Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы. Эффективная реализация контролирующих программ клеточного управления зависит от гена р53, который находится на верхней ступени иерархии генов, поскольку его белковый продукт является транскрипционным фактором и участвует в контроле клеточного цикла, апоптоза, старения клеток и связанных с ними фенотипических проявлений. Актуальность проблемы Р53-зависимой регуляции клеточных процессов несомненна как для медицины, так и для животноводства. Нарушение регуляции ростовых процессов и злокачественная трансформация клеток более чем в половине случаев связаны с изменениями в структуре гена и, соответственно, белка Р53 (Копнин, 2008). Поэтому в медицине и ветеринарии решение данной проблемы приблизит к пониманию молекулярных механизмов онкологических заболеваний и их лечению, а в селекции будет расширен спектр генетических маркеров, используемых для улучшения фенотипов сельскохозяйственных животных.
Для решения проблемы ростовых процессов, и связанных с ними злокачественных трансформаций клеток, важно изучение регуляции экспрессии гена р53 и изучение структурных особенностей мутантных или полиморфно-аллельных вариантов гена и их функциональной активности. К особенностям регуляции транскрипции гена р53 относят его широкую мутабельную активность, наличие изоформ и полиморфизмов, характерных для Dt р53, а также зависимость от других регуляторных белков, в том числе, MDM2 (Чумаков, 2000). В настоящее время показано, что большинство мутаций в гене р53 человека обнаруживаются в эволюционно-консервативном домене белка, причем в определенных, так называемых, «горячих точках» (Копнин, 2000). При патологии нарушения могут происходить не только вследствие мутаций в самом гене, но и в регуляторных элементах, что может приводить к изменению экспрессии гена (Dobash 1993). Однако данных о структурной организации гена р53 свиней недостаточно. Неизвестны мутации, которые могли бы приводить к изменениям в фенотипе, имеющим как хозяйственное значение, так и являющихся патологическими. Значительный интерес представляют исследования, направленные на изучение регуляции экспрессии гена р53 и позволяющие сформировать подходы к управлению активностью гена и его целенаправленной регуляции.
1.2. Целью исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей гена р53 свиней и его полиморфных вариантов.
В задачи исследования входило:
1. Изучить структурно-функциональную организацию гена р53 млекопитающих, построить филогенетическое древо и оценить степень гомологии гена р53 человека, свиньи и мыши;
2. Исследовать мутационную изменчивость гена р53 свиней в 5-ом и 7-ом экзонах;
3. Изучить морфологические изменения моноцитов и их ядер при действии патологических агентов липополисахарида Е. соli и холестерола;
4. Изучить некоторые аспекты небелковой регуляции экспрессии гена р53 свиней в связи с участием липидов в апоптозе и влиянием холестерола на транскрипцию гена р53;
5. Провести компьютерное моделирование и экспериментально обосновать связывание холестерола с промотором гена р53 свиней.
1.3. Научная новизна работы. В сравнительном аспекте рассмотрены структурно-функциональные особенности гена р53 у человека, мыши и свиньи, установлена высокая степень гомологии, свидетельствующая о генетическом сходстве гена. Впервые секвенированы последовательности нуклеотидов 5-го и 7-го экзона гена р53 свиней, в которых сосредоточены «горячие точки мутагенеза», различающихся скоростью прироста мышечной массы. Впервые показаны изменения в спектре и окисленности эндогенных липидов в моноцитах крови мышей и их ядрах при липополисахарид-индуцированном апоптозе. Проведено исследование влияния холестерола на экспрессивную активность гена р53 свиней и выявлено его дозозависимое влияние на транскрипцию. Определены последовательности нуклеотидов в промоторной области гена, обладающие повышенным сродством к холестеролу и выявлен гиперхромный эффект при связывании холестерола с олигонуклеотидами. Получены данные, свидетельствующие об участии экзогенного холестерола в реализации апоптотической программы в моноцитах крови свиньи.
1.4. Научно-практическая значимость работы
Проведенные исследования, связанные с выявлением мутаций в гене р53 и изучением генной экспрессии, вносят вклад в решение фундаментальной проблемы биологии развития – проблемы молекулярных механизмов процессов роста, в том числе и злокачественного роста клеток. Исследование имеет не только теоретическую, но и практическую значимость, поскольку позволяет на основе выявления мутаций формировать группы риска и проводить профилактические мероприятия, а в животноводстве – с помощью новых маркерных последовательностей идентифицированных в гене р53, осуществлять мероприятия маркерной селекции, направленные на отбор животных с более эффективным ростом организма.
Сравнительные исследования гомологичных участков гена р53 млекопитающих (человека, свиньи и мыши) позволяют расширить сведения о мутационной изменчивости гена р53 и влияние ее на фенотип организмов, геном которых до конца не секвенирован. Полученные данные по изучению транскрипции гена р53 свиней рекомендуем – для поиска новых способов влияния на клеточные процессы, связанные с белком Р53 (апоптоз, клеточный цикл, репарация ДНК, клеточное старение).
Положения, выносимые на защиту:
1. Высокая степень гомологии гена р53 свиньи с геном человека и общность молекулярных механизмов регуляции генной экспрессии.
2. Спектр мутационной изменчивости в 5-ом и в 7-ом экзоне, оценка фенотипа свиньи в сравнительном аспекте.
3. Перестройка в спектре липидов при липополисахарид-индуцированном апоптозе моноцитов и изменение транскрипционной активности гена р53 мышей.
4. Компьютерное моделирование и экспериментальное обоснование связывания холестерола с промотором гена р53 свиней.
1.5. Апробация работы. Материалы диссертации, опубликованы в трудах: XXXVII, XXXVIII Огаревских чтениях Мордовского госуниверситета (Саранск, 2009, 2010); съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); Всероссийской заочной научно-практической конференции с Международным участием (Саранск, 2009); региональной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения Н.Ф. Санаева (Саранск, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.
1.6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 40 рисунков, 14 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 261 источника, в том числе 140 – опубликованных в зарубежных журналах.
Похожие диссертации на Структурно-функциональная организация гена P53 свиней и его полиморфных вариантов
