Содержание к диссертации
Введение
1. Генетико-биохимическое изучение состава жирных кислот масла 8
1.1. Масличное сырьё для масложировой промышленности 8
1.2. Биохимия жирных кислот 12
1.3. Получение мутаций с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника 21
1.4. Генетика состава жирных кислот у подсолнечника 22
1.5. Факторы устойчивости маслак окислению 27
2. Условия, материал и методы исследования 30
3. Изменчивость содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника 37
3.1. Исходное фенотипическое варьирование содержания пальмитиновой кислоты 37
3.2. Поиск мутации и создание донорской линии ЛГ 30 40
3.3. Модификационная изменчивость признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты 44
3.4. Наследование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты 48
3.5. Онтогенетическая изменчивость признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты 58
4. Селекционное использование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты 62
4.1. Способ создания аналогов родительских линий с измененным составом жирных кислот 62
4.2. Создание аналогов родительских линий коммерческих гибридов подсолнечника с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты 71
5. Окислительная стабильность растительных масел . 75
5.1. Оценка устойчивости к окислению масел различных генотипов подсолнечника 75
5.2. Сравнительная оценка оксистабильности фракционированного подсолнечного и пальмового масел 78
Выводы 82
Рекомендации для селекционной практики 84
Список использованной литературы 85
Приложения 102
- Масличное сырьё для масложировой промышленности
- Условия, материал и методы исследования
- Исходное фенотипическое варьирование содержания пальмитиновой кислоты
- Способ создания аналогов родительских линий с измененным составом жирных кислот
Введение к работе
Начиная с 80-х годов прошлого столетия, в экономически развитых странах наметилась тенденция преимущественного потребления в пищу растительных масел вместо жиров животного происхождения. Помимо экономических преимуществ это связано с повышением уровня знаний относительно роли липидов, трансизомеров и компонентов жиров в организме человека (Калашева, 2005).
Из растительных масел для России наиболее традиционным является подсолнечное. Объем его потребления непосредственно населением удвоился за последние 20 лет и достиг 11,1 кг на человека в год. Российская Федерация в последние время получает более 6,4 млн. т семян подсолнечника и производит около 2,5 млн. т подсолнечного масла ежегодно, прочно занимая позицию мирового лидера "подсолнечной индустрии"(Решетняк, 2006а).
В настоящее время перед масложировой отраслью РФ ставятся задачи, которые не определяются только количественным наращиванием объема производства, но и требуют поиска качественно новых подходов. Одно из направлений в свете правительственной программы оздоровления питания населения страны - выпуск жировых продуктов как функциональных по назначению, так и лечебно-профилактических, обеспечивающих сохранение и улучшение здоровья человека. Продукты этих групп должны отличаться сбалансированным составом жирных кислот и повышенным содержанием жирорастворимых витаминов.
Растительные масла с улучшенным составом жирных кислот можно получить методом смешивания (купажирования) масел, полученных из различных культур. Современные достижения селекционной науки, в частности работы ВНИИМК, позволяют частично решить эту проблему
}
благодаря возможности создания сортов и гибридов масличных культур нового поколения с различным соотношением жирных кислот в масле семян (Быкова С.Ф., 2004).
Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), являясь
эссенциальными компонентами, и витамины, содержащиеся в
растительных маслах, представляют большую ценность для нормального
функционирования организма человека. По данным диетологов,
рекомендуемое соотношение жирных кислот в масле для питания
> здорового организма должно содержать около 20% полиненасыщенных,
50% мононенасыщенных и 30% насыщенных жирных кислот (Лобанов, 2003; Комаров, 2006). Теоретически указанное содержание насыщенных жирных кислот (преимущественно пальмитиновой) будет способствовать повышению температуры плавления и оксистабильности масла. Натуральные растительные масла такого типа позволят заменить гидрированные растительные и животные жиры при полном отсутствии трансизомеров и холестерина. Однако содержание насыщенных жирных кислот в маслах основных масличных культур Российской Федерации, не превышает 10-15% от суммы жирных кислот (Лисицын, 2003). Поэтому создание селекционным путем новых форм подсолнечника с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты весьма актуально.
Цель настоящих исследований - генетико-биохимическое изучение мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника и создание селекционных линий с этим признаком.
В задачи исследований входило решение следующих вопросов: 1. Оценить фенотипическое варьирование содержания пальмитиновой кислоты в масле семян селекционных линий и коллекционных образцов подсолнечника.
Создать линию с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян.
Изучить наследование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты.
Исследовать онтогенетическую изменчивость признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты.
Создать аналоги селекционных линий с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты.
к 6. Сравнить оксистабильность различных растительных масел.
Научная новизна исследований.
Впервые изучено наследование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты на основе созданной линии ЛГЗО. Признак контролируется моногенно с рецессивным проявлением. В некоторых комбинациях скрещивания наблюдается более сложное наследование.
Показана возможность идентификации мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле в гетерозиготе на основе анализа семядольных листьев одно-двух дневных проростков подсолнечника.
Установлено, что в липидах пыльцы, изученная мутация не проявляется
Практическая значимость полученных результатов.
Создана линия донор ЛГЗО с повышенным содержанием (около 24%) пальмитиновой кислоты в масле семян.
Разработан и запатентован способ создания аналогов линий с измененным составом жирных кислот.
На основе этого способа созданы аналоги селекционных родительских линий - отцовской ВК580 (зарегистрированной как ВК850) и материнской ВС5ВК876, отличающиеся от исходных повышенным
содержанием пальмитиновой кислоты. Эти линии могут быть использованы для создания высокопальмитинового аналога гибрида Триумф с новым качеством масла, характеризующимся высокой окислительной стабильностью.
Основные положения, выносимые на защиту.
Генотипический контроль мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника.
Метод создания изогенных линий на основе экспрессивности мутации состава жирных кислот у одно-двух дневных проростков.
3. Увеличение окислительной стабильности масла за счет
наследственных изменений состава жирных кислот семян.
Масличное сырьё для масложировой промышленности
Масложировая промышленность занимает ведущее место в агропромышленном комплексе России. Жиры играют важнейшую роль в питании человека, помимо этого масложировые продукты широко используются в кормовых и технических целях, в том числе и стратегических. Поэтому состояние масложировой отрасли определяет развитие не только отечественного агропромышленного комплекса, но и целого ряда других отраслей промышленности (Лисицын, 2003).
Основной задачей масложирового производства является создание конкурентоспособной продукции. Для решения этого вопроса предусмотрен целый комплекс мероприятий, в число которых входят: - повышение качества продукции за счет снижения степени окисленности вырабатываемого растительного масла; - укрепление взаимосвязи с селекционерами в результате обоснования требований к масличным семенам, как по технологическим свойствам, так и по биохимическому составу (Ржехин, 1969; Григорьева, 2002).
Все большее распространение приобретает использование нетрадиционного для масложировой отрасли сырья - семян арбуза, тыквы, винограда, амаранта. Полученные масла наряду с пищевыми достоинствами обладают биологически активными и фармакологическими свойствами. Возрождается производство "забытых" пищевых масел -льняного, конопляного и других (Кулакова, 2005; Кретов, 2006).
По данным министерства сельского хозяйства Российской Федерации основным масличным сырьем страны остается подсолнечник. Площади посевов под этой культурой в 2005 г. составили около 6 млн. га, с которых было убрано 6,4 млн. тонн маслосемян. Основную часть в производстве растительных масел составляет подсолнечное масло в количестве 2,3 млн. тонн, а производство соевого, рапсового масла составило около 100 тыс. тонн. Производство кукурузного, льняного, горчичного, орехового и других масел в России не столь значительно. Россия пополняет внутренние ресурсы масложирового сырья за счет импортных поставок. В 2005 г. импорт растительных масел в Россию составил 967 тыс. т. В основном это тропические масла. В структуре ввозимых растительных масел доля пальмового масла и его фракций составила 59%, кокосового - 11%, пальмоядрового - 4,3% (Кайшев, 2006; Решетняк, 20066).
Пальмовое масло уверенно входит в четверку основных мировых растительных масел. С каждым годом растет не только мировое производство и потребление этого продукта, но и расширяется сфера его применения, который, в основном, используется в кондитерской, хлебопекарной, молочной промышленности, производстве мороженого и косметической (Терещук, 2006). Такая же тенденция наблюдается и в других странах. Основное достоинство пальмового масла - прежде всего низкая цена. Даже с учетом транспортных издержек по доставке его в РФ оно дешевле подсолнечного масла местного производства на 200-250 долларов за 1 тонну. Кроме того, пальмовое масло обладает оптимальными физико-химическими характеристиками. Низкая температура плавления (около 37С) и высокая устойчивость к окислению позволяют активно его использовать в производстве разнообразных продуктов питания (Синьковская, 2006).
Современная мировая тенденция состоит в увеличении объемов применения пальмового масла в рецептурах традиционных продуктов питания взамен гидрогенизированных жиров для снижения содержания в них трансизомеров жирных кислот (Комаров, 2006; Стеценко, 2006). Роль пальмового масла на российском рынке возрастает также в связи с введением в действие в 2004 г. ГОСТ Р 52100-2003 «Спреды и смеси топленые», в соответствии с которым устанавливается ограничение уровня трансизомеров в жировой фазе этих продуктов - не более 8% (Нечаев, 2005; Гуляев-Зайцев, 2005; Стеценко, 2006).
Федеральная администрация по продуктам и лекарствам США узаконила требования по снижению содержания трансизомеров в продуктах питания и необходимости декларирования об их содержании. Начиная с 2006 г. на всех пищевых продуктах должна размещаться информация о содержании трансизомеров, чтобы потребители могли сделать выводы о полезности продуктов для здоровья (Сандрам, 2006).
Пальмовое масло начали экспортировать в Европу в конце XVIII века. Масло добывали примитивным способом с плохим качеством, поэтому оно шло на технические цели, в частности для изготовления мыла. В начале XX века экспорт пальмового масла в Европу составлял 120 тысяч тонн. Пальмовое и пальмоядровое масла производят, в основном, в Малайзии и Западной Африке. Его добывают из плода пальмы масличной (Elaeis guineensis). Пальмовое масло добывают из его мезокарпия, а пальмоядровое - из ядра (Жуковский, 1982).
Малазийское бюро по пальмовым маслам спонсировало более 168 исследований для оценки пальмового масла и его компонентов в основном через научные связи с институтами Америки, Европы и Австралии. В ходе исследований на добровольцах были зарегистрированы наблюдения о том, что пальмовое масло, входящее в состав диеты в рекомендованных дозах потребления жира, не приносит вреда здоровью человека. При этом не возникает риска заболеваний коронарных сосудов сердца из-за увеличения холестерина в крови (Mancha, 1994; Сандрам, 2006).
В соответствии с рекомендациями НИИ питания РАМН суточное потребление жиров для населения должно соответствовать 95-100 г, в том числе жидких растительных масел 20-25 г. При этом для сбалансированного питания рекомендуемое соотношение жирных кислот: полиненасыщенных - 20-30%, мононенасыщенных - 40-60% и насыщенных 20-30% (Лобанов, 2003; Быкова, 2004; Григорьева, 2005; Нечаев, 2005; Комаров, 2006).
Пальмовое масло окрашено от темно-желтого до темно-красного цвета. Содержит от 40 до 50% насыщенных жирных кислот, из которых 32-40%) приходится на пальмитиновую от суммы кислот. Из ненасыщенных жирных кислот это масло содержит главным образом олеиновую и немного линолевой (Зиновьев, 1952).
Пальмитиновая кислота входит в состав почти всех масел и жиров, особенно твердых. В маслах её содержание не велико, и лишь в некоторых из. них превышает 10%, например таких маслах как хлопковое (20-24%) и какао (23-24%) (Тютюнников, 1974).
В Советском Союзе потребности в твердых жирах масложировая промышленность удовлетворяла за счет животных жиров и хлопкового пальмитина, который поступал из Средней Азии в значительных количествах. После развала Советского Союза возникли перебои по поставкам как твердых жиров в связи со снижением животноводства, так и за счет уменьшения плантаций хлопка в Средней Азии. Перед Российской масложировой промышленностью в 90-х годах встал вопрос о поиске нового сырья со значительном содержанием пальмитиновой кислоты, то есть твердых жиров (Лищенко, 2001).
Условия, материал и методы исследования
Исследования проводили в лаборатории генетики на центральной экспериментальной базе ВНИИ масличных культур им. B.C. Пустовойта в 2001-2006 гг. ЦЭБ ВНИИМК расположена на второй террасе реки Кубань на землях, прилегающих к северо-восточной части города Краснодара. Почвы опытных полей института представлены сверхмощным, слабогумусным, выщелоченным черноземом (Блажний, 1958).
ЦЭБ ВНИИМК находится в центральной части Краснодарского края, относящейся к зоне неустойчивого увлажнения. Средняя годовая сумма осадков составляет 643 мм, в летние месяцы их выпадает около 180 мм. В период вегетации растений подсолнечника часто наблюдаются засухи. Все данные представлены метеостанцией "Круглик".
Среднегодовая температура воздуха составляет + 11,4С, средняя многолетняя температура самого холодного месяца (января) равна -2,3С, самого тёплого (июля) +23,4С. Практически ежегодно бывают понижения температуры до -22С, а в летние месяцы температура иногда достигает 38-40С. Продолжительность безморозного периода в условиях Краснодара достигает 193 дней.
Посев начинался, как правило, в первой декаде мая. Посев проводили ручными сажалками, гнездовым способом, с размещением гнезд 70 х 35 см. В одно гнездо помещали по две-три семянки. Каждый рядок включал в себя по 25 гнезд. Уход заключался в проведении междурядной культивации и ручной прополке в течение всего сезона.
В наших исследованиях использованы формы подсолнечника селекции ВНИИМК: сорта Мастер (среднеспелый) и Круиз (скороспелый). Инбредные линии генетической коллекции ВНИИМК с различными морфологическими маркерными признаками - КГ 102 (эректоидный тип расположения листа), КПЗ (абрикосовые язычковые цветки), ВИР721 (веерное жилкование листа, темно-фиолетовые рыльца пестиков); по признаку состава жирных кислот - ЛГ26 (высокоолеиновая); НА413 и RHA416 (высоколинолевые), ЛГ27 (с повышенным содержанием олеиновой кислоты), а также селекционная линия ВК66 и её высокоолеиновый аналог BK660/. Кроме того, были использованы селекционные родительские линии коммерческих и перспективных гибридов - ВК464, ВК678, ВК580, ВК876,ВК591.
Растения изолировали за один-два дня до начала цветения в фазу появления краевых цветков из-под обертки. Для уменьшения влияния неблагоприятного микроклимата при изоляции растений на созревание семян использовали специальный материал "Спанбонд", из которого были изготовлены индивидуальные изоляторы. Нижние края индивидуального изолятора плотно обжимали по стеблю и обвязывали шнуром, а этикетку с информацией: № делянки, даты начала цветения, опыления и скрещивания опускали в изолятор. Во время вегетации проводили фенологические наблюдения и определяли сроки полных всходов и начала цветения.
Принудительное самоопыление и гибридизацию подсолнечника осуществляли общепринятым методом (Гундаев, 1971). Материнские растения подготавливали к скрещиванию для ручной кастрации, т.е. предварительно изолировали, а затем ежедневно утром с 6 до 8 часов у раскрывшихся трубчатых цветков тонким пинцетом удаляли сросшиеся в трубку и выдвинувшиеся пыльники. После кастрации каждого растения пинцет и руки стерилизовали раствором этанола. Для большей надежности кастрации это растение обмывали водой из пульверизатора. На следующий день кастрировали следующие круги вновь раскрывшихся трубчатых цветков этой же корзинки. Кастрация одного соцветия осуществлялась за 4-5 дней. Иногда для сокращения дней кастрации вырезали центр корзинки скальпелем. Помимо ручной кастрации для получения материнских форм использовали ЦМС. К опылению (скрещиванию) выбранных и подготовленных родительских растений обычно приступали после 10 часов утра, когда влажность воздуха снижалась, исчезала роса, и воздух был в достаточной мере прогрет. Проведенное скрещивание, как правило, повторяли через один-два дня, так, что пыльца с одного и того же отцовского растения наносилось на материнское растение до 2-3 раз.
Получали гибриды F] от реципрокных скрещиваний, а также F2, F3 и ВС. При достаточно больших различиях скрещиваемых форм по срокам цветения, необходимости проведения биохимического анализа пыльцы для установления генотипа при получении ВС или использовании её в следующем поколении пыльцу с отцовского растения собирали в пергаментный пакет и хранили в холодильнике при температуре + 5С от семи дней до восьми месяцев.
Каждое растение обмолачивали вручную отдельно от других. Семена помещали в отдельный пакет, на который переносили всю информацию с этикетки. Ежегодно вели работу с тремя, как правило, последовательными генерациями: одно поколение - в полевых условиях и два - в осенне-весенний период в камере фитотрона (Клюка, 1980). В сосуды ёмкостью 10 л на дно укладывали дренаж из керамзита, вставляли трубку для полива и заполняли почвенно-песчаной смесью с добавлением азотно-фосфорного удобрения. В одном сосуде выращивали от одного до четырех растений. В случае необходимости период покоя семян преодолевали путём проращивания недозрелых двухнедельных зародышей семян сначала на фильтровальной бумаге, а затем - в стаканчиках с почвенно-песчаной смесью (Рамазанова, 1986). Посев в сосуды проводили, как правило, семянками отдельных искомых корзинок после анализа средних проб (50 шт. семянок) или зародышами с частью семядолей с известным составом жирных кислот.
В связи с тем, что величина признаков состава жирных кислот и токоферолов определяется генотипом зародыша, расщепление по фенотипу связано с различием между отдельными семенами в пределах одной корзинки. Потребность в отборе беккроссных семянок вызвала необходимость использования микрометодов определения названных биохимических признаков в отдельном семени с сохранением его жизнеспособности.
Определение состава жирных кислот в масле проводили в виде их метиловых эфиров с помощью газожидкостной хроматографии. Для этого использовался газовый хроматограф Хром-5 с пламенно-ионизационным детектором и с непосредственным сбором информации через АЦП в персональный компьютер и последующей полуавтоматической обработкой данных хроматограмм специальной программой CHROM 2000. При анализе состава жирных кислот масла в отдельных семенах с сохранением их жизнеспособности отрезали ly U часть семядолей (10-25 мг), не затрагивая осевых органов. Отрезанные части семядолей помещали в пробирку, добавляли в неё 20-30 мг Na2S04, растирали с помощью стеклянной палочки содержимое. В случае использования при анализе средних проб измельчали 50 шт. семянок на мельнице, тщательно перемешивая отбирали 100 мг образца. После чего в обоих случаях приливали 0,5 мл раствора КОН (3N) в метаноле, 1 мл гексана и периодически встряхивая выдерживали пробирки при комнатной температуре два часа. Затем добавляли 0,5 мл воды, и после перемешивания содержимого в пробирке круговым движением и непродолжительного отстаивания отбирали верхний гексановый слой с метиловыми эфирами жирных кислот. Растворитель упаривали под вентилятором, остаток растворяли в определенном объеме гексана и вводили в хроматограф. Условия хроматографирования: температура термостата колонки 184С; расход газа-носителя, азота - 30 мл/мин, водорода - 25 мл/мин; стеклянная колонка длиной 1,5 метра и диаметром 3 мм; жидкая фаза - этиленгликольсукцинат (15%) на твёрдом носителе Хроматон-N AW с дисперсностью 0,125-0,200 мм.
Исходное фенотипическое варьирование содержания пальмитиновой кислоты
Для изучения фенотипического варьирования содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника были взяты широко распространенный, обычный по содержанию жирных кислот сорт Мастер и высокоолеиновый сорт Круиз. Индивидуально анализировали по 40 отдельных семян суперэлиты каждого сорта урожая 2005 г.
У сорта Мастер по содержанию пальмитиновой кислоты в масле семян наблюдалось слабое фенотипическое варьирование в пределах от 4,6 до 6,8%о, которое в среднем составляло 5,4% от суммы кислот. Наряду с этим обнаружена значительная изменчивость по содержанию олеиновой и линолевой кислот. Эти различия составили около 30%), а пределы варьирования были от 28,6 до 58,6% и от 33,7 до 63,6% соответственно (табл. 3.1).
На содержание пальмитиновой кислоты может оказывать влияние высокоолеиновая мутация, которая является отличительной особенностью сорта Круиз. В масле семян этого сорта среднее значение пальмитиновой кислоты составило всего 4,1% при варьировании от 3,1 до 5,1% от суммы кислот. Высокое содержание олеиновой кислоты 88,4%о в среднем при значительной изменчивости от 60,8 до 92,8% обусловлено присутствием трех семянок из сорока изученных с содержанием этой кислоты менее 76%).
Снижение содержания пальмитиновой кислоты в масле семян сорта Круиз связано с плейотропным действием высокоолеинового гена 01, что согласуется с раннее полученными данными (Харченко, 1981; Demurin, 1996; Atlagic, 1997).
Низкие значения коэффициентов вариации для содержания пальмитиновой кислоты у обоих сортов (9,4 и 14,3), возможно, указывают ограничения отбора, направленного на повышение величины этого признака. Таким образом, работа по поиску более надежных источников признака была продолжена.
Изучение содержания пальмитиновой кислоты в семенах селекционных линий и линий генетической коллекции ВНИИМК (около 150 образцов) показало более существенные различия. Большая часть этих сортообразцов была включена в коллекцию благодаря наличию различных хозяйственно-ценных, биохимических и маркерных признаков без учета содержания насыщенных жирных кислот. Все эти константные инбредные линии (7-Ю самоопылений) отбирались с определенным составом жирных кислот, поэтому коэффициент вариации не превышал 10%. Выявленные различия по содержанию пальмитиновой кислоты в два раза между линиями BK876CV (4,8%) и ВИР721 (10,0%) представляют интерес для изучения генетического контроля этого признака, но не могут иметь селекционного применения. Поэтому вопрос по поиску более надёжного источника продолжал оставаться актуальным.
Сотрудники лаборатории генетики ВНИИМК в 80-90 гг. прошлого века дважды выделяли биотипы подсолнечника с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты (около 25%). В первом случае после обработки химическим мутагеном семян сорта Юбилейный 60, в Мз была обнаружена указанная мутация. Во втором случае, высокопальмитиновым фенотипом обладали семена, полученные от самоопыления растений коллекционного образца ИН-429934 из Афганистана. В обоих случаях по характеру расщепления при самоопылении признак наследовался по моногенному рецессивному типу. Однако низкая жизнеспособность семян выделенных образцов не позволила получить донорские линии.
Работы по поиску мутаций продолжались. Для чего ежегодно проводили анализы семян исходного материала, используемого отделом гетерозисной селекции подсолнечника ВНИИМК по определению состава жирных кислот. Кроме этого исследовали содержание отдельных жирных кислот в масле семян подсолнечника коллекционных образцов различного происхождения, современных сортов, селекционных линий и отечественных и иностранных ЦМС линий, поступающих во ВНИИМК для экологических испытаний.
В результате широкомасштабного поиска по признаку состава жирных кислот в сентябре 2001 г. была обнаружена мутация, с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника у стерильной линии (ЦМС), полученной из Украины в рамках обмена селекционным материалом. Содержание пальмитиновой кислоты в масле 15 проанализированных семянок этой линии урожая 1997 г. варьировало от 11,3 до 26,6% (табл. 3.3).
Способ создания аналогов родительских линий с измененным составом жирных кислот
На протяжении нескольких десятилетий в селекционной работе используется метод многократных возвратных скрещиваний (беккроссов), например, для передачи устойчивости к определённым патогенам от дикорастущих форм растений культурным сортам без потери полезных агрономических качеств последними. Известен способ описанный С. Бороевичем, согласно которому перед каждым скрещиванием проводят выделение гетерозиготных генотипов беккроссных растений и практикуют следующее чередование; после трех беккроссов два самоопыления, с целью отбора в полевых условиях особей, обладающих передаваемым признаком, и использования их при дальнейшем насыщении (Бороевич, 1984). Однако допущение самоопыления на промежуточном этапе насыщающих скрещиваний увеличивает срок создания изогенных линий.
Поэтому, больший практический интерес представляет подход, основанный на непрерывной схеме беккроссов, предложенный А.Ф. Мережко, когда отбор гетерозиготных генотипов также проводится на каждом этапе беккроссирования, а насыщающие скрещивания осуществляются без чередования с самоопылением (Мережко, 1984).
В гетерозисной селекции подсолнечника этот метод используется в основном при создании ЦМС-аналогов материнских линий, а так же при передаче генов устойчивости к некоторым патогенам. Как правило, в качестве реципиента используются обе родительские формы интересующего коммерческого гибрида подсолнечника. После пяти (где эффективность замещения составляет 98,4%), шести (99,2%) или семи (99,6%) беккроссов по непрерывной схеме получают аналоги или почти изогенные линии, которые сохранили селекционно-ценные признаки реципиента и получили от донорской линии передаваемый признак. В селекции подсолнечника на качество масла используется ряд модификаций вышеописанного метода (Демурин, 1988; Ефименко, 2000а). Самым трудным моментом в этой работе является отбор гетерозиготных генотипов на каждом этапе скрещиваний.
Как один из вариантов для решения этой проблемы предложен способ получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений на основе непрерывной схемы беккроссов и возможности надёжной идентификации генотипа беккроссных растений (Ефименко, 20006). Принципиальное отличие метода заключается в том, что в каждом беккроссном поколении берут недозрелые (через 12-14 дней после оплодотворения) семянки, отделив их от соцветия, удаляют с каждой плодовую и семенную оболочки, разрезают на две части, одну из них (часть семядоли без осевых органов зародыша) используют для биохимического анализа с целью установления генотипа беккроссных семянок, в частности по жирнокислотному составу масла, а оставшуюся часть семянки помещают на питательную среду на 5-7 дней, т.е. до образования первой пары настоящих листьев и хорошо развитой первичной корневой системы. По результатам анализа идентифицируют гетерозиготные проростки и переносят их в торфяные стаканчики, заполненные почвенной смесью, предварительно отмыв корни проростков от питательной среды. Стаканчики с растениями помещают в камеру искусственного климата для надёжного укоренения. После образования первой-второй пары настоящих листьев растения пересаживают в почву и выращивают до репродуктивного возраста, а собранную с них пыльцу наносят на кастрированные цветки растения-реципиента для получения следующего беккроссного поколения.
Большая трудоемкость создания изогенных линий этим способом и необходимость применения биотехнологических приёмов выступали в качестве основных ограничивающих факторов для его широкого использования.
Результаты изучения наследования в F и онтогенетической изменчивости признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты, рассмотренные в главе 3, предопределили разработку нового способа получения изогенных линий по доминантному признаку. Рассадный способ выращивания проанализированных семян не всегда позволял получать хорошо развитые растения. Зачастую лучшее растение по передаваемым биохимическим признакам оказывалось самым худшим в плане роста и развития. В связи с этим появилась необходимость разработки способа создания изогенных линий совмещающего получение хорошо развитых растений и возможности надёжной идентификации генотипа по передаваемому признаку.
Принципиальное отличие разработанного нами метода, на который получен патент на изобретение № 2290785 (приложение 2), заключается в том, что отбор гетерозиготных генотипов беккроссных растений производится на ранней стадии появления всходов в полевых условиях с сохранением жизнеспособности проростков.
Нашими исследованиями была выявлена возможность выделения гетерозиготных беккроссных растений в период, когда они находятся в стадии проростков и сохраняют органы с достаточным для проведения анализа количеством запасных веществ. Это оказалось реальным на этапе развития, когда семядоли оказываются вынесенными над поверхностью почвы и освобожденными от околоплодника, но ещё не перешли к аутотрофному питанию, при котором доминантный признак семян уже не идентифицируется.
Непрерывная схема беккроссов проводилась по общеизвестной методике. А именно реципиент скрещивали с донором доминантного признака (ген А), а затем - с гибридами первого поколения (Fi), что приводило к образованию фенотипически неоднородных семян первого поколения беккросса (BQ), 50% которых имели генотип аа и 50% -генотип Аа, являющийся гетерозиготным по передаваемому признаку .
