Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 9
1.1. Генетический полиморфизм 9
1.2. Полиморфизм групп крови 12
1.3. Полиморфизм генетических систем белков и ферментов крови
1.3.1. Полиморфизм сывороточных белков и ферментов 19
1.3.2. Полиморфизм эритроцитарных белков и ферментов
1.4. Полиморфизм последовательностей ДНК лошадей 30
1.5. Использование генетического полиморфизма в селекции 36
1.6. Генетическая дифференциация пород лошадей 41
1.7. Местные породы лошадей и их генетико-популяционные 53
характеристики
ГЛАВА 2. Материал и методика исследований 64
2.1. Характеристика поголовья лошадей 64
2.2. Методики определения полиморфизма белков и ферментов крови лошадей
2.2. Методики определения полиморфизма ДНК 69
2.3. Генетико-статистический анализ 70
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 73
3.1. Структура аллелофонда заводских пород лошадей 73
3.2. Структура аллелофонда местных пород лошадей 113
3.2.1. Структура аллелофонда субпопуляций и внутрипородная дифференциация вятской лошади
3.2.2. Структура аллелофонда субпопуляций и внутрипородная дифференциация мезенской лошади
3.2. Особенности полиморфизма использованных маркеров 132
3.3. Межпородная генетическая дифференциация 140
3.5. Повышение эффективности генетической идентификации лошадей 147
3.5.1. Эффективность расширенной панели биохимических маркеров в контроле происхождения лошадей
3.5.2. Изучение полиморфизма RAPD-PCR маркеров лошадей и 149
межпородная дифференциация по ДНК маркерам
ГЛАВА 4. Выводы. практические предложения 153
5.1. Выводы 153
5.2. Практические предложения 154
Список использованной литературы 155
- Полиморфизм сывороточных белков и ферментов
- Методики определения полиморфизма белков и ферментов крови лошадей
- Структура аллелофонда субпопуляций и внутрипородная дифференциация вятской лошади
- Эффективность расширенной панели биохимических маркеров в контроле происхождения лошадей
Полиморфизм сывороточных белков и ферментов
Основой генетического анализа особей, пород и популяций является использование явления генетического полиморфизма.
Использование фенотипических признаков не всегда позволяет делать конкретные выводы об их наследовании вследствие целого ряда причин. Морфологический полиморфизм сильно подвержен влиянию условий внешней среды, а многие признаки являются не качественными, а количественными, и их анализ часто недостаточно точен. Еще одним ограничивающим использование такого рода маркеров фактором является непостоянство в течении всей жизни организма.
Современный генетический анализ базируется на применении трех основных типов генетических маркеров. Маркеры групп крови, полиморфных белков и ферментов, а также последовательностей ДНК получили широкое распространение в теоретических и прикладных исследованиях генетики сельскохозяйственных животных. Кодоминантный характер наследования вариантов используемых генетических систем позволяет быстро и с высокой точностью определять фенотип животных. Постоянство на протяжении всей жизни животного обеспечивает возможность проведения многократных исследований без опасения получения недостоверных данных.
Полиморфизм, по Ford Е. В., 1945 - это одновременное присутствие в популяциях двух или нескольких вариаций признака, причем пропорции этих вариаций таковы, что частота самой редкой из них не может обусловливаться только интенсивностью мутационного процесса в данном локусе, а является результатом гетерозиготного состояния уже существующих аллелей. Распространенным является положение, что локус может считаться полиморфным только в том случае, когда частота наиболее распространенного аллеля этого локуса не превышает 0,95 (Ф. Айала, 1984, Ф. Айала, Дж. Кайгер, 1988).
Фордом была предложена классификация форм полиморфизма, согласно которой выделяют следующие типы полиморфизма: сбалансированный полиморфизм, характеризующийся постоянным оптимальным соотношением полиморфных признаков. Даже незначительное отклонение от такого соотношения оказывается неблагоприятным для популяции. Генетико-автоматические процессы в сбалансированной популяции направлены на устранение всякого рода отклонений от оптимального соотношения признаков в популяции. Сбалансированный полиморфизм возникает под действием противоположных сил отбора, направленных на элиминацию снижающих приспособленность популяции генов в гомозиготном состоянии. Однако такие гены могут существовать в популяции в гетерозиготном состоянии; переходный полиморфизм является переходной стадией в период замены определенного гена его аллелем (возникшим в результате мутации или превнесенным из другой популяции), имеющим большую по сравнению с исходным селекционную ценность; нейтральный полиморфизм основывается на существовании гена или совокупности генов, практически нейтральных в отношении приспособленности (и выживаемости) особей. Распределение в популяции признаков, контролирующихся такого рода генами имеет случайный характер и может значительно изменяться вне зависимости от условий.
Современные исследователи разработали два основных подхода к трактованию возникновения и существования явления полиморфизма. Одна группа исследователей (Дубинин Н. П., Глембоцкий Я. Л., 1967) полагает, что полиморфизм групп крови, белков и ферментов и последовательностей ДНК возник и поддерживается в ходе естественного отбора, то есть для определенных генетически детерминированных вариантов существует селективное преимущество, поддерживающееся отбором. При изменении условий существования происходит приток в популяцию мутантных аллелей, носители которых приобретают некие новые качества. Мутантные аллели, закрепляющиеся в аллелофонде популяции в ходе микроэволюции могут как утрачиваться, так и получать значительное распространение. В норме концентрация мутантных аллелей, снижающих адаптивные качества организмов в популяции поддерживается естественным отбором на низком уровне, а аллели, дающие их носителям некие преимущества встречаются со значительно более высокой частотой. Доказанной может считаться гипотеза о селективном преимуществе гетерозиготных по некоторым локусам особей у сельскохозяйственных животных (Шлегер В. и др., 1982).
Вторым подходом является теория, утверждающая, что полиморфизм традиционных генетических маркеров является селективно нейтральным, и появление и исчезновение новых вариантов происходит постоянно с относительно постоянной частотой. По мнению Kimura М, в основе эволюционных изменений на молекулярном уровне, то есть изменений генетического материала, лежит не дарвиновский естественный отбор, а случайная фиксация нейтральных или почти нейтральных мутаций (Kimura М., 1977, Kimura М, Ohta Т., 1975). Исходя из этого можно предположить, что распределение аллельных частот в популяциях случайно, а уровень генетической изменчивости нейтрален по отношению к отбору. Теория нейтральности трактует полиморфизм белков и ДНК-последовательностей как переходную фазу молекулярной эволюции и отвергает представление, согласно которому большинство таких систем полиморфизма имеет адаптивное значение и в пределах вида поддерживается одной из форм балансирующего отбора (Кимура М., 1985). Основным приложением теории селективного нейтрализма генетически детерминированных вариантов белков и последовательностей ДНК в настоящее время является математическое моделирование времени эволюционного процесса различных групп организмов.
Однако в настоящее время накоплено достаточное количество фактов, свидетельствующих о приспособительных различиях между генотипическими классами особей-носителей разных аллозимов. Первым из такого рода исследований было изучение аномальных электрофоретических вариантов гемоглобина, связанных с серповидноклеточной анемией (Pauling et. al., 1949). Получены данные о непосредственной связи строения молекул ферментов, которую можно проследить электрофоретически, и температурным оптимумом работы этих ферментов (Алтухов Ю. П., 1989). Разные адаптивные качества носителей разных типов изоферментов показаны у многих видов животных и растений (Кайданов Л. 3., 1996).
Полученные при исследовании генетического полиморфизма у сельскохозяйственных животных данные позволили выявить в некоторых случаях корреляции между наличием определенных генетических маркеров и хозяйственно-полезными признаками и адаптивными качествами отдельных особей и пород.
Методики определения полиморфизма белков и ферментов крови лошадей
Одним из важных аспектов изучения генетической межпородной дифференциации является исследование местных, аборигенных пород лошадей и сравнение их с заводскими породами с целью накопления данных, которые могут позволить с большей точностью определять филогенетические связи между породами. Большая точность в установлении таких взаимоотношений между породами позволит в последующем выделить панель маркеров, характерных для характеристики межпородных отличий.
Местные породы не только зачастую обладают исключительно высокими адаптивными качествами, но и являются живыми памятниками культуры создавших их народов и представляют огромную историко-этнографическую ценность (М. В. Костюченко и др., 2001). По мнению И. А. Созинова, «утрачивая генофонды локальных пород и сортов, ...страны теряют возможность возрождения собственной аграрной науки в будущем в связи с исчезновением уникального селекционного материала, генетическая структура которого находится в соответствии с конкретными локальными условиями разведения (Созинов И. А. и др., 1996)». Изучение генофонда местных пород лошадей представляет интерес также в плане оригинальности генетической структуры и выявления полигенов, в которые входят гены, отвечающие за высокие адаптационные качества животных.
Во второй половине XX века большинство стран мира столкнулось с проблемой резкого сокращения численности местных пород. Изменение требований к породам привело к дифференцированию их на «коммерческие» и «некоммерческие». «Неконкурентноспособность» местных пород привела к недостаточному вниманию к их чистопородному разведению и условиям содержания. Еще в середине 80-х годов прошлого века, после резкой активизации природоохранных мероприятий в отношении редких диких видов многие исследователи обратили внимание на редкие и исчезающие породы сельскохозяйственных животных и птиц. Сегодня мероприятия по восстановлению и поддержанию в стабильном состоянии генофондов редких пород проводятся под эгидой FAO/UNEP.
Проведенные исследования показали, что коневодство занимает третье место по остроте ситуации в отношении сокращения генетических ресурсов -в мире насчитывается 120 пород лошадей, находящихся в угрожающем состоянии, что составляет 31.25 % от общего числа пород лошадей (Столповский Ю. А., 1997).
Исчезающие и находящиеся под угрозой породы лошадей были отмечены в США, странах Южной Америки, Азии и Европы (WWL:DAD 2, FAO, 1997). Уже в 1982 г. в предварительном докладе по генетическим ресурсам сельскохозяйственных животных в странах Западной Европы было названо 24 породы и популяции лошадей, находящихся под угрозой полного исчезновения (Maijala К., 1982).
В 80-е годы в СССР также встала проблема сохранения генофонда отечественных аборигенных пород сельскохозяйственных животных. По данным Иванова К.М. и Пароняна И.А., 1982, в СССР из 57 пород и породных групп 14 имели статус находящихся в состоянии резкого сокращения численности и исчезновения (Паронян И. А., Иванов К. М., 1982, Дмитриев и. А. И др., 1994). В мероприятиях по коневодству предусматривалось сохранение местных пород путем создания генофондно-реликтовых хозяйств и ферм в зонах их распространения.
По материалам Всемирного банка данных по генетическим ресурсам животных (WWL-DAD:2, Всемирный список многообразия домашних животных), в России насчитывается 36 наиболее распространенных пород лошадей, из которых 17 находится в угрожающем состоянии.
Ряд ценных местных пород, разводящихся только на территории России, находятся под угрозой полного исчезновения. МСХП РФ, РАСХН И РАН была создана Федеральная программа «Сохранение генофонда малочисленных пород сельскохозяйственных животных на 1995-2005 г.г.». На территории Российской Федерации разводится более 200 пород и породных групп сельскохозяйственных животных разного направления продуктивности и типов, сформировавшихся в результате длительной селекционной работы в различных природно-климатических условиях. В перечень пород, подлежащих сохранению, включены 103 породы основных видов сельскохозяйственных животных, в том числе 11 пород крупного рогатого скота, 13 пород овец, 5 пород коз, 8 пород свиней и 14 пород лошадей (вятская, чумышская, тувинская, верхнеенисейская, мезенская, приобская, калмыцкая, советская тяжеловозная, владимирская тяжеловозная, орловская рысистая, арабская чистокровная, ахалтекинская, карачаевская, печорская).
Полученные данные о критическом статусе ряда пород послужили основанием для проведения работ по разработке методов их сохранения и восстановления. Основными направлениями сохранения аборигенных пород стали сохранение замороженной спермы и эмбрионов и разведение в малых популяциях (Иванов К. М, Паронян И. А., 1982). Основа метода разведения небольших популяций была заложена исследованиями жизнеспособности популяций животных, разводимых в зоопарках (Р. Ланде, Дж. Ф. Бэрроуклаф, 1989).
Разведение в небольших популяциях требует высокого уровня контроля биологического разнообразия. Центральной концепцией природоохранной генетики является понятие о приспособленности, которую принято подразделять на кратковременную (средняя жизнеспособность и плодовитость живущих в настоящее время особей) и потенциальную. Потенциальная приспособленность в огромной степени зависит от уровня генетического разнообразия, уменьшение которого значительно снижает шансы на адаптацию и выживание популяции в будущем (Frankel О. Н., 1983). Общепринятым является мнение, что генетическое разнообразие позволяет расширить границы адаптивной нормы животных. Однако процесс поддержания в породах широкой изменчивости входит в противоречие с процессом постоянного повышения селекционного процесса (Игнатьева Е.А., 1997). Но даже в очень ограниченных по численности популяциях аборигенных пород лошадей поддерживается относительно высокий уровень генетического разнообразия (Дымань Т. Н., 2002). Впервые это явление было обнаружено при анализе данных генетического маркирования лошади Пржевальского (Глазко В. И., Созинов И. А., 1993).
Структура аллелофонда субпопуляций и внутрипородная дифференциация вятской лошади
Заметная дифференциация орловской и русской рысистых пород обнаружена при анализе частот встречаемости генотипов, включающих аллель Tf4 Если у орловской рысистой породы суммарная доля таких генотипов очень высока (55,50 %), то у русской рысистой этот показатель составил всего 7,07 %.
Типы трансферрина, включающие аллель аллель if1 не были представлены в исследованной выборке американской стандартбредной породы и, по-видимому, у русской рысистой породы являются заимствованными от производителей орловской рысистой породы.
Частоты встречаемости генотипов, включающих аллель Тг были сравнимыми и у русской и у орловской рысистых пород (незначительно выше этот показатель был у русской рысистой породы) и значительно отличались от таковых у американской стандартбредной породы, где доля таких генотипов сильно занижена (суммарная частота составила всего 1,79 %).
Американская стандартбредная порода чрезвычайно резко отличалась по распределению генотипов локуса трансферрина от орловской и русской рысистых. Это проявилось в определенном обеднении аллелофонда по этому локусу (в исследованной выборке выявлено всего 7 генотипов). Преобладающими по встречаемости были генотипы трансферрина FF (57,14 %) и DF (28,57 %), остальные типы отмечены с низкой частотой (00-0,89 %, DD-5,36 %). В выборке обнаружен единичный генотип трансферрина ОО, не отмеченный у других исследованных нами рысистых пород.
Полученные нами данные о распределении генотипов трансферрина в целом подтверждают промежуточное положение русской рысистой породы в отношении исходных пород - орловской и американской стандартбредной. Интересно, что некоторые генотипы, например, включающие аллель Tf получили у русской рысистой породы большее распространение, чем у исходной орловской рысистой, однако сравнение теоретического и эмпирического распределения генотипов выявило больший эксцесс генотипов, включающих аллель Tf8, у орловской рысистой породы. В популяции американской стандартбредной породы при выраженном обеднении аллелофонда локуса трансферрина наблюдается существенное нарушение генного равновесия.
При электрофоретическом исследовании локуса сывороточной карбоксилэстеразы у всех рысистых пород было выявлено 6 генотипов (таблица 16).
Для представителей орловской рысистой породы типично преимущественное распространение четырех типов (в соответствии с частотой встречаемости- GI, II, GG и FI). С меньшей частотой встречаются генотипы карбоксилэстеразы FF и FG.
Для русской рысистой породы ряд генотипов, выстроенных по частоте их распространения в исследованной выборке выглядит несколько иным образом - II-»GI- FI. Обращает на себя внимание резкое, почти пятикратное по сравнению с орловской рысистой породой, снижение частоты встречаемости генотипа GG.
Для американской стандартбредной породы наиболее типичны генотипы карбоксилэстеразы II, FI, GI, причем более половины генотипов в выборке - II. Типы карбоксилэстеразы FF, FG и GG представлены единично (0,89-2,68%).
Для всех трех пород отмечена общая тенденция распределения генотипов, проявляющаяся в преимущественном распространении генотипов, имеющих в своем составе аллель Es1. Однако проявляется эта тенденция в разной степени. Если для орловской рысистой породы значения встречаемости генотипов, включающих аллели Es1 и EsG близки, то в популяции русской рысистой породы встречаемость генотипов, имеющих в своем составе аллель Es1 определенно выше. Наиболее резко выделяется по этому показателю американская стандартбредная порода, суммарная частота встречаемости генотипов включающих аллель Es1 составляет 94,64 %. В целом можно сделать вывод о промежуточном характере распределения генотипов локуса карбоксилэстеразы у русской рысистой породы лошадей между орловским и американским рысаком, что вполне соответствует истории происхождения этой породы.
Наибольший показатель отклонения от генетического равновесия по локусу карбоксилэстеразы зафиксирован в популяции лошадей орловской рысистой породы, наименьший - у американской стандартбредной породы. Необходимо отметить, что значения параметра %2 для локуса карбоксилэстеразы были значительно ниже, чем для локуса альбумина.
Эффективность расширенной панели биохимических маркеров в контроле происхождения лошадей
Все изученные нами локусы белков и ферментов крови были проанализированы с целью выявления особенностей их полиморфизма.
По разнообразию встречаемости генотипов и аллелей наиболее полиморфным был локус трансферрина. У разных пород лошадей число выявленных генотипов и аллелей было неодинаковым. Так, максимальное количество генотипов (15), включающих распространенные аллели локуса выявлено нами только в выборке лошадей мезенской породы. 14 генотипов трансферрина отмечено у орловской и русской рысистых пород. В исследованных выборках чистокровной верховой, буденновской, ахалтекинской и вятской пород встречалось 13 электрофоретически определяющихся типов трансферрина. 12 типов отмечено у животных арабской чистокровной и кузнецкой пород. Наименьшее генетическое разнообразие по встречаемости генотипов локуса трансферрина наблюдалось в американской стандартбредной породе, среди представителей которой было обнаружено всего 7 электрофоретических типов. Для всех пород, кроме американской стандартбредной, было характерным наличие всех пяти распространенных аллелей локуса. При исследовании популяции шетлендских пони обнаружен не отмеченный у других пород аллель Тт .
В локусе альбумина у всех исследованных пород лошадей нами было обнаружено 3 генотипа. Генотипы, включающие редкий аллель А1 обнаружены не были. Особенности распределения аллельных частот подробно рассматривались при характеризации отдельных пород.
Локус сывороточной карбоксилэстеразы у орловской, русской рысистых, американской стандартбредной, арабской чистокровной и всех трех местных пород был представлен 6 генотипами. В выборках буденновской и ахалтекинской пород число представленных генотипов эстеразы было ниже (обнаружено 5 типов). Для чистокровной верховой породы характерно наличие всего трех генотипов локуса эстеразы. У шетлендских пони отмечен аллель EsH в составе генотипа HI.
В локусе карбоангидразы нами было выявлено от 4 (у орловской рысистой и вятской пород) до 9 (у кузнецкой породы) аллелей. Наибольшей частотой у всех исследованных пород характеризовался аллель Са1, однако были отмечены и 3 других аллеля: CaF, CaL, Са, что позволило включить систему карбоангидразы как удовлетворяющую условиям исследования.
В локусе 6-фосфоглюконатдегидрогеназы обнаружены аллели PGDD, PGD и PGD , встречающиеся в составе 5 генотипов из 6 возможных. Аллель PGD встречался у ахалтекинской, американской стандартбредной, арабской чистокровной, мезенской и кузнецкой пород в составе генотипа DF, типов 6-ФГД DD и DS обнаружено не было.
В локусе малатдегидрогеназы было выявлено 2 аллеля, условно обозначенных нами как MDHF и MDHS Указанные аллели встречались в составе всех трех возможных генотипов.
Были вычислены показатели коэффициента гомозиготности и уровня полиморфности (эффективного числа аллелей) отдельных локусов и общий коэффициент гомозиготности, традиционно использующиеся для описания особенностей полиморфизма. Значения этих параметров для заводских пород представлены в таблицах 41 и 42.
Наибольшие средние значения коэффициента гомозиготности по шести изученным локусам характерны для чистокровной верховой и американской стандартбредной пород. Однако, коэффициенты гомозиготности по отдельным локусам у представителей разных пород определенным образом различались. Так, наибольшая степень гомозиготности была характерна для орловской рысистой породы по локусу карбоангидразы. В целом при анализе распределения значений коэффициента гомозиготности по отдельным локусам наибольшие значения этого параметра были отмечены для карбоангидразы, а наименьшие - для генетической системы трансферрина, однако отдельные породы имели определенные особенности этого показателя.
Сравнение коэффициента гомозиготности локуса трансферрина разных пород лошадей показало широкую вариативность этого показателя. Так, наименьший уровень коэффициента гомозиготности по этому локусу отмечен у орловской рысистой породы, а наибольший - у американской стандартбредной. В локусе альбумина показатель коэффициента гомозиготности был сравним у всех исследованных пород, за исключением ахалтекинской и шетлендских пони, для которых было характерно значительное увеличение этого показателя. В локусе сывороточной карбоксилэстеразы наименьшее значение коэффициента гомозиготности наблюдалось у орловской рысистой породы, а максимальное - у чистокровной верховой. Исследование локуса карбоангидразы показало, что у всех пород, кроме ахалтекинской и шетлендских пони наблюдается увеличение значения коэффициента гомозиготносте этого локуса. Максимального значения этот показатель достигает у орловской рысистой породы и является самым высоким значением среди всех исследованных культурных пород. В локусе 6-ФГД коэффициент гомозиготносте сравним у большинства исследованных пород, за исключением ахалтекинской, американской стандартбредной и русской рысистой, для которых отмечено повышение значений гомозиготности. В локусе малатдегидрогеназы коэффициент гомозиготности значительно выше у русской рысистой, ахалтекинской, буденновской пород. В несколько меньшей степени повышение гомозиготности этого локуса свойственно орловской рысистой породе и шетлендским пони.
В целом по шести изученным локусам наибольшее значение коэффициента гомозиготности отмечено у американской стандартбредной породы, наименьшее - у орловской рысистой.
Исследование уровня полиморфности локуса (эффективного числа аллелей) показало, что и этот параметр имеет выраженную вариативность. Наибольшего значения средний уровень полиморфности достигает у орловской рысистой породы, наименьшее значение зафиксировано у чистокровной верховой. Наибольшие значения характерны для локусов трансферрина, в остальных локусах этот показатель не превышает 2.00, однако сильно варьирует между породами.
