Введение к работе
Актуальность темы. Потенциальный урожай семян подсолнечника достигает 4 т/га, в то время как фактическая урожайность по России в последние годы была около 1 т/га. Такие значительные потери урожая семян объясняются нарушением технологии выращивания подсолнечника, в частности распространением сорняков, а также влиянием болезней и вредителей. Сорняки могут снижать урожайность подсолнечника на 0,2-0,5 т/га или на 10-17 % в зависимости от уровня агрофона (Васильев Д.С., 1983). Тем не менее, правильный подбор гербицидов к определённой культуре позволяет добиться высоких результатов в борьбе с сорной растительностью. В перечень распространённых сорняков подсолнечника, причиняющих существенный ущерб, включаются: амброзия полыннолистная, канатник Теофраста, дурнишник обыкновенный, марь белая, осот розовый и различные виды щирицы. В связи с этим, большой интерес представляет группа системных гербицидов - имидазолинонов, хорошо зарекомендовавшая себя в борьбе с вышеперечисленными сорняками (Захаренко В.А., 1990). Однако, применение гербицидов этой группы на подсолнечнике было невозможным вследствие чувствительности этой культуры к имидазолинонам. В 1996 г. в Канзасе (США) на поле, обрабатываемом в течение 7 лет имазетапиром, в популяции дикорастущего подсолнечника Helianthus annum L. были впервые обнаружены устойчивые к имидазолинонам растения (Baumgartner J.R. et al., 1999). Путём скрещиваний этот признак был перенесён с устойчивых дикорастущих растений на линии культурного подсолнечника НА425 и RHA426. Таким образом, спонтанная мутация устойчивости к имидазолиноновым гербицидам, найденная в популяции дикорастущего подсолнечника, открывает новую возможность борьбы с распространением сорняков, включая и новые агрессивные расы заразихи. В России аналогичные исследования по созданию и изучению гербицидоустойчивых линий и гибридов подсолнечника не проводились.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось селекционно-генетическое изучение признака устойчивости к имидазолиноновым гербицидам у подсолнечника.
Для достижения цели необходимо выполнение следующих задач:
- исследовать генетическую коллекцию подсолнечника ВНИИМК по
устойчивости к имидазолиноновым гербицидам;
- изучить наследование признака гербицидоустойчивости;
- создать отечественный селекционный материал, устойчивый к
имидазолиноновым гербицидам.
Научная новизна исследований. Впервые установлено отсутствие генов устойчивости к имидазолинонам у образцов культурного подсолнечника различного происхождения генетической коллекции ВНИИМК. Между гербицидоустойчивыми и восприимчивыми растениями не обнаружено различий в росте корешков проростков при их обработке гербицидом Пульсар. Наследование устойчивости к имидазолинонам при скрещивании доноров признака с селекционными линиями ВНИИМК соответствовало моногенной схеме с неполным доминированием устойчивости. Гетерозиготные особи относились к промежуточному фенотипическому классу толерантных по устойчивости растений. Эффект гена-модификатора не обнаружен. Ген гербицидоустойчивости Imr наследовался независимо от мутаций, определяющих качество масла семян - высокоолеиновости Ol, повышенного содержания Р-токоферола tphl и у-токоферола tph2.
Практическая значимость и реализация результатов исследований. Создано 22 константные по устойчивости к имидазолиноновым гербицидам В-линии F6 НА425хВК876. Десять из них обладают высокоолеиновостью масла, а 16 - изменённым составом токоферолов в семенах. При этом семь линий характеризуются рекомбинационным объединением гена гербицидоустойчивости с генами, контролирующими состав жирных кислот и токоферолов в масле семян. Также получены 22 константные гербицидоустойчивые R-линии F6 RHA426xBK508. Все они являются
ветвистыми, а две из них - высокоолеиновыми. Эти линии подсолнечника представляют собой первый отечественный селекционный материал, обладающий устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. Основные положения, выносимые на защиту:
- константные имидазолиноно-устойчивые линии подсолнечника селекции
ВНИИМК;
отсутствие доноров устойчивости к имидазолинонам в образцах подсолнечника различного происхождения из коллекции ВНИИМК;
наследование гербицидоустойчивости как моногенного признака с неполным доминированием;
- независимое наследование гена Imr и мутаций качества масла семян - Ol,
tphl и tph2.
Апробация работы и публикация результатов исследований. Результаты работы докладывались на совещании по подсолнечнику FAO, 17-20 июля, 2005 г., Нови Сад, Сербия; VII Региональной научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса", 8-9 декабря 2005 г., Краснодар; III Международной научной конференции молодых учёных "Інноваційні напрямки наукової діяльності молодих вчених в галузі рослинництва", 20-22 июня 2006 г., Харьков, Украина; III Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов "Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах", 2-5 октября, 2006 г., Анапа; VIII Региональной научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса", 7-8 декабря, 2006 г., Краснодар; 4-ой Международной конференции молодых учёных и специалистов "Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур", 27-29 марта, 2007 г., Краснодар; IV Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов "Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах", \А октября,2007 г., Анапа; I Всероссийской научно-практической конференции молодых
учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса", 14-16 ноября, 2007 г., Краснодар; V Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов "Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах", 1-5 октября, 2008 г., Анапа; 5-ой Международной конференции молодых учёных и специалистов "Перспективные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур", 3-6 февраля, 2009 г., Краснодар.
По материалам диссертации опубликовано 10 научных статей, в том числе одна статья в реферируемом издании, рекомендованном ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, рекомендаций для селекционной практики, списка литературы и приложений. В тексте содержится 21 таблица, 16 рисунков, 1 формула и 8 приложений. Список литературы включает 144 источника, в том числе 38 на иностранных языках.
Условия, исходный материал и методы проведения исследований. Исследования проводили на центральной экспериментальной базе (ЦЭБ) ВНИИ масличных культур им. B.C. Пустовойта (ВНИИМК), г. Краснодар в лаборатории генетики в 2003-2008 гг.
Почва опытных полей института представлена чернозёмом выщелоченным слабогумусным сверхмощным легкоглинистым. В пахотном слое почвы содержится 3,3-3,5 % гумуса. Температура воздуха летом в годы проведения экспериментов была близка к среднемноголетним данным и составляла 23,7 С. Средняя сумма осадков за год в зоне г. Краснодар составляет 643 мм, в летние месяцы их выпадает около 180 мм.
Материал исследований. В работе использованы 106 образцов подсолнечника различного происхождения.
Гербицидоустойчивые линии НА425, RHA426 и RHA427 являлись интродуцированными образцами. Семена получены с опытной станции Департамента сельского хозяйства США (г. Фарго, штат Северная Дакота).
Использованы также гербицидоустойчивые гибриды Санай, Неома и Мелдими фирмы Syngenta и ЦМС-линия фирмы Maisadour (Франция).
Генетическая коллекция подсолнечника ВНИИМК включала: сорт Юбилейный 60 (в качестве контрольных растений), селекционные линии ЦЭБ ВНИИМК (ВК276, ВК464, ВК508, ВК541, ВК580, ВК585, ВК588, ВК653, ВК678, ВК850, ВК876), селекционные линии Армавирской опытной станции ВНИИМК (ВА2, ВА93, ВАЗ 17, ВА325), генетические линии ВНИИМК (ЛГ26, ЛГ27 и ЛГ28), линии ВИР (ВИР721, К235, К824, К1587, К3353), линия из Франции RIL100, линии из США (НА413, RHA416), образцы из Сербии (SURES-B, SURES-R) и 66 семей М2, полученных в результате химического мутагенеза. Кроме того, изучены образцы семян, собранных с четырёх сорных растений подсолнечника (корзинки от свободного цветения) на соевом поле в 2005 г. при его обработке гербицидом Пульсар в концентрации 1 л/га.
Методы исследований. При изучении материала использовались полевые, фитотронные и лабораторные методы работы.
Полевые методы исследований. Предшественником подсолнечника во все годы исследований была озимая пшеница. Посев подсолнечника осуществляли по традиционной для этой культуры схеме, т.е. по одному растению в гнезде после прорывки при расстановке 70x35 см. Посев проводили ручными сажалками. В одно гнездо помещали по две-три семянки. Каждый рядок включал в себя по 25 гнёзд. В течение вегетации проводили две междурядные культивации и ручную прополку в течение всего сезона.
Обработку подсолнечника гербицидом ежегодно проводили в первой декаде июня, когда растения достигали стадии трёх пар настоящих листьев (V6 стадия по международной номенклатуре).
В опытах 2003-2005 гг. использовали водные растворы гербицида Пивот, ВК (100 г/л, действующее вещество - имазетапир фирма-производитель BASF), а в 2006-2008 гг. - гербицида Пульсар, ВР (40 г/л,
д.в. - имазамокс; ОАО «Химпром», г. Волгоград) в концентрациях 6 мл/л или 1 л/га, что соответствует двойной рекомендуемой в производстве (2Х) дозе.
Ручным пульверизатором обрабатывали каждое растение, причём гербицид наносился как на настоящие листья, так и на точку роста. В 2007-2008 гг. обработка посевов гербицидом проводилась с помощью ранцевого пневматического опрыскивателя «Жук ОП-204» вместимостью 6 л рабочего раствора. Опрыскивание проводили в утренние часы при оптимальной для обработки температуре атмосферного воздуха. Штанга опрыскивателя удерживалась на расстоянии около 20 см от точки роста растений. Обрабатывался ряд подсолнечника и междурядья, обеспечивая равномерное покрытие раствором сорных растений.
Оценка влияния гербицида на растения подсолнечника проводилась ежегодно через 10 и 20 дней после обработки. При этом растения визуально разделяли на две группы - погибшие и выжившие. Окончательный результат оценки устойчивости растений получали спустя 20 дней после опрыскивания и обрабатывали статистически для выяснения характера варьирования и наследования признака.
Ежегодно измеряли высоту растений и подсчитывали число листьев обработанных и необработанных гербицидом растений у родительских форм и гибридов Fn. Высота растений измерялась после завершения периода цветения от поверхности почвы до места прикрепления корзинки к стеблю.
Селекционно-генетические методы. Растения подсолнечника изолировали за два-три дня до начала цветения в фазе появления краевых цветков из-под обёртки. Нижние края индивидуального сетчатого изолятора плотно обжимали по стеблю и обвязывали шнуром с этикеткой. Во время вегетации проводили фенологические наблюдения и определяли сроки полных всходов и начала цветения.
Скрещивание растений проводили с использованием метода ручной кастрации и принудительной гибридизации. Объём работы обычно составлял
три кастрированные и опылённые корзинки на каждую комбинацию скрещивания. Для получения поколений F2, а также константных по устойчивости линий, проводили принудительное самоопыление под индивидуальными сетчатыми изоляторами. Каждую корзинку обмолачивали вручную отдельно.
Для расширения наследственной изменчивости использовался метод искусственного химического мутагенеза. В 2006 г. выращено и самоопылено М0 при 16-ти часовой обработке семянок линий ВК876, ВК580, ВК588 и ВК850 перед посевом 0,05 % раствором нитрозоэтилмочевины (НЭМ). В 2007 г. выращено и самоопылено поколение Мь И, наконец, в 2008 г. обработке гербицидом Пульсар подверглись растения Мг.
Фитотронные методы. Исследования проводились не только на поле, но и в камерах фитотрона. Растения выращивали в отдельных сосудах объёмом 10 л при освещении лампами дневного света с фотопериодом 16 ч-день и 8 ч - ночь. Использовались светильники Фотос 4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещённость 25 килолюкс. Дневная температура воздуха в камере фитотрона составляла в среднем 27-30 С.
Опыт по оценке влияния имидазолинонов на поражение заразихи на растениях подсолнечника проводился в камере фитотрона с 16 марта по 20 апреля 2006 г. В короб с почвенно-песчаной смесью (2:1) высевали семена неустойчивых к заразихе линий ВК508 и RHA426. Почва в коробе была искусственно инфицирована смесью семян заразихи (сбор в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской области в 2004 г.) из расчёта 5 г семян заразихи на 10 кг почвы. Семена заразихи были предоставлены отделом селекции сортов подсолнечника ВНИИМК.
Клубеньки на корнях растений были классифицированы как жёлтые -жизнеспособные клубеньки; потемневшие - клубеньки заразихи, остановившиеся в развитии, с начальными стадиями некроза тканей; и некротические клубеньки - погибшие клубеньки тёмного цвета.
Степень поражения гербицидом в камере фитотрона оценивалась с помощью модифицированной шкалы определения индекса фитотоксичности, где 0 % - растения без поражений (контрольные, или необработанные гербицидом растения); градация 10-30 % показывает различную степень хлороза, 40 % - полное пожелтение листьев. Интервал 50-90 % - повышение степени некроза листьев, а индекс 100 % характеризует полностью погибшие от гербицида растения.
Эффект действия гербицида на прирост растений различных генотипов рассчитывали по формуле (1), модифицированной в лаборатории генетики с целью учёта направления (знака) влияния:
Э=100Х —-100, (1)
где Роп и Рк - показатели состояния тест-объекта в опыте с гербицидом и в контроле, соответственно.
Лабораторные методы исследований. При изучении возможности рекомбинации гена Imr с генами качества масла семян Ol, tphl и tph2 проводили ряд биохимических анализов: определение состава токоферолов и содержания олеиновой кислоты в масле семян.
Состав токоферолов определялся тонкослойной хроматографией неомыляемой фракции липидов семян по методу Эммери-Энгеля без коррекции различной степени окрашивания гомологов. Для характеристики индивидуальных корзинок подсолнечника использовалось масло, полученное прессованием, с последующим омылением и извлечением в составе неомыляемой фракции токоферолов, которые разделяются на компоненты с помощью тонкослойной хроматографии. Для проведения анализа использовали 10-15 мг масла. Жирнокислотный состав в масле семян был определён при помощи газовой хроматографии их метиловых эфиров.
Статистическую обработку данных проводили, используя стандартные биометрические методы: определение наименьшей существенной разности
(НСР), проверку гипотез о схемах расщепления с использованием критерия соответствия % . Использованы компьютерные программы STATISTICA 6.0 (основные описательные статистики) и Microsoft Excel.
