогенного развития в культуре микроспор особенно сильно влияет состав используемой питательной среды. Полученные у обоих генотипов результаты на среде NLN, свидетельствуют о том, что нам удалось добиться довольно высокого уровня индукции, которого нам не удавалось достичь в культуре пыльников, какие бы питательные среды и индуцирующие факторы мы не применяли. Тот факт, что использование среды NLN в культуре пыльников у этих же генотипов не приводил к таким высоким результатам (индукция была почти в 10 раз ниже), может свидетельствовать в пользу того, что соматические ткани оказывают определенное ингибирущее действие на процесс эмбриогенеза. Интересным был и тот факт, что в культуре микроспор наблюдали несколько путей спорофитного развития, в то время как в культуре пыльников встречался только один - деление на две равных клетки.
