Введение к работе
Актуальность проблемы. Последнее десятилетие ознаменовалось интенсификацией разработки и совершенствования инновационных клеточных репродуктивных биотехнологий в свиноводстве (Prather R.S, et al., 2003). Получения эмбрионов in vitro для трансплантации, трансгенез и клонирование, создание линий эмбриональных стволовых клеток для дальнейшей ксенотрансплантации органов - все эти технологии основываются на базовом методе созревания донорских ооцитов свиней in vitro (Miyoshi К., et.al., 2002, Boquest A.C., et al., 2002). Несмотря на несомненные успехи в этой области, оплодотворяемость ооцитов, развитие из них интактных, клонированных или трансгенных эмбрионов продолжают оставаться на низком уровне (Ikeda K,Takahashi Y., 2001 ;Соу P., et al., 2005; Won J.Y.,2009). Множество факторов детерминируют формирование зрелой яйцеклетки in vitro: возраст животного-донора, размер фолликула, морфология ооцит-кумулюсного комплекса, среда для созревания ооцитов и культивирования эмбрионов, качество сперматозоидов, температурный и газовый режимы (Marchal R., et al., 2001; Dubuc A., Sirard M.. A., 1995; Nagai Т., 2001). Отбор ооцит-кумулюсных комплексов для культивирования - начальный этап клеточных репродуктивных технологий, определяющий дальнейший успех или неудачу экспериментов (Sirard М.А.,2007). Исходная популяция донорских ооцитов, используемых в экспериментах, гетерогенна. Разработка эффективных тестов оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов -важная задача эмбриотехнологов. Рост ооцита и формирование зрелой яйцеклетки в организме - комплексный процесс преобразования хроматина и структурно-функционалыплх изменений ооплазмы и клеточных органелл. В связи с этим, особый интерес представляет сравнительный анализ статуса хроматина кумулюса и ооцитов, функционального состояния митохондрий, уровня содержания кальция в ооцитах, выделенных из фолликулов разного диаметра, и отобранных с помощью витального красителя бриллиантового кристаллического голубого (ВСВ - индикатора активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеиазы (G6PDH).
Диссертационная работа выполнена в соответствии с программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 годы по теме: 06.01.03 «Исследовать молекулярно-генетические, биохимические, цитологические и эмбриологические процессы, лежащие в основе трансгенеза, создать генноинженерные конструкции и разработать способы, повышающие эффективность биоинженерных технологий получения животных с заданными свойствами» № гос. регистрации: 15070.7815014664.06.8.001.0.
Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследовать процесс формирования зрелой яйцеклетки свиньи in vitro на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания и разработать
4 эффективный тест биологической полноценности ооцитов с целью раннего прогнозирования способности к развитию из них эмбрионов
В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:
1. Провести мониторинг овариальных фолликулов свиней с учетом
диаметра фолликула, степени васкуляризации, тургора, статуса хроматина
соматических клеток фолликула (кумулюса и гранулезы), уровня
содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;
2. Оценить исходную популяцию донорских ооцитов свиней,
выделенных из фолликулов разного диаметра на основе ВСВ-теста (маркер
активности G6PDH) и содержания депонированного кальция;
Определить интенсивность флуоресценции родамина 123 (ИФР123) в ооцитах свиней с нормальным и дегенерированным хроматином на разных стадиях мейоза;
Оценить перспективы использования различных систем культивирования для получения зрелых яйцеклеток и доимплантационных эмбрионов свиней на основе следующих параметров:
стадии мейоза ооцитов;
степени экспансии клеток кумулюса;
уровня пикнозов в клетках кумулюса;
интенсивости флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos;
оплодотворяемости ооцитов;
развития доимплантационных эмбрионов.
Научная новизна. Впервые были получены следующие данные:
дегенерация хроматина соматических клеток антральных фолликулов свиней сопровождается возрастанием уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;
на основе ВСВ-теста выявлена гетерогенность популяции донорских ооцитов свиней. В фолликулах диаметром менее 3 мм содержится достоверно меньшее число ВСВ (+) ооцитов по сравнению с фолликулами d - 3-5 и более 5 мм (71% против 86%, соответственно);
- растущие ВСВ (-) и завершившие фазу роста ВСВ (+) ооциты
отличаются по уровню содержания кальция во внутриклеточных депо;
- изменения в интенсивности флуоресценции родамина 123 в ооцитах
связаны со статусом хроматина (стадией мейоза и дегенерацией);
- при использовании в среде созревания ВСВ(+) ооцитов свиней
структурных элементов фолликула и фолликулярной жидкости снижается
доля ооцитов с дегенерацией хроматина, возрастает интенсивность
флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos; повышается число
эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе использования маркеров ядерно-цитоплазматического созревания (статус хроматина, уровень содержания депонированного кальция, функциональное состояние митохондрий) теоретически обоснована и разработана модель экстракорпорального созревания ооцитов свиней.
5
Прослежена динамика флуоресценции родамина 123 в ооцитах на разных
стадиях мейоза, отмечены достоверные различия в показателях
интенсивности флуоресценции ооцитов с нормальным и дегенерированным
хроматином. Показано что процесс формирования зрелой яйцеклетки
сопровождается повышением интенсивности флуоресценции MitoTracker
Orange CMTMRos в ооцитах, созревших в присутствии структурных
элементов фолликулов. Деление ооцитов на «растущие» и «выросшие» с
помощью индикатора активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
позволило выявить гипераккумуляцию ионов кальция во внутриклеточных
депо ВСВ(+) ооцитов, что может свидетельствовать о снижении уровня
метаболической активности перед реинициацией мейоза. Проанализирован
характер ооцит-кумулюсных взаимодействий в процессе созревания
ооцитов в различных системах культивирования. Активная экспансия
клеток, снижение уровня пикнозов свидетельствует о возможности
увеличение «продуктов» секреции клеток кумулюса (не затронутых
деструктивными изменениями), детерминирующих формирование
факторов, ответственных за приобретение ооцитами компетентности к завершению мейотического созревания, оплодотворению и развитию эмбрионов. Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ВСВ(+) ооцитов свиней из фолликулов диаметром 3-5 мм на основе использования структурных элементов фолликула и его жидкости, позволяющей повышать выход зрелых яйцеклеток и биологически полноценных эмбрионов свиней.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 - в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Международных конференциях: "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии", ВИЖ, Москва, 2008; «Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ», Гродно, Беларусь, 26-27 августа 2009; 25-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации по трансплантации эмбрионов, Польша, сентябрь 2009; "Научное обеспечение развития АПК в условиях реформирования", Санкт-Петербург-Пушкин, январь 2009.
Положения, выносимые на защиту:
Популяция ооцитов свиней из фолликулов диаметром 3-5 мм гетерогенна и состоит из ВСВ(+), завершивших фазу роста (86%) и ВСВ(-)ооцитов растущих (14%);
В ВСВ(+) ооцитах свиней уровень содержания кальция во внутриклеточных депо превышает таковой в ВСВ (-) ооцитах;
Деструктивные изменения хроматина в кумулюсных и гранулезных клетках из фолликулов свиней сопровождаются возрастанием уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;
Уровень интенсивности флуоресценции родамина 123 в ооцитах свиней изменяется в зависимости от статуса хроматина (стадии мейоза и дегенерации);
В ооцитах, созревших в присутствии структурных элементов фолликулов (стенок фолликулов - СФ) и фолликулярной жидкости (ФЖ), достоверно возрастает интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos;
Использование для созревания ооцитов in vitro структурных элементов фолликулов (диаметр d = 3-5мм) в комплексе с гормонами и ФЖ (d фолликулов 3-5мм) позволяет получать 38% эмбрионов на стадиях поздней морулы, бластоциста.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 230 источников, в том числе 216 на иностранном языке. Диссертация изложена на 121 странице, включает 10 таблиц, 27 рисунка (в том числе 17 фотографий).
Похожие диссертации на Оценка биологической полноценности ооцитов свиней на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания
