Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Значение клевера как кормовой культуры; проблемы селекции клевера 9
1.2. Системы молекулярного маркирования генома 13
1.3. Использование молекулярных маркеров в современной селекции 26
1.4. Генетические карты и их использование в селекции растений 32
2. Материалы и методы исследований 38
3. Результаты исследований 53
Глава 3.1. Описание и поддержание экспериментальной популяции клевера лугового ГП-27 53
3.1.1. Оценка фенотипического варьирования признаков 53
3.1.2. Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro 55
Глава 3.2. Молекулярный анализ и создание генетической карты сцепления клевера лугового 61
3.2.1. Оптимизация условий выделения ДНК из растительной ткани клевера 61
3.2.2. Сравнительный анализ различных систем молекулярного маркирования 67
3.2.3. Оптимизация условий и параметров PCR с использованием рандомных праймеров (RAPD-PCR) 68
3.2.4. Использование праймеров с дополнительным селективным нуклеотидом для повышения надёжности RAPD-маркеров 74
3.2.5. Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология) 79
3.2.6. Детекция ДНК-полиморфизма с помощью CAPS-маркеров 87
3.2.7. Использование ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового (Trifolium pratense L.) 91
Глава 3.3. Анализ косегрегации полученных ДНК-маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений 93
3.3.1. Оценка зимостойкости гибридной популяции ГП-27 в различных условиях 93
3.3.2. Оценка устойчивости к склеротиниозу (Sclerotinia trifoliorum Erikss.) 96
3.3.3. Детекция локусов генов, связанных с признаками устойчивости и локализация их на интегрированной генетической карте 99
3.3.4. Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового 100
Выводы 105
Предложения для селекционной практики 108
Список используемой литературы 109
Приложения 129
- Системы молекулярного маркирования генома
- Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro
- Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология)
- Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового
Введение к работе
Актуальность темы. Клевер луговой, в силу своей биологической природы, является одним из труднейших объектов селекции. Он имеет многолетний цикл развития, высокую гетерогенность внутри вида и в отдельных его популяциях, перекрестный энтомофильный тип опыления и существенную зависимость экспрессии основных признаков и свойств от условий внешней среды. Все это снижает точность оценки исходного материала, эффективность отбора и увеличивает сроки селекционных программ, материальные и финансовые затраты. Поэтому разработка и применение новых методов селекции клевера, позволяющих проводить ускоренный анализ непосредственно на уровне ДНК, в сочетании с огромным опытом селекционной работы с этой культурой (Навалихина, 1977; Новоселова, 1986; Новоселов, 1999), может значительно повысить эффективность селекции, открывает новые возможности для создания высокоурожайных форм и сортов, устойчивых к болезням и вредителям.
В настоящее время широкое распространение приобретает метод использования ДНК-технологий, в частности, PCR-анализ, основанный на амплификации ДНК. Метод достаточно прост, обладает большой чувствительностью и дает быстрые результаты. Молекулярные маркеры, генерируемые с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), позволяют оценить генетическое разнообразие исходного материала, классифицировать селекционные формы, маркировать гены хозяйственно важных признаков, картировать геномы.
Однако исследования по разработке молекулярных маркёров и применению их в селекции кормовых культур стали появляться только в последние годы. Они немногочисленны, охватывают не все виды растений, условия ДНК-анализа, в большинстве случаев, нуждаются в оптимизации. К началу нашей работы в отечественных и зарубежных источниках литературы не встречались данные о применении ДНК-маркеров (на основе PCR- и RFLP-методов) для исследований клевера лугового. Поэтому разработка системного подхода к ДНК-анализу этой культуры и применение результатов в селекционных программах является актуальной научной задачей.
Целью настоящей работы являлось определение оптимальных условий молекулярно-биологических методик исследований для клевера лугового; изучение использования ДНК-маркеров для оценки генетического полиморфизма и маркирования селекционно-ценных признаков, а также выделение новых источников для практической селекции.
В задачи исследований входило:
1. Изучить экспериментальную гибридную популяцию клевера лугового ГП-27 по основным морфобиологическим показателям. 2. Определить возможность и условия использования метода кл овального
мюсроразмножения для обеспечения максимального < о ррфаищн ОПАЛЬНАЯ
С. Пел
$даз
исходного генетического материала клевера лугового.
Установить оптимальные условия выделения ДНК из растительной ткани клевера и наилучшие параметры амплификации ДНК.
Провести сравнительный анализ применения различных систем молекулярного маркирования для оценки ДНК-полиморфизма в популяции клевера ГП-27.
Оценить возможность использования полученных ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового.
Провести анализ косегрегации ДНК-маркеров с фенотипическими характеристиками для выявления локусов генов хозяйственно ценных признаков клевера лугового.
Выделить новые селекционные источники.
Научная новизна результатов исследований. Впервые показана принципиальная возможность применения ряда ДНК-технологий для генетического анализа клевера лугового.
Определены оптимальные условия выделения ДНК, параметры амплификации и состав реакционной смеси для полимеразной цепной реакции применительно к культуре клевера лугового. Изучены возможности и перспективы использования различных систем молекулярного маркирования для выявления внутрипопуляционного полиморфизма в экспериментальной клеверной популяции.
Разработан способ повышения надежности RAPD -маркеров, позволяющий улучшить воспроизводимость и стабильность результатов RAPD-анализа.
На основе проведенных исследований, в совместном проекте со специалистами Японии (NARCH), разработана первая генетическая карта клевера лугового; результаты STS- и RAPD- маркирования использованы для насыщения базовой карты дополнительными маркерами.
Практическая ценность работы. Определен способ и условия сохранения и поддержания гетерогенного исходного материала для обеспечения непрерывности и воспроизводимости молекулярно-биологических исследований.
Выделены 8 RAPD и 3 STS-генетических маркеров; показана принципиальная возможность ДНК-маркирования хозяйственно ценных признаков клевера лугового для повышения эффективности и ускорения селекционного процесса.
На основе выявленной связи полученных генетических маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений в популяции ГП-27 установлены 7 локусов устойчивости к склеротиниозу и зимостойкости, размещенных на базовой генетической карте клевера лугового.
В результате изучения исходной популяции клевера в различных
условиях по основным морфобиологическим показателям выделены новые
источники хозяйственно-ценных признаков: зимостойкости,
раннеспелости - и устойчивости к склеротиниозу для использования в селекционной практике.
Апробация результатов исследований. Основные положения
диссертационной работы бьши доложены на Международной конференции Functional Genomics and Breeding Strategies for Cold tolerance in Plants (Sapporo, Japan, 2003); на 5 Международном Симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пушино, 2003); на научной генетической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения АР. Жебрака (Московская Сельскохозяйственная Академия им. Тимирязева, 2002), на ежегодных отчетах научно-технического совета селекцентра ВНИИ кормов в 2000-2003 годах.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и предложений селекционной практике. Содержит 10 таблиц, 22 рисунка и 7 приложений. Список литературы включает 180 наименований, из них 113 —зарубежныхизданий.
Системы молекулярного маркирования генома
В настоящее время существует два основных методологических подхода к проблеме выявления полиморфизма геномов и маркирования полиморфных участков ДНК. Принципиальное различие технологий - в используемой системе детекции полиморфизма: расщепление геномной ДНК различными рестрикционными эндонуклеазами с последующей гибридизацией с мечеными зондами или амплификация участков ДНК с помощью ДНК-полимеразы in vitro.
Первый подход основан на использовании явления полиморфизма длины рестрикционных фрагментов,- так называемый, RFLP-анализ. Второй включает использование методов на основе полимеразной цепной реакции -PCR. Метод заключается в амплификации (многократном умножении) фрагментов ДНК in vitro. Развитие PCR-технологии привело к созданию большого числа техник и систем маркирования, широко применяемых в популяционных или генетико-селекционных исследованиях.
Многочисленные ДНК-маркёры различаются не только системой детекции полиморфных участков, но и по другим параметрам. Так, они могут детектировать единственный локус или множественные локусы, требуют, предварительной информации о сиквенсе (последовательности нуклеотидов) или создаются при отсутствии таких данных. В конечном итоге, основными критериями, отличающими.маркёры, генерированные в процессе RFLP- или? PCR-анализа, являются (Forster et al., 2002):
а) степень надёжности;
б) трудоёмкость;
в) стоимость;
г) природа полиморфизма, который они выявляют.
Для успешного решения поставленных задач молекулярные маркёры, по мнению ряда исследователей, должны отвечать определённым требованиям (Конарев 1983; Созинов, 1985). В частности, надёжность маркёра характеризуется следующими показателями:
1. Высокий уровень полиморфизма;
2. Кодоминантный характер наследования;
3; Оптимальный уровень частоты встречаемости в геноме по хромосомам;
4. Селективно нейтральное поведение;
5. Лёгкая оценка параметров маркёра и возможность автоматизации этой оценки;
6. Высокая воспроизводимость результатов и повторяемость опытов, т.е. возможность стандартизации метода (Karp et al., 1991);
7. Возможность осуществления обмена данными между лабораториями (Созинов, 1985).
На сегодняшний день не существует идеальных молекулярных маркёров, которые полностью бы соответствовали перечисленным требованиям (Weising et al., 1995). В результате за последние несколько лет появилось множество технологий и модификаций техник маркирования на основе RFLP-анализа и РСКАметода. Для каждой методики характерны определенные преимущества и недостатки, что и обусловливает применение их в соответствии с целью исследований и особенностями генетической структуры исследуемого генома.
Так, перекрёстноопыляемая репродуктивная система клевера белого {Trifolium repens L.) и лугового (Trifolium pratense L.) обеспечивает высокий уровень внутрипопуляционнои и межпопуляционной изменчивости. Из-за высокой гетерозиготносте индивидуальных генотипов можно наблюдать сегрегацию до 4-х различных аллелей на один локус в результате скрещивания. Следовательно, для мониторинга наследственности множественных аллелей гена необходимы мультиаллельные кодоминантные генетические маркёры (Spandenberg et al., 2000). Наилучшим образом этим критериям отвечают молекулярные маркерные системы, основанные на RFLP- и SSR-технологиях.
Метод RFLP (restriction fragment length polymorphism) или полиморфизм длины фрагментов рестрикции разработан в 1980 году (Botstein et al., 1980). Различия между индивидуумами обусловлены мутациями, которые приводят к появлению или исчезновению сайта рестрикции, а также мутациями, вызванными вставками или делециями блоков нуклеотидов. Полученные фрагменты рестрикции разделяют с помощью электрофореза, et al., 1990); маркирование хозяйственно ценных признаков (Tsarouhas et al., 2002); филогенетические исследования (Miller and Tanksley, 1990). RFLP маркеры были использованы для создания генетических карт кукурузы (Helentjaris, 1987), картофеля (Gebhardt et al., 1989), риса (McGoucb et al., 1988); ячменя (Heun et al., 1991) и пшеницы (Liu and Tsunewaki, 1991).
Однако, в экспериментах с кормовыми культурами RFLP-анализ, при всех его бесспорных достоинствах, недостаточно распространённая методика. Это связано с его дороговизной и трудоёмкостью. Первые публикации относятся к 1993 году, в связи с созданием исходной генетической карты люцерны {Medicago sativa L.) (Brummer et al., 1993; Kiss et al., 1993). В ї 1994 году Кидвелл с сотрудниками дана оценка генетического родства между видами Medicago sativa L.. (Kidwell et al., 1994), а в 2000 году проведена сортовая идентификация вида Medicago sativa L. (Labomhardaetal.,, 2000) на основе RFLP-анализа.
PGR (polymerase chain reaction) - более современный, чем RFLP, метод ДНК-технологий; предполагает анализ полиморфизма, детектированного в результате полимеразной цепной реакции. Этот, сравнительно простой, и дешёвый метод молекулярной биологии был разработан Кэрри? Мюллис с сотрудниками в 1985 году в одной; из; лабораторий США (Mullis, 1986). В основе его лежит принцип амплификации. (умножения) специфических для каждого генотипа участков ДНК посредством реакции, отличающейся высокой чувствительностью. Амплификация происходит с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК и синтетических олигонуклеотидов-праймеров. В результате реакции, состоящей из повторяющихся циклов денатурации, синтеза и элонгации (удлинения) цепи, образуются; участки ДНК (обычно длиной от 200 до 3000 нуклеиновых оснований), которые разделяют гель-электрофорезом, получая высокоспецифичную картину (fingerprint), идентифицирующую оцениваемый генотип. Полиморфизм по спектру разделённой электрофорезом ДНК может быть использован для молекулярного маркирования: полоса (band), присутствующая в одном образце и отсутствующая или отличающаяся по- молекулярному весу от другого, служит молекулярным маркёром. Интересующий- фрагмент ДНК далее может быть использован непосредственно или клонирован и секвенирован с помощью стандартных методов (Вартапетян, 1991).
В сравнении с RFLP-анализом методы, основанные на PCR-технологии, требуют значительно меньших количеств ДНК для тестирования, отпадает необходимость в поддержании библиотеки клонов для гибридизационных зондов, исключается работа с радиоактивными изотопами.
Благодаря простоте и доступности PCR-анализ всё шире используется не только в области молекулярно-генетических исследований, но и для; решения разнообразных задач прикладной генетики- и селекции растений (Дорохов, Лаптева, 1997). С момента изобретения полимеразной цепной реакции в научной литературе появилось более 100 публикаций, включающих различные модификации, улучшения и новые области применения PGR (Guevara-Gakcia et al., 1997).
Основные направления использования это: диагностика генетических заболеваний, индуцированный мутагенез,, клонирование генов- создание насыщенных генетических карт, маркирование признаков, идентификация сортов и генотипов (Quiros et all, 1992). Открываются большие перспективы применения этой.группы маркёров в селекции кормовых культур (Kiss et al., 1993; Osborn et al;, 1997; SpangenbergetaL, 1998; Forster et al., 2000). В зависимости от природы используемых праймеров и способа идентификации продуктов амплификации существуют различные модификации PCR технологии. Так как главным недостатком использования PCR для генетического анализа является необходимость информации о нуклеотидном сиквенсе амплифицируемого участка и незначительный уровень ДНК полиморфизма,- был разработан ряд методов, основанных на; PCRj но способных преодолеть указанные проблемы.
Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro
Известно, что клевер луговой - культура с ограниченным сроком возделывания (1-2 года), требовательная к условиям выращивания и срезки. А молекулярный анализ, как правило, является трудоемким и длительным процессом, требующим многократных повторных экспериментов для обеспечения воспроизводимости и надёжности результатов.
Точность анализов в немалой степени зависит от качества и чистоты образцов- геномной ДНК, на что, в свою очередь, оказывает влияние состояние и фаза развития растения, из которого выделяют ДНК. Кроме того, исследования по выявлению ДНК-маркеров хозяйственно-ценных признаков требуют наличия; анализируемых индивидуальностей в нескольких повторностях. Сохранение, исходного генотипа возможно только при вегетативном размножении, однако черенкование не всегда эффективно для клевера. Отрицательным моментом подобного способа является также накопление и передача инфекции в размножаемом материале.
В связи с этим, для обеспечения сохранности и однородности исходного генетического материала на весь срок исследований, мы вводили индивидуальные растения популяции ГП-27 в культуру in vitro и осуществляли клональное микроразмножение в соответствии с: методикой, разработанной для клевера лугового (Мезенцев, Любавина, 1983). Эта работа выполнялась на базе отдела биотехнологии ВНИИ кормов. В результате была создана коллекция; клонов из 1000 пробирочных растений разной стадии развития (рис. 5), в среднем, по 5 растений каждого генотипа.
Клоны культивировали в камере искусственного климата «Sherer» в контролируемых условиях,, полученные растения-регенеранты высаживали в почву и использовали для исследований. В процессе культивирования in vitro наблюдали высокую степень гетерогенности внутри изучаемой популяции клевера по морфогенетическому потенциалу.
Часть генотипов 20 из 167 (11,9 %) отличалась медленным циклом развития и регенерации из пазушных почек и требовала 4-5 пассажей для роста на среде Гамборга с добавлением БАЛ - 2 мг/л. Полученные из эксплантов; этих растений регенераты имели пониженную жизнеспособность (слаборазвитая корневая система, деформированные стебли). После 3 лет культивирования in vitro часть клонов (11 из 20) была потеряна вследствие низкого уровня регенерационного потенциала введённых в культуру растений и гибели исходных генотипов.
Большая часть генотипов популяции - 75 из 167 или 44,0% имели среднюю степень регенерационной способности и развития из пазушных почек. Из таких генотипов за короткий срок регенерации (2-3 пассажа на среде с добавлением БАП-2 мг/л и затем 1 пассаж с НУК-0,05 мг/л) получали растения-регенеранты, готовые к высадке в почву (табл. 3).
Относительно высокой интенсивностью размножения отличались 72 генотипа популяции или 43,1%. Растения-регенеранты были получены из эксплантов этих генотипов в процессе 1-2-х кратного субкультивирования на среде для микроразмножения (с добавлением БАП) и однократного пассажа на среде для корнеобразования (с НУК-0,05 мг/л). Общий срок регенерации таких генотипов,- от введения в культуру in vitro до высадки в почву,- занимал в среднем 1,5 месяца. Культивирование клонов в течение короткого срока на низком гормональном фоне обеспечивало сокращение сроков подготовки и проведения экспериментов и значительно снижало вероятность накопления сомаклональных изменений на уровне генотипа (Куренина, 2003). Это особенно важно для молекулярных исследований гетерозиготных культур, к каким относится клевер. Иногда длительно пассируемые культуры утрачивают способность к морфогенезу, поэтому для поддержания клонов в течение длительного: периода для наших исследований возобновляли культуру повторным; введением in vitro эксплантов исходных растений. Метод обеспечивал оздоровление от грибной и бактериальной инфекции и сохранение 147 генотипов популяции (88% от изначально введенных в культуру), экономию площади для содержания опытных образцов и сокращение сроков получения растений, идентичных исходным, для QTL-анализа.
Таким образом, метод поддержания популяции в культуре in vitro можно рекомендовать, как оптимальный способ сохранения и возобновления однородного по возрасту и условиям выращивания генетического материала при проведении молекулярно-генетических исследований на клевере луговом.
Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология)
Несмотря на определенные достоинства RAPD-техники; она имеет ряд ограничений, связанных с недостаточной информативностью системы (доминантный характер наследования маркеров и случайный отжиг праймеров на неизвестных участках генома). Так называемая «целенаправленная» PCR, или PCR сайта известной нуклеотидной последовательности (STS) предполагает использование праймеров, гомологичных к заданным? специфическим областям и детектирует единственный, уникальный; участок генома с определённым сиквенсом. Амплификация специфических ДНК-фрагментов обычно происходит в процессе реакции, аналогичной RAPD-PCR, но при более высокой температуре отжига с использованием более длинных праймеров.
STS-праймеры для наших исследований были разработаны сотрудниками NARCH с применением двух подходов:
1) на основе информации о нуклеотидной последовательности генов, депонированной в базах данных GenBankNCBI rwww.ncbi.nlm.nih.gov/ Gverview.html);
2) на основе нуклеотидной последовательности генов, клонированных и секвенированных в лаборатории селекции кормовых бобовых трав NARGH (Ivashuta et ah, 2002).
Исходя из данных об экспрессии этих генов, большинство из них, возможно, вовлечены в процесс акклиматизации кормовых бобовых трав к холоду (Hughes, Dunn, 1996; Wolfraim et al., 1993; Ivashuta et al., 2002). Для PCR-амплификации этих генов был синтезирован ряд праймеров длиной 17 - 25-нуклеотидов (Ivashuta et al., 2002). При жёстких условиях PCR сиквенс-специфичные праймеры амплифицируют определённый участок образца генома. Мы предприняли попытку использовать праймеры, большинство из которых основаны на нуклеотидном сиквенсе люцерны, вследствие того, что имеется существенная гомология в сиквенсе многих генов; люцерны и клевера. В то же время, на сегодняшний день информации о геноме клевера недостаточно, чтобы синтезировать большое количество STS-праймеров. Всего на популяции клевера мы испытали 45 STS-праймеров. Для амплификации использовали программируемый термоцикл ер («Perkin Elmer», USA) на 96 пробирок (объемом 200 мкл) и набор реактивов этой же фирмы. Состав реакционной смеет был аналогичен применяемому в RAPD-анализе, но с уменьшенной концентрацией MgC в буфере (1,5 тМ вместо 2,5 тМ), повышена температура отжига праймеров до 45 - 50 С.
При анализе было отмечено значительное влияние изменений в параметрах PCR на характер амплификации. Для некоторых праймеров изначально высокая температура отжига (50С и выше) вызывала отсутствие продуктов амплификации или только слабые следы их. Это можно объяснить неполной комплементарностью праймеров, дизайн которых осуществлен на основе информации о сиквенсе генов люцерны, с генами клевера. Была предпринята попытка улучшить гибридизацию праймеров на неполностью комплементарной ДНК клевера за счет небольшого снижения специфичности, в частности, путем изменения температуры отжига. В результате последовательного снижения температурных условий удавалось получить удовлетворительную амплификацию в большинстве случаев (рис. 14). Так как от температуры отжига зависела и специфичность амплификации, то при снижении температуры (до 45-43С) появлялись неспецифичные полосы амплифицированной ДНК, аналогичные RAPD-профилям при реакциях с рандомными праймерами (рис 146). Эти дополнительные продукты PCR в ряде случаев могут нести полезную информацию по выявлению ДНК-полиморфизма. При этом среди них возможно обнаружить маркеры, связанные с геном, на основе структуры которого праймер был разработан. по сиквенс-гомологии с генами, участвующими во многих функционально важных физиологических процессах в растениях. Это отражено в названии гена-или г в ссылке на функцию, которую он выполняет. Анализ результатов показал, что большинство праймеров; (39 из: 45 испытанных) генерировали продукты амплификации, различной интенсивности. Мы обнаружили умеренный; ДНК-полиморфизм В; исследуемой популяции клевера. Из 39 информативных праймеров (одиночных и в парных комбинациях) 5 детектировали полиморфизм с сегрегацией в потомстве, что составило 12,8% (рис. 156). Є праймерами PhKinF/PhKinR; SiCasl7F/SiCasl7R;-PBSMCIRE, MsnatF2/MsnatR5 A, AP8b 12F/AP8b 12R проведён і анализ всех 167 генотипов популяции; Общее количество амплифицированных фрагментов ДНК составило 918, из них полиморфных полос - 36, в среднем, 12 на праймер.
Как показала: практика, длинные олигонуклеотидные праймеры продуцировали больше полиморфных полос, чем: 10-мерные, что согласуется; с данными литературных источников (Ye et al., 1996). Размер продуктов PGR варьировал от 400-1000 нуклеотидных пар с праймером PhKinF/PhKinR до 200-1700 и 300-900 пар нуклеотидов для праймеров SiCasl7F/SiGasl7R и PBSMCIRE соответственно.
Интересные результаты получены при анализе популяции со специфическим праймером PBSMCIRE (рис. 15в). Этот праймер относится к группе праймеров, основанных, на сиквенсе индуцируемых холодом,-тандемно расположенных ретротранспозонов (мобильных элементов генома) люцерны (Ivashuta et al;, 2002). Большое количество амплифицированных фрагментов ДНК с разбросом в размере от 200 до 1700 нуклеотидных пар по всему геному, видимо,, можно объяснить тем, что амплификацию в данном случае генерировали несколько генов семейства, а не одиночный ген.
Маркеры, генерированные праймерной парой MsnatF2/MsnatR5A, помещены на интегрированной генетической карте клевера лугового в группах сцепления LG4 и LG5J а детектированные с помощью праймеров PBSMCIRE и SiCasl7F/SiCasl7R локализованы в LG6 и LG7 группах сцепления (Isobe et al., unpublished).
Поскольку дизайн, этих праймеров также осуществлён на основе генов, экспрессирующихся в растении при воздействии холодом (Ivashuta et al., 2002), можно предположить определённую связь выявленных маркеров с локусами признаков холодостойкости.
Часть STS-праймеров, протестированных на популяции ГП-27, создана на основе сиквенс-информации, депонированной в базе данных GenBank, о генах-кандидатах устойчивости к болезням в люцерне. Учитывая значительный уровень гомологии, в нуклеотидных последовательностях генов люцерны и клевера, осуществили генотипирование популяции ГП-27 для выявления специфичных фрагментов устойчивости к склеротиниозу. Анализ показал, что из 11 STS-праймеров? этой группы 8 генерировали. продукты: амплификации,. но только с праймерной парой АР8Ь12F/AP8b 12R получен выраженный полиморфизм (таблица 7а). Предполагается провести валидизацию, т.е. проверку работоспособности полученных ДНК-маркеров на генотипах популяции, отобранных в качестве форм с повышенной, устойчивостью к S.trifoliorum, и использовать указанный специфичный-праймер в QTL-анализе родственной клеверной популяции (Faris, etal., 1999).
На основе STS-маркёров мы осуществили предварительный QTL-анализ экспериментальной клеверной популяции ГП-27 по признакам зимостойкости и устойчивости к Sclerotinia trifoliorum Erikks. (Klimenko et al;, 2003).
На базе лаборатории геномного анализа ВНИИ кормов начаты исследования по генотипированию популяций клевера с использованием SSR-праймеров (разновидность STS-маркирования), разработанных в Институте исследований ДНК (Kazusa DNA Research Institute) в Токио. SSR-праймеры или микросателлиты отличаются высоким уровнем детекции полиморфизма, успешно используются для создания высоконасыщенной карты сцепления клевера (Isobeet al., 2004).и анализа важных для селекции признаков.
Полученные результаты позволяют сделать вывод об эффективности STS маркирования в исследованиях по селекции клевера лугового на устойчивость к воздействию стрессовых факторов. Специфичные фрагменты амплификации, присутствующие в спектрах некоторых генотипов, могут быть использованы в качестве ДНК-маркеров генов хозяйственно ценных признаков.
Основным недостатком STS-маркирования является низкий уровень ДНК-полиморфизма амплифицируемых участков генома, особенно, когда; речь идет о консервативных генах. В наших исследованиях часть STS праймеров (11 из 34) не показали полиморфизм, но продуцировали отчётливую амплификацию с выраженной мажорной полосой (рис. 15а). Были поставлены экспериментальные реакции по изучению; возможности использования таких праймеров для генерации CAPS-маркеров.
Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового
Наряду с ДНК-анализом, направленным на разработку молекулярных маркеров и локализацию на генетической карте QTLs хозяйственно ценных признаков, был проведен отбор перспективного селекционного материала клевера лугового. В результате лабораторных, вегетационных и полевых опытов в разных эколого-географических условиях (центральный район России и Хоккайдо-Япония), из, состава популяции ГП-27 были выделены генотипы, представляющие определенный интерес для использования в селекции по признакам раннеспелости, зимостойкости и устойчивости к раку.
В июне-июле 2001 и 2002 годов провели учет сроков начала цветения для генотипов популяции ГП-27 в полевых условиях Хоккайдо. Наблюдали смещение даты цветения в 2002 году на более поздние сроки, в среднем, на 10-14 дней (приложение 4). Корреляция между показателем по двум годам наблюдений; составила г=0,45 .В число раннеспелых выделены 5 генотипов, цветение которых приходилось на первую декаду июля: R70 - цветение Іиюля 2001 и 10 июля 2002 года; R76 - 6 июля и 10 июля соответственно; R77 - 5 и 10 июля; R107 -6 и 7 июля и R129 - 9 июля 2001 и 10 июля 2002 года.
Следует отметить, что часть генотипов гибридной популяции ГП-27 обладала повышенной зимостойкостью при оценке в разных условиях с применением различных методик. По? наблюдениям на растениях второго» года пользования на экспериментальном участке ВНИИ кормов из высаженных 400 растений число, перезимовавших равнялось 291 (72,8%). Средний показатель зимостойкости для популяции составил 73,7%. Выделены генотипы с уровнем зимостойкости, превышающим средний показатель на 10-20%. Наиболее перспективными после первой перезимовки проявили себя 34 генотипа. В условиях Хоккайдо выделены 26 лучших генотипов из 13 5 высаженных, с показателем зимостойкости выше среднего уровня (данные представлены в приложении 6).
Для селекционной работы заслуживают внимания 11 генотипов с относительно высоким уровнем зимостойкости (выше среднего значения по всей популяции), как в условиях России, так и Японии: родительские формы WF1680, и 272 и потомство R18, R43, R49, R70, R76, R84, R107, R118, R144 (табл. 10)..
Создание устойчивых к болезням селекционных сортов является важнейшим средством защиты клевера от болезней. Поэтому повышение устойчивости к болезням и вредителям клевера - неотъемлемая составная часть селекционного процесса (Новоселова, 1986). Исследования, проведенные на популяции ГП-27, предполагали оценку исходного материала по устойчивости к склеротиниозу, отбор перспективных образцов, их анализ в условиях искусственной инокуляции в поле и генотипирование для подбора генов-кандидатов устойчивости к болезням.
Метод ускоренной оценки в лабораторных условиях позволил сократить объем работы и сроки получения предварительной информации об устойчивости исследуемого материала к раку клевера. В лабораторном опыте выделены генотипы клевера лугового, проявившие степень поражения раком ниже, чем у стандарта ВИК-7 (42,5%). В среднем, показатели пораженности, раком были і ниже стандарта на 8,7% (приложение 7). Слабо пораженными культуральной жидкостью патогена оказались 13 генотипов из 72, прошедших оценку методом экспресс-диагностики:
В 2003 году был заложен полевой опыт на естественном фоне заражения (24,2%). Распространенность рака для стандарта (ВИК-7) после первой; перезимовки составила 46,3%. Выявлены 7 генотипов, проявивших слабую и среднюю восприимчивость к патогену (ниже стандарта на 10-20%): R76, R105, R124, R130, R132; и генотипы без симптомов поражения (R28, R63; R95),. которые представляют ценный исходный материал для селекции на устойчивость к раку клевера. По результатам лабораторного и полевого опыта после первой перезимовки выделены 8 генотипов, проявивших повышенную устойчивость к болезни: R16, R18; R63; R76, R77, R95, R105, R132. Среди генотипов экспериментальной;популяции 5 растений обладали комплексной устойчивостью t к ряду заболеваний (рак, фузариоз, аскохитоз, мучнистая роса, бурая пятнистость) по оценке в полевых условиях и относительной устойчивостью к мицелиальной жидкости возбудителя; в лабораторном опыте: R16, R18, R76, R95, R105. Эти образцы высажены в сосуды і для продолжения исследований. В частности, предполагается провести генотипирование растений и сравнить полученные спектры с профилями генов-кандидатов из базы данных GenBank, ответственных за устойчивость к болезням для разных культур. Заложен полевой опыт (семенной материал и клонально размноженные генотипы) на родственной клеверной популяции с использованием искусственного фона заражения.
Характеристика перспективных образцов, выделенных из состава популяции ГП-27 по ряду признаков приводится в таблице 10.
Из таблицы 10 следует, что некоторые из выделенных образцов обладали комплексом хозяйственно ценных признаков. Так, генотип R76 отличался раннеспелостью и устойчивостью к условиям перезимовки и склеротиниозу; в генотипах R70 и R107 сочетались повышенная зимостойкость с раннеспелостью; в R77 — раннеспелость с устойчивостью к раку; R18 — лучший по признакам устойчивости к раку ш зимостойкости. Указанные образцы могут служить ценным исходным материалом в селекции клевера лугового на устойчивость к склеротиниозу и по другим хозяйственно важным признакам.
Сочетание традиционных методов селекции и современных ДНК-технологий позволит повысить эффективность и ускорить процесс создания перспективных форм и сортов клевера лугового.
