Содержание к диссертации
Введение
1. Устойчивость ржи к бурой ржавчине. генетика и селекция. (Обзор литературы) 6
1.1. Селекция ржи на иммунитет 6
1.1.1. Рожь как агрономическая культура 6
1.1.2. Бурая ржавчина ржи и ее вредоносность 18
1.1.3. Стратегия селекции ржи на иммунитет 21
1.1.4. Использование ржи как источника устойчивости в селекции пшеницы 27
1.2. Генетика устойчивости ржи к бурой ржавчине 30
1.3. Локализация и картирование генов ржи 35
1.3.1 Молекулярные и белковые маркеры хромосом 35
1.3.2. Картирование генов ржи с использованием разнообразных маркеров 41
1.4. Заключение 48
2. Материалы и методы 53
2.1. Растительный материал 53
2.1.1. Характеристика автофертильных линий и источников устойчивости, полученных от О.В. Солодухиной 53
2.1.2. Схема получения межлинейных гибридов и гибридов от скрещивания устойчивых растений и автофертильных линий 55
2.2. Методы оценки на устойчивость к бурой ржавчине 59
2.3. Методы изоферментного анализа 60
2.3.1. Изозимные маркеры, используемые в работе 60
2.3.2. Методы разделения изоферментов 62
2.3.2.1. Методы электрофореза 62
2.3.2.2. Методы изоэлектрического фокусирования 63
2.3.3. Методы выявления изоферментов 64
2.3.4. Принятые сокращения 66
2.4. Морфологические маркеры, используемые в работе 67
2.5. Методы генетического анализа 67
2.6. Статистическая обработка данных 68
3. Генетика устойчивости ржи к буройржавчине 71
3.1. Выявление генофонда устойчивости ржи к бурой ржавчине 71
3.1.1. Оценка коллекции автофертильных линий ржи на устойчивость к клонам бурой ржавчины. Отбор устойчивых линий 71
3.1.2. Субколлекция автофертильных линий ржи 77
3.1.3. Повышение устойчивости ржи к бурой ржавчине. Отбор устойчивых растений из популяции Волхова, как пример возможности для селекции 80
3.2. Анализ гибридов Fi на устойчивость к клонам Puccinia dispersa 83
3.3. Изоферментный анализ гибридов Fi 88
3.4. Анализ расщеплений гибридов F2 по устойчивости к клонам Puccinia dispersa 90
4. Локализация генов устойчивости на хромосомах ржи 134
4.1. Анализ расщеплений гибридов F2 по аллельным вариантам изозимов и морфологическим маркерам 134
4.2. Анализ совместного наследования изоферментных локусов, морфологических маркеров и генов, контролирующих устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины 144
4.3. Построение карт участков 1R и 5R хромосом ржи 164
Заключение 171
Выводы 176
- Генетика устойчивости ржи к бурой ржавчине
- Методы оценки на устойчивость к бурой ржавчине
- Анализ гибридов Fi на устойчивость к клонам Puccinia dispersa
- Анализ совместного наследования изоферментных локусов, морфологических маркеров и генов, контролирующих устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины
Введение к работе
Рожь (Secede cereale t.) является одной из важнейших продовольственных зерновых культур, особенно в Нечерноземной зоне России.
В последнее время прослеживается стойкая тенденция увеличения посевных площадей ржи и рост валового продукта. Однако, различные заболевания, в том числе и вызываемые грибными патогенами, такими как бурая ржавчина (возбудитель - РиссіпІа dispersa Eriks et E.Henn.), приводят к значительным потерям урожая. В свете этого, изучение иммунитета ржи является одной из основных задач входящих в стратегию селекции устойчивых сортов.
В то же время, изучению такого важного аспекта иммунитета ржи как генетика устойчивости к грибным заболеваниям, в частности к бурой ржавчине, посвящено незначительное количество работ. Это особенно заметно в сравнении с объемом отечественных и зарубежных исследований в области частной генетики этой культуры и генетики устойчивости других зерновых культур к болезням. До настоящего времени исследования генетики устойчивости ржи были сосредоточены на поисках и анализе высокоэффективных генов диких видов и переносу их в культурную рожь или в пшеницу. В то же время выяснено, что рожь сама обладает значительным потенциалом генов устойчивости, выявлено несколько эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине и определено, что выявленная устойчивость обычно наследуется олигогенно и доминантно.
Это дает возможность использовать естественный потенциал генов устойчивости ржи в селекции на иммунитет.
Изучение как генетики ржи в целом, так и, генетики устойчивости к грибным заболеваниям в частности, сдерживается перекрестным характером опыления ржи и существующей у этого вида строгой системой гаметофитной самонесовместимости. Это осложняет проведение гибридологического анализа, который, в том числе и по признаку устойчивости к болезням достаточ-
5 но легко ведется у других видов культурных злаков, как, например, у пшеницы или ячменя.
Обнаружение мутаций автофертильности позволило преодолеть автостерильность и создать генетически однородные инбредные линии ржи, успешно использующиеся для изучения ее генетики, в том числе, генетики болезнеустойчивости (Смирнов, Соснихина, 1981, 1984; Смирнов, Войлоков, 1990; Priyatkina et al., 1994; Tan, Luig and Watson, 1976). Большая коллекция автофертильных линий имеется в лаборатории генетики растений БиНИИ СПбТУ. Существующие в БиНИИ инбредные линии ржи гомозиготны по большинству генов, что позволяет вести с ними работу также как и с самоопыляемыми культурами.
Кроме того, к настоящему времени найдены морфологические,ч биохимические и молекулярные маркеры всех семи хромосом гаплоидного набора ржи, определены группы сцепления, что позволяет вести работу по локализации генов устойчивости.
Это направление исследований имеет большое значение, так как знание о локализации генов устойчивости, их сцеплении с другими, в том числе и с хозяйственно ценными признаками, даст возможность целенаправленно создавать доноры устойчивости и, впоследствии, устойчивые сорта ржи.
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы является определение генетической детерминации наследования специфической устойчивости ржи к бурой ржавчине и картирование генов устойчивости на хромосомах ржи.
Генетика устойчивости ржи к бурой ржавчине
Генетика устойчивости большинства злаковых культур, например, пшеницы к бурой ржавчине (Puccinia reconditaf. sp. tritici Rob.) интенсивно изучалась и изучается, что привело к идентификации и картированию значительного количества генов устойчивости. К 1984 году было найдено и локализовано на хромосомах всех трех геномов пшеницы 46 генов устойчивости к бурой ржавчине. Больше всего генов устойчивости к листовой ржавчине локализовано на хромосомах В и D геномов (В - 16 генов, D- 12 генов) и меньше всего в геноме А — 7 (The cereal rust, 1984). К настоящему времени, картировано девять генов устойчивости пшеницы, а так же найдены молекулярные маркерные гены, сцепленные с генами устойчивости — Lr35 (Seyfarth et aL, 1999 по Михайлова, 2003), Lr24 (Dedryver et al., 1996), Lr9 (Schacher-mayr et al., 1994), Lr39 (Raupp et al., 2001), а так же Lr29 и Lr25 (Procunier et al., 1995). Работа в этом направлении активно продолжается (Enjalbert, et aL, 1999). Изучен характер наследования устойчивости — специфическая устойчивость в большинстве случаев наследуется моногенно и доминантно. Кроме, того, показано, что гены устойчивости могут взаимодействовать. Комбинация двух эффективных генов может обусловливать более высокую устойчивость, чем один из них (аддитивное взаимодействие); неэффективные гены могут проявлять модифицирующее действие в комбинации с эффективным геном; неэффективные гены могут иметь малое остаточное действие и в комбинации могут обеспечить усиленную устойчивость (остаточный эффект генов) (Михайлова, 2003). Пример аддитивного взаимодействия генов на пшенице показан в работе J.A. Kolmer с сотрудниками (1992). Ген устойчивости к листовой ржавчине Lrl3 представлен у многих североамериканских образцов твердой красной яровой пшеницы, которые показывают длительную ус- тойчивость к листовой ржавчине. Пятнадцать попарных комбинаций Lrl3 и генов проростковой устойчивости к листовой ржавчине были получены в результате перекрестного опыления с изогенной линией Тэтчер. Как в проросткових тестах, так и на взрослых растениях, гомозиготы парных комбинаций генов специфической устойчивости с Lr 13 увеличили устойчивость к ржавчинным изолятам по сравнению с каждым родителем.
Однако изучению генетики устойчивости культурной ржи к болезням, в частности к бурой ржавчине, посвящено очень малое количество работ. Количество генов устойчивости и толерантности, уровень их вариа-бильности, и их картирование на ржаных хромосомах, остается практически открытым вопросом (Benito, 1996). Несмотря на то, что впервые именно на ржи и бурой ржавчине была показана дифференциация клонов ржавчинных грибов по вирулентности (Mains, Leighty, 1923), эти работы в течение долгого времени не получали развития. Существующие немногочисленные исследования сосредоточены на поисках и анализе высокоэффективных генов диких видов и переносу их в культурную рожь или ото ржи в пшеницу (Кобылянский, 1979; Де-дяев и др., 1981; Кобылянский, 1982; Singh, Shepherd, 1990). Отчасти это связано с тем, что, если у пшеницы достаточно легко, хотя и в небольшом количестве выявляются полностью устойчивые к болезни образцы, то устойчивые образцы вида cereale в коллекции ВИР отсутствовали, хотя некоторые дикие виды ржи выявили высокую устойчивость (Кобылянский, 1977; Кобылянский, 1989). Поскольку образцы ржи состоят из генетически различающихся растений (Смирнов, Соснихина, 1981), общая картина взаимодействия такого образца с популяцией паразита не могла выявить уровень устойчивости вида. Важнейшим этапом в изучении болезнеустойчивости ржи, создавшим основу для расширенного изучения генетики устойчивости, в том числе и к бурой ржавчине, являются работы, проведенные под руководством проф. В. Д. Кобылянского. Первые материалы по созданию доноров расоспецифической устойчивости ржи к бурой ржавчине были получены во Всесоюзном НИИ Растениеводства. В 1967 году в популяциях дикой многолетней ржи выделены расте-ния, характеризующиеся сверхчувствительной реакцией к бурой ржавчине и мучнистой росе (Шакирзянов, 1991). К настоящему времени определено, что устойчивость ржи к бурой ржавчине наследуется олигогенно и детерминирована как минимум шестью доминантными аллелями генов устойчивости к популяции бурой ржавчины (Lr4, Lr5, Lr6, Lr7, Lr8, LrlO) (Солодухина, 1993, 1994, 2002, 2003). Было определено, какие гены детерминируют устойчивость к бурой ржавчине образцов ржи, используемых как источники устойчивости (табл. 1.2.1). Интересно, что экспрессивность и эффективность генов Lr8 и LrlO зависит от их ал-лельного состояния. Большинство идентифицированных олигогенов ржи представляют собой блоки сцепленных генов, ответственных за устойчивость к отдельным клонам гриба. Из всех проанализированных генов устойчивости только ген Lr5, интрогрессированный в культурную рожь Secale cereale от дикой многолетней ржи 5 . montanum, оказался сцеплен с факторами, вызывающими нарушение системы размножения гибридных растений от отдаленных скрещиваний. Это приводит к снижению озерненности колоса устойчивых растений (Солодухина, 2002). При анализе образца Иммунная 1, устойчивость которого к популяции бурой ржавчины детерминирует один доминантный ген устойчивости, прямые и обратные анализирующие скрещивания с восприимчивым сортом Ильмень показали, что передача генов устойчивости при гибридизации не зависит от цитоплазмы (Солодухина, 1986). Кроме того, было доказано, что идентифицируемые в ранней фазе онтогенеза главные гены устойчивости к бурой ржавчине ржи экспрессируются и в более поздних фазах развития растений (Солодухина 2003). Моногенный и доминантный характер наследования устойчивости озимой ржи к бурой ржавчине был показан и в работе немецких ученых (Miedaner, Sperling, 1995). Использование автофертильных линий для изучения генетики устойчивости. В работах по выявлению и локализации генов устойчивости применение инбредных линий в качестве исходного материала для скрещивания, неоднократно помогало преодолеть трудности генетического анализа при работе с перекрестноопыляемыми культурами. Так, инбредные линии использовались в работе по изучению наследования и сцепления гена устойчивости кукурузы к американской расе Puccinia polysora, в ходе которой он был локализован на десятой хромосоме (Ullstrup, 1965), а также в более поздней работе В.В. Бурлова и Ю.П. Артеменко (1983) по идентификации генов устойчивости подсолнечника к ложной мучнистой росе (Plasmopara heleanthi), в ходе которой было показано, что ген невосприимчивости Pit и ген Р12, один из главных генов устойчивости к мучнистой росе расположен в гомологичных хромосомах. Применение этого метода на ржи стало возможным с появлением автофертильных инбредных линий, которые получены как у нас в стране, так и в других странах (Tan et al., 1976; Смирнов, Соснихина, 1981).
Инбредные линии использовались в работах по установлению контроля расоспецифической устойчивости ржи к бурой ржавчине (Musa et al., 1984). В работе авторов был установлен монофакторный и двухфакторный контроль расоспецифической устойчивости к бурой ржавчине. Гены, детерминирующие устойчивость к различным клонам бурой ржавчины наследовались независимо. Также, в работе был установлен моногенный, дигенный и тригенный контроль устойчивости автофертильных линий ржи к пшеничной форме возбудителя. В ходе исследований было выявлено, что некоторые гены, контролирующие устойчивость к возбудителю бурой ржавчины пшеницы тесно сцеплены с генами, детерминирующими устойчивость к некоторым клонам бурой ржавчины. Моногенный или дигенный контроль устойчивости к бурой ржавчине был установлен так же в других работах. Для анализа наследования расоспе-цифической устойчивости ржи к бурой ржавчине, были использованы гибриды F2 и F3 , полученные от скрещивания 14 инбредных линий ржи с различными источниками устойчивости из Германии, России, Чехии и Америки. В ходе работы было выяснено, что устойчивость у взрослых растений к немецкой популяции патогена контролируется одним или двумя доминантными генами. В стадии проростков устойчивость растений, полученная из различных источников к разным монопустульным изолятам гриба контролировали один либо два доминантных гена, а так же два гена, детерминирующих рецессивную устойчивость (Scholz, Wehling, 1996а, 1996b). Автофертильные инбредные линии ржи так же использовались в работах по картированию генов устойчивости к бурой ржавчине, в качестве восприимчивых родителей (Linz, Wehling, 1996). Инбредные автофертильные линии использовались для идентификации генов, детерминирующих устойчивость к болезням и в работе О.В. Солодухиной (2003). С использованием мутантньгх локусов автофер-тильности анализ на аллелизм показал неаллельность гена, детерминирующего устойчивость ржи к популяции бурой ржавчины донора Ловашпатонае 2 (Lr8) генам Lr4, Lr5, Lr6 и Lrl 0. Обобщая приведенные данные, можно сказать, что устойчивость к бурой ржавчине у ржи может контролироваться доминантными генами, выявлен моно-, ди - и тригенный контроль устойчивости, кроме того, у ржи была выявлена и рецессивная устойчивость к клонам бурой ржавчины.
Методы оценки на устойчивость к бурой ржавчине
Для оценки на устойчивость инбредные линии ржи из коллекции Би-НИИ СпбГУ выращивались в лабораторных условиях в деревянных ящиках по 7 растений от каждой линии. Гибриды Fi F2 выращивались в теплице Би-НИИ СПбГУ в деревянных ящиках до 12 растений каждого гибрида Ft и все растения анализируемого гибрида F2. Популяции возбудителя бурой ржавчины, полученные из разных регионов России, а так же Германии, размножали на отрезках листьев ржи, сорта Волхова по лабораторной методике с применением бензимидазола. Из популяций были выделены монопустульные изоляты. Оценку устойчивости линий и гибридов к возбудителю ржавчины (Puccinia dispersa) проводили по лабораторной методике культивирования возбудителя на бензимидазоле (Михайлова, Квитко, 1970). Оценку на устойчивость проводили в фазу от проростков до начала кущения. Для анализа на устойчивость к бурой ржавчине автофертильных линий брали молодые листья от каждого растения. Для анализа на устойчивость к бурой ржавчине гибридов Fi и F2 анализировали листья растений, начиная с фазы проростков до начала кущения. Отрезки листьев раскладывали в кюветы на фильтровальную бумагу, смоченную 0,004% раствором бензи- мидазола. Фитогормон бензимидазол поддерживает клетки в ювенильном состоянии, предохраняет хлоропласты от распада и дает возможность отрезкам листьев длительное время оставаться зелеными (Дьяков, 1998). При анализе автофертильных линий и гибридов Fi отрезки листьев заражали при помощи микробиологической иглы несколькими клонами бурой ржавчины (4 - 5) предварительно размноженными на отрезках ржи сорта Волхова. После нанесения спор, смешанных с тальком, листья опрыскивались водой. Заражение гибридов F2 проводили опрыскиванием отрезков листьев суспензией урединиоспор каждого клона в отдельности. Учет поражения проводился на 7 - 9 день после заражения. К устойчивым относили растения с ярко выраженными некротическими пятнами с типами реакций 0, ; , 1, 2., к восприимчивым - с типами реакций 3, 4 по пяти-бальной шкале Е.В. Mains и H.S. Jackson (1926). 23.
Методы изоферментного анализа. 2Л.1.Изозимные маркеры, используемые в работе, В работе были использованы маркеры, контролирующие отдельные изозимы, бетаглюкозидазы (b-GLU), эстеразы (EST), пероксидазы (PRX), супероксиддисмутазы (SOD), эндопептидазы (ЕР), диафоразы (DIA), фос- фоглюкоизомеразы (PGI), малатлегадрогеназы (MDH), аспартатаминотрансферазы (ААТ). В качестве контроля для определения аллельных вариантов изозимов использовались инбредные линии ржи — 5, 6 и 8, оцененные ранее (Фыонг, 1993; Войлоков и др., 1994). Характеристика линий по аллельным вариантам изозимных локусов, расщепление по которым учитывалось в работе, приведена в таблице 2.5. Методы разделения изозимов. Ферменты экстрагировали из листьев 14 - 20 - дневных проростков путем гомогенизации в экстракционном буфере (0,1 трис НО, рН 8,0), содержащем на 100 мл раствора - 100 мг аскорбиновой кислоты, 100 мг цистеина, 17,11 г. сахарозы (Sako, Stachman, 1978). Грубые экстракты получали путем центрифугирования в течение 15 мин при 10000 g, t = 4 С. Супернатант использовали для нанесения на стартовые позиции при электрофорезе или изоэлектрическом фокусировании. 23.2.1. Методы электрофореза. Разделение изоферментов (кроме эстеразы и пероксидазы) проводили в аппаратах для электрофореза с вертикальными пластинками геля. Для 0-GLU, ЕР, DIA и PGI - 6%, MDH -5%, для ААТ и SOD --7,5% гель. Гелевые пластины получали после полимеризации смеси исходных растворов, представленных в таблице 2.6. В работе использовались два морфологических маркера - отсутствие воскового налета (w) и короткостебельность - (dw). Оба признака рецессивны и наследуются моногенно. Согласно современным представлениям ген wal, детерминирующий отсутствие воскового налета на растении, локализован в длинном плече хромосомы 7R, а ген w, детерминирующий отсутствие воскового налета на междоузлиях и листьях локализован на 4R хромосоме (Вбгпег, Korzun, 1998, Ма-lyshev at al.,2001; Войлоков, Прияткина, 2004). Знание генотипов линий по указанным морфологическим маркерам позволило изучить характер наследования морфологических признаков у гибридов F2. 2.5.Методы генетического анализа. В работе для определения характера наследования устойчивости к клонам ржавчины и локализации генов устойчивости на хромосомах ржи использовались классический метод генетического анализа, а именно гибридологический анализ. В генетическом анализе используются скрещивания в последовательном ряду поколений: Fi, F2, F3 (см. Тихомирова, 1990). Применительно к настоящей работе можно выделить следующие этапы исследования: 1. Определить, наследуется ли анализируемый признак, для чего необходимо выделить формы с альтернативным проявлением признака. 2. Определить число генов, по которому различаются анализируемые формы. 3. Определить, как взаимодействуют аллели, детерминирующие альтернативные признаки при гибридизации. 4. Определить группу сцепления и локализовать изучаемые гены. 2.6.Статистическая обработка полученных данных. Соответствие расщеплений по устойчивости и изозимным маркерам теоретически ожидаемым проверяли с помощью стандартной процедуры вычисления значения х2з;і для признаков с доминантно - рецессивным проявлением. В случае маркеров с кодоминантным проявлением оценивалось как соответствие соотношению 1:2:1 (х хал), так и соотношение отдельных гено-типических классов между собой, последнее осуществлялось с помощью раз-ложения % на компоненты (Wehling, 1986). Если численности генотипов Ац( Ai2 и А22 в F2 соответственно равны щ, Пг и Пз, то для проверки равенства Ац + А22 = An рассчитывали х2(1) = (пі+Пз-пг)2/п, а для проверки равенства Aj і=Аг2 вычисляли %2(2) = 2(nrn3)2/n. В том и другом случае г = 1, а п - численность всей выборки. Исходя из аддитивности критерия х2, значение X (і:2:ін X 0)+ % (2)» a т = 2. Данные для каждой семьи оценивались отдельно. На основе критерия однородности (Глотов и др., 1982) выборки объединялись при р 0,05, и проводилась повторная оценка в сравнении с ожидаемым расщеплением.
Сцепление кодоминантных и доминантных маркеров с мутациями автофертильности устанавливали на основе критериев гаметической селекции (Weber, Wricke, 1994) В случае сцепления кодоминантного маркера с мутацией автофертильности частота гетерозигот А должна составлять 0,5, это равенство оценивается компонентом разложения Х2(0-Частота гомозигот по аллели, свойственной автофертильной линии должна достоверно превышать частоту гомозигот по аллели, полученной от самонесовмесгимого родителя, это неравенство оценивается компонентом хг(2). Если выполняются оба условия при р 0,5иу=1, то рассчитывается частота рекомбинации г = пЗ / (nl+ri3). Стандартная ошибка для маркеров с кодоминантным проявлением, рассчитывается по формуле: Sr = V2r(l-r) / п. Для маркера с доминантно-рецессивным проявлением единственным условием для расчета частоты рекомбинации между ним и мутацией автофертильности является достоверное отклонение от моногибридно-го расщепления в ожидаемом направлении. В случае сцепления S мутации и рецессивного аллеля изучаемого гена (Sf - а), у гибридов F2 должен наблюдаться избыток гомозигот по рецессивной аллели, полученной от ав-тофертильной линии (расщепление, близкое 1:1 в случае абсолютного сцепления). В этом случае величина рекомбинации рассчитывается по формуле: г = (nt - пг) / п, где п- численность всей выборки, Пі- численность особей доминантного фенотипа, п2- численность особей рецессивного фенотипа. В случае сцепления мутации автофертильности и доминантной аллели изучаемого гена (Sf - А) у гибридов F2 должен наблюдаться значительный недостаток растений с рецессивным признаком (отсутствие расщепления в случае абсолютного сцепления), тогда г = 2 П2 /п. Стандартная ошибка для маркеров с доминантно - рецессивным проявлением рассчитывается по формуле: Sr =V г (1-r) / п. Значения величины сцепления анализируемых генов устойчивости и маркерных генов, рассчитывали по принятым методикам, с учетом отклонения от стандартных расщеплений, связанных с системой автофертильности ржи (по Allard, 1962; Weber, Wricke,1994; Wehling, 1986). Обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью ПЭВМ по программе "RECOMB", составленной научным сотрудником М.И. Рахманом. Для машинной обработки вводилась последовательность расщепляющихся фенотипов всех растений анализируемой комбинации F2. Машинная обработка осуществлялась в следующем порядке: 1. группировка растений F2 в классы по всем интересующим ди-гибридным расщеплениям и подсчет численности в этих классах, 2. разложение на компоненты %2 для каждого расщепления (Wehling, 1986) с параллельным анализом моногенных расщеплений. 3. расчет частот рекомбинаций с ошибкой для каждой пары анализируемых генов по методу максимального правдоподобия (Allard, 1962). Достоверность сцепления оценивалась по величине одного из компонентов разложения х2 (Wehling, 1986), специфически оценивающего неслучайное комбинирование генотипов по разным маркерным генам в том случае, если хотя бы один из анализируемой пары маркеров наследовался кодоминантно.
Анализ гибридов Fi на устойчивость к клонам Puccinia dispersa
На первом этапе работы по изучению генетики устойчивости ржи к бурой ржавчине была проведена оценка всех 59-ти гибридов Fi (18 межлинейных и 41, предоставленных нам для анализа О.В. Солодухиной, полученных путем многократных беккроссов), на устойчивость к 14 клонам гриба. В данном анализе использовали клоны, выделенные из петергофской популяции, которые сохранились после начального этапа работы, а именно оценки автофертильных инбредных линий ржи на устойчивость к бурой ржавчине -это клоны №№ 7, 21, 25, 31, 62, 63, 66, 68, 69, 74, 81 и 82. Кроме того, были использованы клоны № 23, 85 из петергофской популяции Риссгта dispersa. Общий объем оцененного растительного материала представлен в таблице ЗА Так как гибриды Fi, используемые в работе, имеют разное происхождение, то целесообразно рассматривать результаты их анализа в отдельности. Анализ гибридов F]. полученных в результате серии беккроссов Анализ гибридов Fi, полученных от О. В. Солодухиной базировался на анализе устойчивости линий, на которые были сделаны последние возвратные скрещивания, а именно, автофертильных линий 5 и 8. Линия 5, (было оценено 7 растений этой линии), оказалась восприимчива к клонам №№ 62, 74, 81, 82, 21, 23,25, 63, 7, и 69, К клонам №№ 31 и 66 - устойчива, а к клонам №№ 68, 85- гетерогенна. Линия 8 (было оценено 10 растений) показала такие же результаты. Теоретически, как это видно из схемы скрещивания (см. рис 2.1. гл. «материалы и методы»), такие гибриды, полученные в результате многократных беккроссов устойчивых растений на сорт Ильмень и скрещенных затем с автофертильными линиями 5 или 8, должны уже в F расщепляться по устойчивости в соотношении IRr : lrr. В изученных нами семьях это не всегда соблюдалось, что можно объяснить малым объемом выборки - не более 12 растений.
В работе наблюдались три варианта реакции растений определенного гибрида Fi на заражение определенным клоном бурой ржавчины, что видно из таблицы I (приложение): 1. Все растения устойчивы, например, реакция на заражение гибрида №5 клонами 62, 63, 69, 21,23, 74 и 81. 2. Все растения восприимчивы, например реакция на заражение гибрида № 20 клонами 62, 25, 63, 7 и 69. 3. Восприимчивые и устойчивые растения распределяются в соотношении 1:1, например реакция на заражение гибрида № 4 клонами 62, 25, 63, 7 и 69. Дня проверки соответствия фактически полученного расщепления по устойчивости теоретически ожидаемому соотношению 1R:1 S, был подсчитан х2і:і (в случаях, ко- гда выборка проанализированных растений Fi была равна или превышала 10) (приложение, таблЛ). Прежде всего, нас интересовали реакции гибридов на клоны № 62, 74, 81, 82, 21,23, 25, 63,7, и 69, к которым линии 5 и 8 были восприимчивы. У восприимчивых к данным клонам растений соответствующие гены должны находиться в рецессивном гомозиготном состоянии, а растения, устойчивые к этим клонам, исходя из теоретических предпосылок, должны были быть гетерозиготами по генам устойчивости. Для получения F2 с целью дальнейшего генетического анализа устойчивости к бурой ржавчине были отобраны именно такие устойчивые растения. Анализ межлинейных гибридов Fb Как показал анализ на устойчивость к бурой ржавчине коллекции ав-тофертильных линий, некоторые линии оказались гетерогенными по устойчивости. В связи с этим, при скрещивании на родительские растения были поставлены изоляторы, чтобы получить потомство от самоопыления этих растений с целью дальнейшего определения их генотипа (гомозиготно или гетерозиготно данное растение по устойчивости к конкретному клону гриба). Инцухтное потомство родителей, а также родительские линии, семена которых были получены групповой изоляцией, оценивались вместе с межлинейными гибридами Fi на устойчивость к клонам Puccinia dispersa. Если при заражении определенным клоном гриба потомства от самоопыления родительского растения наблюдалось расщепление по устойчивости, то, следовательно, оно было гетерозиготно. При анализе гибрида Fj, полученного от скрещивания данного растения, также будет наблюдаться расщепление по устойчивости к определенным клонам Puccinia disperse, что и было выявлено при оценке некоторых межлинейных гибридов Fi (табл.II, приложение). В ходе анализа родительских линий на устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины были получены данные, еще раз подтверждающие высказанные ранее предположения о гетерогенности некоторых линий. Так, при сравнении данных оценки на устойчивость были выявлены различия реакции растений инцухтного потомства одного родительского растения определенной линии от реакции растений инцухтного потомства другого растения той же линии, что подтверждает гетерогенность данной автофертильных линии по устойчивости. Например, у линии 116/95 для получения гибрида 54 было взято растение №2, а для получения гибрида 44 - растение №7. Как видно из таблицы II приложения, инцухтное потомство растения №2 линии 116/95 устойчиво к клону № 23, а инцухтное потомство растения № 7 линии 116/95 к данному клону восприимчиво. Из чего можно заключить, что линия 116/95 гетерогенна по устойчивости к клону № 23. В настоящей работе были получены два гибрида в результате реци-проктных скрещиваний (табл. 3.5.).
Совпадение по типам реакции в реципроктном скрещивании подтверждает отсутствие влияния цитоплазматического наследования на признак устойчивости к бурой ржавчине, что было выявлено и в других работах (Соло-духина, 1986). Изоферментный анализ гибридов Ft. Для локализации генов устойчивости на хромосомах ржи, необходимо провести анализ совместного наследования генов устойчивости и изофер-ментных маркеров. Условием для этого является расщепление гибридов F2 по аллельным вариантам изозимов. Для того чтобы отобрать такие гибриды F2, нужно провести изоферментный анализ гибридов Fi. Изоферментный анализ гибридов Fi был проведен в лаборатории генетики растений БиНИИ СПбГУ. Были проанализированы все 59 гибридов Fi, взятых в анализ. В ходе изоферментного анализа было проанализировано 8 ферментных систем, гены, контролирующие которые, локализованы в 1,2,3,4 и 6 хромосомах ржи (табл. 3.6). Благодаря тому, что изоферментный анализ позволяет определить генотип гибридов Fi по аллельным вариантам изозимов при кодоминантном наследовании, а именно выявить гетерозиготы, то, анализируя гибрид Fi можно сказать, будет ли гибрид F2 давать расщепление по данному гену. Это было необходимо сделать для того, чтобы не брать в анализ заведомо нерас-щепляющиеся семьи F2 (табл. 3.6). Таким образом, необходимость изоферментного анализа гибридов Fi базировалась на следующих положениях: 1. У гибридов, полученных в результате многократных беккроссов устойчивых растений на сорт Ильмень и затем на автофертиль-ные линии 5 и 8, по аллельным вариантам изозимов оценены только родительские линии 5 или 8 (Фыонг, 1993). Аллельные варианты изозимов у автостерильного родителя не известны. Было весьма вероятно, что часть гибридов окажется гомозиготной. Поэтому было важно в Fi выявить гетерозиготы по аллельным вариантам изозимов, чтобы не брать в анализ заведомо не расщепляющиеся по изоферментным маркерам семьи. 2. Что касается межлинейных гибридов, то по аллельным вариантам изозимов охарактеризованы не все линии коллекции. Материал для гибридизации отбирался на основе данных по устойчивости и отбор гетерозигот по аллельным вариантам изозимов стал необходимой предпосылкой для дальнейшей работы по локализации генов устойчивости с использованием изозимных маркеров.
Анализ совместного наследования изоферментных локусов, морфологических маркеров и генов, контролирующих устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины
Данные по совместному наследованию изоферментных локусов, морфологических маркеров и генов, контролирующих устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины в инбредных семьях некоторых гибридов F2, полученных между автостерильными растениями и автофертильными линиями и межлинейных гибридов представлены в таблицах 4.5 - 4.11. В таблицах приводятся данные по дигибридным расщеплениям и частоты рекомбинации между проанализированными парами локусов. Данные, как и в случае моногибридных расщеплений, представлены для 145 каждого гибрида в отдельности. Несовпадение объемов выборок для разных пар локусов объясняется выпадением отдельных учетов из-за некачественного разделения белков или гибели растений. В случае соблюдения моногибридных расщеплений по каждому из анализируемых попарно локусов, об их сцепленном наследовании судили на основе разложения % и выделения компонента, специфически оценивающего сцепление генов (Wehling, 1986). Аналогично поступали и в том случае, если моногибридное соотношение соблюдалось только по одному из локусов и хотя бы один из двух локусов обладал кодоминантными аллелями. В этом случае правомочны не только вывод о сцеплении, сделанный на основе %2 сцепления, но и расчет величины рекомбинации между локусами (Wagner et al., 1992). В случае пары доминантно - рецессивных генов (ожидаемое соотношение 9:3:3:1), один из которых, или оба дают аномальные расщепления, проводили дополнительную оценку, основанную на критерии однородности (Weber, Wricke, 1994). Сравнение % полученное для оценки сцепления тремя способами расчета для выборочных данных, показало следующее. Значение % сцепления, полученное при стандартном вычленении %2 сцепления из зна-чения% общего, оценивающего соотношение 9:3:3:1 всегда было выше, чем значения, рассчитанные по формуле Фишера (Weber, Wricke, 1994) для четырехпольных таблиц сравнения. Еще больше увеличивало эту разницу введение поправок на непрерывность. Таким образом, %г сцепления, полученное путем разложения %г общего, может дать основание для вывода о сцеплении генов, в то время, как два других критерия этого основания не дают. Учитывая это, расчет %г независимости проводился с поправкой на непрерывность толь- ко в том случае» если значение х2 сцепления превышало критическое, равное 3,84 при одной степени свободы. Гибрид № 46 (536/92 (Tf) х 8/96 (?)) Результаты анализа совместного наследования генов, контролирующих изоферменты, морфологического маркера w и генов устойчивости к клонам Puccinia dispersa rD2 и г23 у данного гибрида представлены в таблице 4.5.
У данного гибрида в анализ совместного наследования были вовлечены два гена, детерминирующих рецессивную устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины 23 и D2 - г23 и rD2, а так же морфологический маркер -отсутствие воскового налета (w) и три изозимных маркера: Pgi2 локализованный на 1R, а так же Est2 и Est7/8, локализованные на 5R хромосоме ржи. Анализ совместного наследования изозимных локусов и генов устойчивости показал, что изозимные маркеры Est7/8 и Pgi2, а также ген г23 наследуются независимо от всех вовлеченных в анализ генов. Как видно из таблицы 4.5, анализ совместного наследования гена, детерминирующего рецессивную устойчивость к клону D2 - rD2 и маркеров Est2 и w показал, что величина у?9:3: з: і не превышает критического значения 7,8 для трех степеней свободы, что не дает право отвергать 0-гипотезу о независимом наследовании данных генов. Однако, с другой стороны, превышение критического значения х2 рекомбинации, полученного разложением Х2общего, дает право предположить наличие тенденции к сцеплению гена rD2 с изозимным маркером Est2, с одной стороны и с морфологическим маркером w - с другой. Гибрид № 53Р10РЗ (л.б (Sf) х 450/92 (Г5)) Совместное наследование изоферментных маркеров и генов устойчивости у гибрида № 53р10рЗ оценивали по объединенным данным двух семей 53р10 и 53рЗ. Возможность объединения семей была проверена с помощью X2 (табл. 4.1.). Данные по совместному наследованию вовлеченных в анализ генов представлены в таблице 4.6. В целом, у данного гибрида в анализ было взято 8 генов - два гена устойчивости R21, г61 и шесть изоферментных маркерных генов — Sod2 и р-Glu, локализованные на 2R хромосоме, Aat2 и EstlO - на 6R, Aat3 - на 3R и Est2, локализованном на 5R хромосоме ржи. Гены устойчивости детерминировали доминантную устойчивость к клону 21 (ген R21) и рецессивную устойчивость к клону 61 (ген г61). Анализ совместного наследования изоферментных маркеров Aat2 и Aat3 показал наличие некоторой тенденции к сцеплению, что можно заключить из превышения критического значения величины х2рекомбинации, в то время как значение % общего не дает право отвергать гипотезу о независимом наследовании данных генов. Остальные изозимные маркеры наследуются независимо друг от друга, чего и следовало ожидать. Хотя пары генов Sod2 и p-Glu с одной стороны и Aat2 и EstlO - с другой принадлежат к группам сцепления - 2R в первом случае и 6R — во втором, однако локализованы на достаточном физическом расстоянии друг от друга, для того, чтобы наследоваться независимо (Войлоков и др., 1994; Priyatkina et al., 1994). Что касается генов устойчивости, то, анализ совместного наследования генов R21 и г61 с другими вовлеченными в анализ генами показал, что они наследуются независимо как от изозимных маркеров, так и друг от друга. Гибрид Хо 43р5 (116/95 (Т ) х 21/96 (Tf)) У межлинейного гибрида № 43р5 анализировали совместное наследование четырех генов устойчивости к клонам возбудителя бурой ржавчины -R23, детерминирующего доминантную устойчивость к клону 23, а так же генов, детерминирующих рецессивную устойчивость к клонам 7, 81 и 152 — г7, г81 и г 152. Как видно из таблицы 4.7 анализ показал, что данные гены устойчивости наследуются независимо. Анализ совместного наследования изозимных маркеров показал, что, как и следовало ожидать, маркерные гены, локализованные в 5R и 1R хромосомах - Est6/9 и Ргх7 наследуются независимо. Гибрид № 14 был получен от скрещивания самонесовместимого, устойчивого растения на автофертильную линию 5, которая несет мутацию ав-тофертильности в локусе S (хромосома 1R) (Войлоков и др., 1994). Источником устойчивости изначально служил сорт «Иммунная 4». Исходя из того, что гибрид Fi в данном случае являлся гетерозиготой по мутации автофер-тильности, можно было ожидать при анализе гибрида F2 отклонений в расщеплений по генам, сцепленным с мутантним локусом несовместимости. Как видно из таблиц 3.11, 3.15, 3.17 (глава 3), расщепление по всем трем генам устойчивости соответствует 1 : 1 - случаю, когда рецессивная аллель анализируемого гена сцеплена с мутацией автофертильности (табл. З.Ю.). Контролем данной гипотезы должно быть сцепление данных генов устойчи-вости с маркерным геном Ргх7, сцепленным с S локусом.
Анализ совместного наследования изоферментных маркеров Ргх7 и Est6/9, а также гена, контролирующего устойчивость к клону Dl (RD1) у гибрида № 14, выявил сцепление RD1 с Ргх7 с частотой рекомбинации 30,5+6,3%. Локусы Est6/9 и RD1 наследуются независимо. Из этого можно заключить, что расщепление по устойчивости, близкое к 1 : 1 к клону D1 у гибрида № 14 (табл.3.11) объясняется сцеплением RD1 с мутацией автофертильности Sf, маркером которой является Ргх7. Кроме того, можно сделать вывод о том, что этот ген детерминирует доминантную устойчивость к данному клону бурой ржавчины. То, что имеет место расщепление 1 : 1 по гену устойчивости, связанное с влиянием мутации автофертильности позволяет рассчитать частоту рекомбинации между RD1 и S равную г= 22,0 ± 4,7%. При анализе совместного наследования изозимных маркеров и гена, контролирующего устойчивость к клону 25, было выявлено сцепление данного гена с Ргх7. Частота рекомбинации в данном случае составила 35±7%. И в этом случае можно сделать вывод о том, что этот ген детерминирует доминантную устойчивость к данному клону бурой ржавчины и, что расщепление по устойчивости, близкое к 1 : 1 к клону 25 объясняется сцеплением R25 с мутацией автофертильности S . Это дает право рассчитать величину рекомбинации между R25 и Sf, в данном случае г= 4 ± 2%. С изозимным маркером Est6/9 гены R25 и RD1 наследуются независимо. Кроме того, гены устойчивости R25 и RD1 сцеплены между собой с частотой рекомбинации 37,7 ± 7%. Что касается гена, детерминирующего устойчивость к клону 152, то он показал независимое наследование с обоими маркерными локусами, но, что наиболее важно - с Ргх7. Из этого можно сделать вывод о том, что гипотеза о соответствии расщепления по этому гену 1 : I не подтвердилась.
