Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Основные повреждающие факторы при замораживании спермы сельскохозяйственных животных 8
1.2. Способы повышения криоустойчивости спермы быков 17
1.3. Современные методы и синтетические среды, используемые для криоконсервации спермы быков 27
1.4. Влияние биологически факторов на результативность искусственного осеменения коров 36
2. Методика исследований 43
3. Результаты исследований 57
3.1. Выявление оптимальных соотношений веществ, входящих в состав усовершенствованной среды для замораживания спермы быков 57
3.2. Изучение криозащитного влияния на сперму быков низкомолекулярных тиольных соединений 61
3.3. Влияние синтетических жирорастворимых антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов быков к замораживанию 67
3.4. Анализ криопротективного влияния на сперму быков эфира глицерина 70
3.5. Изучение криозащитного влияния сухого соевого лецитина 73
3.6. Влияние состава синтетических сред на уровень АТФ в сперматозоидах быков 77
3.7. Результативность осеменения коров спермой, замороженной в разных синтетических средах 78
3.8. Эффективность выявления вируса ИРТ и возбудителей лептоспироза методом ПЦР в сперме быков, замороженной с желтком или с сухим соевым лецитином 80
3.9. Влияние перорального и внутримышечного введения быкам-производителям селеноорганического препарата ДАФС-25 на криоустойчивость их сперматозоидов 83
3.10. Изучение возможности повышения оплодотворяемости коров в летний период 88
3.10.1. Влияние внутримышечного введения коровам антиоксиданта амбиола на результативности их осеменения 88
3.10.2. Содержание продуктов пероксидации липидов в крови коров после инъекции амбиола 91
4. Обсуждение результатов 93
5. Выводы 104
6. Практические предложения 106
7. Список литературы 107
- Способы повышения криоустойчивости спермы быков
- Влияние биологически факторов на результативность искусственного осеменения коров
- Влияние синтетических жирорастворимых антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов быков к замораживанию
- Эффективность выявления вируса ИРТ и возбудителей лептоспироза методом ПЦР в сперме быков, замороженной с желтком или с сухим соевым лецитином
Введение к работе
Актуальность работы. Искусственное осеменение животных является высокоэффективным методом улучшения породных и продуктивных качеств животных путем использования семени высокоценных племенных производителей. Огромное значение для практики искусственного осеменения и размножения животных имеет метод хранения спермы производителей в глубокозамороженном состоянии. При этом возможно сохранять сперму выдающихся производителей в течение очень продолжительного времени и производить ее транспортировку на любые расстояния.
В большинстве стран мира для искусственного осеменения крупного рогатого скота используется криоконсервированная сперма. Но несмотря на достаточно высокую эффективность этого метода в молочном скотоводстве, имеется еще ряд малоизученных вопросов, которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров и телок замороженной спермой. В частности, в процессе замораживания спермы быков погибает более половины половых клеток. Изучение причин данного явления и разработка более совершенных синтетических сред для замораживания спермы быков, позволило бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе криооб-работки и их оплодотворяющую способность.
Кроме того, результативность искусственного осеменения коров и телок криоконсервированной спермой все еще остается не достаточно высокой.
В этой связи необходимы дальнейшие исследования в области совершенствования синтетических сред для замораживания спермы быков и повышения результативности искусственного осеменения крупного рогатого скота с помощью различных биологически активных соединений.
В последние годы появились данные о важной роли микроэлемента селена в процессах сперматогенеза у самцов. Вопросы о влиянии различных препаратов селена на воспроизводительную функцию быков и крио-устойчивость их семени изучены в недостаточной мере и требуются дальнейшие углубленные исследования в данном направлении.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы является совершенствование синтетической среды для глубокого замораживания спермы быков и улучшение оплодотворяемости коров с помощью биологически активных веществ.
Для выполнения этой цели в диссертации изучались следующие вопросы;
усовершенствовать синтетическую среду для замораживания спермы быков путем исключения из ее состава продуктов животного происхождения;
выяснить защитный эффект при замораживании спермы быков сухого соевого лецитина,
изучить протективное влияние низкомолекулярных тиольных соединений при замораживании спермы быков; провести сравнительное изучение криозащитных свойств некоторых синтетических жирорастворимых антиоксидантов на сперматозоиды быков;
проанализировать криопротективную активность эфира глицерина при замораживании спермы быков;
исследовать влияние парентерального и перорального введения быкам селеноорганического препарата ДАФС-25 на биохимические показатели спермы и устойчивость сперматозоидов к глубокому замораживанию;
выяснить эффективность однократного внутримышечного введения коровам в летний период синтетического воднорастворимого антиоксиданта амбиола на результативность искусственного осеменения и биохимические показатели крови. Научная новизна исследований. Разработана усовершенствованная Трис-глюкозо-лимоннокислая синтетическая среда для замораживания спермы быков. Впервые изучено криозащитное влияние на сперму быков сухого соевого лецитина и эфира глицерина. Исследовано защитное влияние низкомолекулярных тиольных соединений при замораживании спермы быков. Проанализировано криопротективное влияние трех синтетических жирорастворимых антиоксидантов на сперматозоиды быков. Показано, что введение быкам- производителям с пониженной подвижностью сперматозоидов селеноорганического препарата ДАФС-25, способствует повышению активности в семенной плазме антиоксидантного фермента глутати-онпероксидазы и увеличению живучести замороженно-оттаянных сперматозоидов. Установлено положительное влияние инъекции коровам перед осеменением синтетического воднорастворимого антиоксиданта амбиола на их оплодотворяемость.
Практическая значимость. Усовершенствованная Трис-глюкозо-лимоннокислая синтетическая среда для замораживания спермы быков, повышает биологическую полноценность сперматозоидов и улучшает результативность осеменения коров. Использование в составе данной среды сухого соевого лецитина, вместо желтка куриного яйца, снижает возможность переноса инфекционных заболеваний при искусственном осеменении животных. Однократное внутримышечное введение коровам перед осеменением в летний период антиоксиданта амбиола способствует повышению результативности их искусственного осеменения.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Ученом Совете ВНИИПлем, 2002-2003гг; Научно-производственной конференцией на ВВЦ, 2002 г.; Расширенной межотдельской конференцией ВНИИПлем, 2004 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы. Объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов исследований, выводов и практических предложений. Диссертация включает 22 таблицы. Список литературы содержит 223 источника, в том числе 128 на иностранном языке.
Способы повышения криоустойчивости спермы быков
Для успешного сохранения спермы быков в процессе глубокого замораживания до -196 С, большое значение имеет состав синтетической среды для ее разбавления и замораживания.
Важнейшим открытием в области криоконсервации семени животных является обнаружение защитного влияния глицерина при замораживании спермы животных и птиц (Polge С. е.а, 1949; Polge С, Row-son L.E.,1952).
Однако, механизм защитного действия глицерина при замораживании спермы животных окончательно не выяснен и по данному вопросу имеется множество исследований и предположений.
В частности, установлено, что включение глицерина в состав растворов, способствует снижению точки их замерзания (Платов Е.М.. 1973; Пушкарь Н.С. и др., 1984). При этом глицерин, проникая внутрь клетки, замещает определенную часть свободной воды и вытесняет электролиты. Он играет роль противосолевого буфера и способствует переохлаждению системы, а также укрепляет клеточные мембраны.
Криозащитное действие глицерина было впервые продемонстрировано русскими исследователями еще в 1937 году, при замораживании спермы животных и птиц до -21 С (Бернштейн А.Д., Петропавловский В.В., 1937).
Но только после открытия английских ученых (Polge С, е.а, 1949), он стал применяться в практике искусственного осеменения. Продолжительность эквилибрации спермы животных с глицерином перед замораживанием обычно составляет 4-6 часов (Платов Е.М., 1963; Осташко Ф.И., 1978; Nagase Н., Niwat.Д964). При замораживании спермы быков глицерин вводят в состав разбавителя в концентрации 4-7% (Милованов В.К., 1962; Пакенас П.И.. 1972; Наук В.А., 1982; Nagase Н., Niwa Т.,1964). Но несмотря на положительное влияние глицерина при замораживании, он может оказывать и отрицательное влияние на сперматозоиды. В частности, он может способствовать повреждению акросом и плазматических мембран сперматозоидов, а также подавляет дыхательную активность в половых клетках (Варнавский А.Н. 1970; Watson P.F., Martin J.C., 1975). Кроме того, глицерин способствует активации акросомной реакции у сперматозоидов (Slavik Т.,1987). Несмотря на то, что впервые в мире потомство от замороженной спермы животных было получено без использования глицерина (Смирнов И.В.,1949), замораживание спермы быков и баранов без глицерина приводит к резкому снижению оплодотворяемости (Лопатко М.И., Тю-пина К.Ф.,1971; Лянсберг Э.С., 1974; Gibson С, Graham Е., 1969; Abdel-hakeam А. е.а, 1991). К настоящему времени проведено много исследований по изучению возможности замены глицерина в составе синтетических сред для замораживания спермы быков на другие криопротекторы.
При этом было установлено, что защитным действием на сперматозоиды быка при замораживании обладают диметилсульфоксид (Lovelock J.Е., Bishop M.W.,1959), диметилформамид (Бугров А.Д. и др., 1972), полиэтиленоксид (Осташко Ф.И., 1978), этиленгликоль и диэти-ленгликоль (Платов Е.М., 1973). Но данные соединения не оказали заметных преимуществ при замораживании спермы быков по сравнению с глицерином, а в некоторых случаях оказывали даже токсичное действие на половые клетки животных.(Watson P.F., 1979; Fahy G.M., 1986). Другим важным событием в вопросе криоконсервации спермы животных явилось открытие защитного действия желтка куриных яиц против холодового шока сперматозоидов (Phillips PH., Lardy Н.А., 1940). Причем, более высокое криозащитное действие оказывают липо-протеиды желтка (Семенова В. А., 1987; Kampachmidt R.F., е.а, 1953). Криозащитное влияние желтка на сперматозоиды, Милованов В.К. и Соколовская И.И. (1959) объясняют способностью лецитина проникать внутрь клеток и понижать точку плавления липидов. По мнению Осташко Ф.И. (1978), механизм защитного действия желтка при криоконсервации сперматозоидов объясняется его наслаиванием на поверхности клеток и образованием с липопротеидами гидрофобной фазы, в которой не растворяются или слабо растворяются осмотически активные вещества, в результате чего замедляется диффузионный и осмотический обмен между клеткой и средой. С помощью флуоресцентных меток было показано, что яичный желток связывается с плазматической мембраной сперматозоидов (Watson P.F., 1975). Некоторые исследователи считают, что защитное действие желтка на сперматозоиды при криоконсервации связано с его разупорядочи-ваюшим действием на липиды плазматических мембран (Кононов В.П., 1984; Ерохин А.С. и др., 1989). Предпринимались исследования по замене желтка куриных яиц в составе замораживающих сред на другие липидные вещества. Было установлено, что отдельные липоглобулины желтка обладают повышенной защитной эффективностью при холодовом ударе сперматозоидов быка и барана (Платов Е.М., 1973). В экспериментах Семеновой В.А. (1987) было доказано, что липо-протеины высокой плотности, выделенные из желтка куриных яиц, оказывали более высокий защитный эффект на сперматозоиды, в сравнении с липопротеинами очень низкой плотности. Эти различия могут быть связаны с тем, что липопротеиды высокой плотности способны акцептировать холестерин из мембранных структур клеток, в результате чего снижается микровязкость липидных областей мембраны (Панасенко О.М., 1987). По мнению большинства исследователей, главными компонентами желтка куриного яйца, оказывающими защитное действие на сперматозоиды, являются фосфолипиды, содержащиеся во фракции липо-протеинов низкой плотности (Расе М., Graham Е., 1974; Foulkes J.s 1977; Watson P., 1981).
Влияние биологически факторов на результативность искусственного осеменения коров
На оплодотворяемость коров большое влияние оказывают разнообразные факторы: содержание, кормление, продуктивность животных, зоогигиенические условия, климатические условия и т.д. (Милованов В.К, 1962; Foote R., 1996).
Известно, что после искусственного осеменения коров крио-консервированной спермой, оплодотворяемость яйцеклеток может достигать 82 - 90%, однако стельность наступает только у 50-60 % самок (Гордон А., 1988; Wishart D.F. е.а,1974; Shelton J.N., е.а,1979; Foote R., 1996).
Высокий уровень гибели эмбрионов у КРС отмечается между 8 и 12 днями после искусственного осеменения (Diskin M.G., Sre-enan J.M.,1980).
По мнению других исследователей, наибольший процент гибели эмбрионов после искусственного осеменения коров отмечается между 8 и 18 днями (Roche J.F., 1981).
Одной из причин пониженной результативности искусственного осеменения коров криоконсервированнои спермой, может быть воздействие различных стресс-факторов. Например, в результате кормового стресса, снижается оплодотворяемость коров (Гордон А., 1988).
Отрицательное влияние на оплодотворяемость коров оказывает и повышенная температура окружающей среды (Stott G.H., Wiersma F., 1976; WawkFL, 1979).
Во время теплового стресса у коров снижается потребление корма и развивается отрицательный энергетический баланс (Cavesany D., е.а, 1985).
Современными исследованиями установлена взаимосвязь между стрессом и повышением концентрации в крови АКТГ, глюко-кортикоидов и катехоламинов, что подтверждает активизацию под влиянием стресса гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. Это оказывает отрицательное влияние на репродуктивную функцию животных (Goldstein D., 1987; Rivier С, Rivest S.; 1991).
В экспериментах на коровах было доказано, что АКТГ и глю-кокортикоиды снижают секрецию гонадолиберина в гипоталамусе (Hein К., Allrich R.,1992). При этом снижается концентрация ЛГ в крови животных (Stoedel D.P., Moberg G.P., 1982).
Кроме того, доказано прямое влияние клюкокортикоидов на яичники коров, что оказывает негативное воздействие на созревание и овуляцию яйцеклеток (Peter А.Т. е.а,1990; Kawate N.E. е.а, 1993). В последние годы установлено, что при стрессе в организме животных выделяются эндогенные опиоидные пептиды (Owens Р., Smith R., 1987) и биогенные амины (Plotsky Р., 1989; Kotwica J. е.a, 1994), которые также оказывают отрицательное влияние на воспроизводительную функдию животных.
По данным Ealy A.D. е.а, (1993), тепловой стресс у коров снижал скорость развития эмбрионов и их выживаемость при воздействии в 1-й день беременности, но не оказывал отрицательного влияния на трех-дневных эмбрионов.
Экспериментально доказано, что эмбрионы разных видов животных чувствительны к воздействию повышенных температур, о чем свидетельствуют опыты с культивированием эмбрионов вне организма (Alliston C.W. е..а., 1965; Gwazdauskas F.C. е.а„ 1992; Ealy A.D. е.а, 1994). При воздействии повышенной температуры могут образовываться свободные радикалы, которые и оказывают отрицательное влияние на жизнеспособность ранних эмбрионов (Loven DP., 1988).
Для снижения отрицательного влияния теплового стресса при культивировании эмбрионов вне организма, было предложено использовать в составе инкубационной среды антиоксиданты: восстановленный глутатион (Ealy A.D. е.а, 1992), витамин Е (Arechiga С. е.а, 1994) и таурин (Malayer J.R. е.а„1992). При этом было отмечено их положительное защитное влияние на развитие эмбрионов мышей и коров.
Влияние синтетических жирорастворимых антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов быков к замораживанию
Известно, что в половых клетках животных, при криоконсервации могут активизироваться процессы перекисного окисления липидов, что способствует повреждению плазматических мембран, ДНК, белков и других биомолекул в сперматозоидах. Результатом этого может быть снижение оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы животных (Наук В.А., Гуськов А., 1983; AitkenR.e.a,, 1989). С целью предотвращения перекисного окисления липидов в сперме животных, предлагается использовать в составе разбавителей различные антиоксиданты (Шайдуллин И.Н., 1980; Наук В.А., 1982; Милованов В.К., Соколовская И.И., 1984; Кононов В.П., Нарижный А.Г., 1985; Watson P.F.e.a, 1995). В задачу наших исследований входило изучение защитного влияния синтетических жирорастворимых антиоксидантов (ИХФГАН-3, ИХФГАН-4 и ИХФГАН-5) на подвижность и живучесть сперматозоидов быка после замораживания в усовершенствованной Трис-глюкозо-лимоннокислой среде. В предварительных лабораторных исследованиях были выяснены нетоксичные дозировки этих антиоксидантов для сперматозоидов быка (таблица 7). Проведенные исследования показали, что нетоксичные дозировки всех изученных антиоксидантов находятся в пределах 0,04-0,16 мг/мл среды. Результаты изучения криозащитного влияния различных дозировок антиоксидантов при глубоком замораживании спермы быков, представлены в таблице 8. Как видно из таблицы 8, все исследуемые антиоксиданты не оказали положительного влияния на подвижность и живучесть замороженно-оттаянных сперматозоидов.
В настоящее время основным криопротектором при замораживании спермы сельскохозяйственных животных является глицерин. Но наряду с защитным действием, глицерин может оказывать и отрицательное влияние на биологическую полноценность сперматозоидов (Варнавский АН, 1970;1978; Slavic Т., 1987). В этой связи проводятся исследования по изучению возможности замены глицерина в составе криоконсервирующих сред на другие протекторы. Имеются сообщения о высоком защитном влиянии эфиров глицерина при замораживании клеток костного мозга крыс и тромбоцитов человека. Учитывая, что на сперме быков, криозащитная эффективность эфиров глицерина не изучалась, целью наших исследований было выяснение защитного влияния эфира глицерина при глубоком замораживании спермы быков. Результаты опытов по изучению влияния различных концентраций эфира глицерина на сперму быков представлены в таблице 9. Анализ таблицы 9 показывает, что эфир глицерина оказывает выраженный криозащитный эффект на сперматозоиды быков при их глубоком замораживании. Причем, больший криозащитный эффект эфира глицерина проявляется при низкой его концентрации в составе среды: 1-3%. Повышение концентрации эфира приводило к снижению подвижности и живучести оттаянных сперматозоидов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение эфира глицерина в состав Трис-глюкозо-лимоннокислой среды в концентрации 1-2%, оказывает практически такой же защитный эффект при заморажива нии сперматозоидов быка, как и применение оптимальной концентрации глицерина (5-6%). Относительно времени экспозиции криопротекторов со сперматозоидами перед замораживанием, существует неоднозначное мнение. Например, некоторые исследователи предлагают вводить глицерин в уже разбавленную и охлажденную до 4С сперму (Наук В.А., 1982; Entwistle K.W., Martin 1С, 1972), другие - добавлять его непосредственно в состав среды или в разбавленную, но не охлажденную сперму (Миловалов В.К., Соколовская И.И., 1984; Evans G., 1978). Поэтому мы решили провести исследования по влиянию времени экспозиции данного эфира глицерина со спермой быков, на устойчивость их половых клеток к замораживанию. Эфир глицерина вводили в разбавленную и охлажденную до 4 С сперму, за определенное время до ее замораживания. Результаты этого опыта приведены в таблице 10.
Эффективность выявления вируса ИРТ и возбудителей лептоспироза методом ПЦР в сперме быков, замороженной с желтком или с сухим соевым лецитином
В связи с увеличением в последние годы случаев заболеваемости быков производителей различными инфекциями, необходима разработка современных методов выявления присутствия патогенов в криоконсерви-рованной сперме животных.
В задачу наших исследований, проведенных совместно с профессором Обуховым И.Л., входило выяснение возможности определения присутствия вируса ИРТ и лептоспир в криоконсервированной сперме быков с помощью метода ПЦР. Результаты выделения вируса ИРТ в оттаянной сперме, представлены на рисунке 2. Как видно из электрофореграммы, при использовании для замораживания спермы быков сухого лецитина, отчетливо выявлялись антигены вируса ИРТ. В случае замораживания спермы с желтком куриного яйца, присутствие антигенов не обнаруживается.
Анализ эксперимента по выделению антигенов лептоспир в криоконсервированной сперме быков, показал, что использование в разбавителе сухого соевого лецитина, позволило обнаружить антигены лептоспир, даже в низкой концентрации (100 и 10 лептоспир/см ). При введении в состав среды желтка куриного яйца, чувствительность данного метода была низкой.
Следовательно, желток куриного яйца в составе разбавителя, не позволяет надежно выявлять присутствие вируса ИРТ и лептоспир в заморо-женно-оттаянной сперме быков с помощью метода ГЩР. Вероятно, это связано с тем, что в желтке содержится большое количество различных белков, ферментов, фрагментов ДНК и других веществ, которые могут ин-гибировать полимеразную цепную реакцию. Использование сухого лецитина в составе разбавителя для спермы быков, способствует нормальному протеканию реакции и обнаружению патогенных антигенов в их сперме. Это может иметь большое практическое значение для профилактики переноса инфекционных заболеваний при искусственном осеменении животных.
В последние годы установлено, что недостаток селена в организме самцов может приводить к ухудшению подвижности сперматозоидов, различным морфологическим изменениям в половых клетках (Scott R.e.a,, 1998), а также к снижению их оплодотворяющей способности (Irvine D, 1996).
Дополнительная обработка быков препаратами селена, может способствовать улучшению качества семени, (Слободяник В.И. и др., 2000).
В задачу наших исследований входило изучение возможности повышения устойчивости сперматозоидов быков к глубокому замораживанию, путем обработки животных селеноорганическим препаратом ДАФС-25 (диацетофенонилселенид),
С этой целью на Ногинском племпредприятии было отобрано 6 быков, характеризующихся пониженной подвижностью сперматозоидов в на-тивных эякулятах. Они были разделены на две группы: по 3 быка в каждой. Первой группе быков, ДАФС-25 вводили однократно внутримышечно, в дозе 250 мг на животное. Второй группе - ДАФС-25 давали совместно с комбикормом, четырехкратно в течение 2 недель, в общей дозе 1000 мг препарата на быка. Контролем (п=3) служили быки с нормальными показателями подвижности сперматозоидов. У быков всех групп через определенные интервалы времени анализировали содержание селена в сперме, активность в сперме антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы, а также изучали подвижность сперматозоидов до и после замораживания.
Результаты изучения содержания селена в сперме быков до и после введения ДАФС-25, показаны в таблице 16. Как видно из таблицы 16, у быков опытных и контрольной групп содержание селена в семенной плазме до начала эксперимента было примерно одинаковым, хотя у животных первой и второй группы отмечалось несколько пониженное содержание селена.
Проведенные анализы через 2 месяца после обработки быков препаратом показали, что концентрация селена в семенной плазме животных первой и второй группы увеличилась по сравнению с начальным уровнем, соответственно, на 9,8 и 7,6% (Р 0,05). Через 3 месяца после введения ДАФС-25, концентрация селена в семенной плазме быков этих групп увеличилась на 15,6 и 15,3% (Р 0,05).
В семенной плазме контрольных животных концентрация селена на протяжении изучаемого периода времени была практически неизменной: 112; 115 и 112 мкг/л через 30, 60 и 90 дней.
Анализ изучения активности фермента глутатионпероксидазы в семенной плазме быков, в зависимости от времени после введения ДАФС-25, суммирован в таблице 17.
