Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1.1 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем 8
1.2 ДНК- технологии в молекулярном маркировании 11
1.3 Использование ДНК маркеров в селекции и генетике риса 19
1.3.1 Изучение биогенетического разнообразия риса 19
1.3.2 QTL- анализ, картирование генов и маркерная селекция риса 23
1.3.3 Изучение устойчивости к пирикуляриозу 32
1.3.4 Молекулярный полиморфизм Waxy-гена 38
2 Материал и методы 41
2.1 Исходный материал 41
2.2 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК 42
2.3 Молекулярные маркеры, использованные в работе 43
2.4 Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации 44
2.5 Детекция единичной замены нуклеотида в области сайта сплайсинга с применением рестрикционного анализа 48
2.6 Анализ электрофореграмм 49
2.7 Статистическая обработка данных 49
3 Результаты и обсуждение 52
3.1 Анализ полиморфизма микросателлитных локусов между сортами Мороберекан и Белозерный в рамках исследований по картированию локусов устойчивости к пирикуляриозу 52
3.2 Оценка возможности применения молекулярного полиморфизма Waxy- гена как маркерной системы в селекции риса по признаку содержание амилозы в зерновке 61
3.3 Анализ генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИриса с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров 67
4 Выводы 87
Предложения для практической селекции 90
Список литературы 91
Приложение 108
- Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем
- Изучение устойчивости к пирикуляриозу
- Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации
- Анализ полиморфизма микросателлитных локусов между сортами Мороберекан и Белозерный в рамках исследований по картированию локусов устойчивости к пирикуляриозу
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выведение новых сортов
сельскохозяйственных культур, в том числе и риса, основано на использовании природного или созданного человеком генетического разнообразия. Для обнаружения, оценки и охраны этого разнообразия, отбора растений, несущих хозяйственно ценные признаки, и отслеживания этих признаков в процессе селекции и в семеноводстве используют легко распознаваемые фенотипические проявления генов - маркеры.
Издавна применяемые в этих целях морфологические и биохимические маркерные признаки указывают на особенности формы, окраски или биохимического состава растения. Число их не так уж и велико, к тому же полигенная структура многих признаков строения и состава растений ограничивает возможности генетического картирования агрономически важных генов и контроля над переносом этих генов в новые формы растений [Хавкин Э.Е. 1997].
Использование в качестве фенотипических маркеров белковых молекул (изоферменты, запасные белки) - продуктов индивидуальных генов - существенно расширило возможности картирования генов и их мониторинга в селекционном процессе и позволило создать новые методы идентификации и систематизации сортов и семенного контроля.
Развитие методов молекулярной биологии, в частности, таких как: рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР)- амплификация ДНК, сиквенирование ДНК (определение последовательности ДНК) привело к появлению нового класса молекулярно-генетических маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям, входящих непосредственно в структуру агрономически важного гена или сцепленных с этим геном.
Возможности ДНК-маркеров во много раз превосходят потенциал изоферментов или запасных белков. Кроме того, проявление таких
Л молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является
тканеспецифичным и их можно обнаружить на любой стадии развития растений [ХавкинЭ.Е. 1997].
Вот почему появление ДНК-маркеров радикально изменило методы оценки генетического разнообразия, паспортизации и классификации сортов,
картирования и определения физической природы генов, интрогрессии
новых генов и генетического мониторинга в селекции и генетике риса.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка
эффективных методов оценки и отбора исходного материала для
использования в селекционном процессе, основанных на полиморфизме
ДНК-маркеров. В связи с этим в ходе исследований были поставлены
* следующие задачи:
1. Провести анализ генетического разнообразия сортов коллекции
ВНИИриса с использованием полиморфизма микросателлитных локусов
ДНК в качестве маркерной системы.
2. На основании данных микросателлитного анализа сгруппировать сорта
ф в соответствии со степенью генетического родства.
3. Изучить перспективность применения полиморфизма
микросателлитных локусов для идентификации сортов.
Оценить возможность использования молекулярного полиморфизма Waxy-гена, детерминирующего содержание амилозы в зерновке и в пыльцевых зернах, как маркерной системы для ранжирования сортов риса по признаку «содержание амилозы в эндосперме зерновки».
В рамках программы по картированию локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу провести оценку уровня микросателлитного полиморфизма между отечественным сортом риса Белозерный и сортом Мороберекан, несущим локусы количественной устойчивости к пирикуляриозу
6
ц 6. Провести отбор маркеров, полиморфных между указанными сортами,
для выполнения картирования локусов количественной устойчивости к
пирикуляриозу и ведения маркерной селекции по данному признаку.
Научная новизна исследований. В настоящей работе впервые:
проведена идентификация сортов коллекции ВНИИриса на основе
данных об аллельном разнообразии микросателлитных маркеров;
выполнена оценка генетического родства сортов риса отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров;
исследована корреляции между аллельными состояниями
микросателлитного локуса первого интрона и сайта сплайсинга первого
интрона Waxy гена с признаком содержание амилозы в эндосперме у
* отечественных сортов риса;
при изучении полиморфизма микросателлитного локуса Waxy-гена впервые выявлен аллель с количеством СТ-повторов равным 21;
проведен анализ генетического полиморфизма между сортами
Мороберекан и Белозерный на уровне ДНК с использованием
(ф микросателлитных маркеров и отобраны маркеры, необходимые для ведения
маркерной селекции на устойчивость к пирикуляриозу.
Научно-практическая ценность работы. Информация о степени генетического родства сортов коллекции ВНИИриса, полученная по данным микросателлитного анализа, облегчит подбор родительских пар при гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве, избегая при этом скрещивания генетически близких сортов, что позволит повысить эффективность селекционного процесса.
Показана возможность использования полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена как эффективной маркерной системы для разделения отечественных сортов риса на группы по содержанию более 20% и менее 20% амилозы, минуя технологическую оценку зерна. Выявленный аллель микросателлитного локуса первого интрона Waxy-гена с количеством СТ повторов 21 дополняет знания об его аллельном разнообразии.
Степень генетического полиморфизма между сортами Мороберекан и Белозерный, выявленная по данным микросателлитного анализа, говорит о возможности их использования в картировании локусов устойчивости к пирикуляриозу. Также отобраны микросателлитные маркеры, необходимые для выполнения указанного исследования, и ведения маркерной селекции по признаку устойчивость к пирикуляриозу.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международной научно-практической конференции « Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г.); Международной конференции « Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» (Turin, Italy, 15-17 September 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов « Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Анапа, 27-30 сентября 2004 г.); на методических советах Всероссийского НИИ риса 2001-2004 г.г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 112 страницах, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 171 наименование, в том числе 146 иностранных авторов.
Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем
Маркером в биохимии называют фактор идентификации; в классической генетике маркером обычно является ген известной локализации, по которому можно определять другие гены. В практике генетического анализа экспериментатор, как правило, имеет дело не с самим геном-маркером, а с его каким либо фенотипическим проявлением, представляющим собой конкретный признак. Генетические маркеры играют исключительно важную роль в изучении наследственной конституции организма и особенно в оценке исходного и селекционного материала, поскольку облегчают контроль за включением желаемых признаков от родительских форм в создаваемые сорта и гибриды.
Изначально для генетического маркирования использовались преимущественно морфологические признаки, как наиболее доступные экспериментатору [Конарев В.Г., 1983].
На первых этапах развития молекулярного маркирования применялся широкий спектр химических субстанций, вплоть до веществ вторичного происхождения. Однако их полиморфизм из-за ряда принципиальных ограничений не нашел широкого применения в решении задач генетики и селекции.
Любая субстанция, претендующая на роль маркера, должна отвечать определенным требованиям. Это касается и маркеров генетических систем разного уровня. Непременным условием является и то, что перед тем, как маркер может быть использован для решения каких-либо конкретных задач, корректность его применения должна быть аргументирована с генетической и биохимической позиции [Конарев В. Г., 1998; Созинов А.А., 1985]. По мнению ряда исследователей, молекулярные маркеры должны обладать определенными свойствами и отвечать следующим требованиям: высокий уровень полиморфизма, кодоминантный характер наследования, оптимальный уровень частоты встречаемости в геноме для решения конкретных задач, равномерное распределение в геноме по хромосомам, селективно нейтральное поведение; легкая оценка параметров маркера, возможность автоматизации оценки параметров маркера, высокая воспроизводимость оценки параметров маркера; возможность легкого обмена данными между лабораториями [Конарев А.В., 1998]. Развитие и совершенствовние электрофоретических методов, основанных на фракционировании макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как по отдельности, так и в совокупности, позволило широко использовать белковые маркеры-запасные белки семян и изоферменты. Полиморфизм запасных белков зерновки применялся в целях идентификации генотипов риса, как на уровне подвида, так и на межсортовом уровне с применением различных иммунохимических [Иванова Д.И., 1979; 1980] и электрофоретических методов [Иванова Д.И., 1983; 1986; 1987]. Генетические карты, основанные на изоферментных маркерах, были построены для риса, кукурузы, пшеницы, ячменя и других культур. На рисе 185 таких маркеров было локализовано на 12 хромосомах. И хотя генетические карты, основанные на белковых и изоферментных маркерах, могут быть использованы для локализации генов, ответственных за тот или иной признак, их применение ограничено в связи с небольшим количеством доступных для селекционера маркеров. В дополнении к этому такие маркеры могут изменяться под воздействием окружающей среды, а в случае с изоферментными маркерами обладать тканевой или органной специфичностью, что существенно снижает их ценность для генетики и селекции [Mohan М. et al., 1997]. Прогресс молекулярной генетики дал толчок к развитию различных типов маркеров, принадлежащих к наиболее эффективной на сегодняшний день ДНК - маркерной системе, основанной на анализе полиморфизма нуклеотидной последовательности ДНК. Применение ДНК- маркеров выводит селекцию на качественно новый уровень, позволяя оценивать генотипы напрямую, а не через его фенотипические проявления. Использование молекулярных ДНК-маркеров открывает большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации генов, их клонирования и конструирования новых сортов растений. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне. ДНК - маркерные технологии условно можно разделить на две основные группы: с применением ПНР и без такового. Использование полиморфизма длины рестриктных фрагментов является основным методом молекулярного маркирования без применения ПЦР. Для анализа полиморфизма по длине рестриктных фрагментов (restriction fragment length polymorphism-RFLP) выделенная из растительных тканей ДНК «разрезается» специфичными бактериальными ферментами — рестриктазами, мишенью которых служат короткие специфические последовательности ДНК - сайты рестрикции [Льюин Б., 1987]. Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле, длина и концентрация геля зависит от диапазона длин распределяемых фрагментов.
После электрофоретического разделения их переносят из агарозного геля на нейлоновую мембрану с помощью Саузерн-блоттинга, «проявляют» путем гибридизации с радиоактивными зондами-фрагментами ДНК - и затем анализируют по положению на радиоавтографах [ Чан В-Т. В., 1999 ] .
Изучение устойчивости к пирикуляриозу
Помимо указанных выше, с применением молекулярных ДНК-маркеров был картирован еще целый ряд генов устойчивости к пирикуляриозу [Tabien R.E. et al., 2000; Chauhan R.S. et al., 2002; Sallaud С et al., 2003; Lang N.T. et al., 2001; Fukuoka S. and Okuno K.2001].
Информация о положении генов на генетической карте и маркерах, с ними сцепленных, может быть использована как в маркерной селекции, так и для дальнейшего изучения аллельности генов, сцепленности их друг с другом, что позволяет более детально подходить к вопросам их введения в генотип сортов реципиентов и контроля их наличия с использованием ДНК-маркеров.
Наряду с этим такого рода знания необходимы для физического картирования (т.е. для определения положения на молекулярных картах хромосом), клонирования генов, предполагающего перенос генов из генома в исскуственно созданную хромосому, и последующее определение их нуклеотидной последовательности - сиквенирование.
Так, к примеру, ген Pi-2 изначально картированный на шестой хромосоме Yu Z.H. et al (1991) определен как возможно аллельный с геном Pi-z [Inukai Т. et al., 1992]. Дальнейшее детальное изучение молекулярного окружения этого гена позволило не только сделать вывод о том, что он сцеплен с геном Pi-9 [Liu G. et al., 2002], но и выполнить физическое картирование области хромосомы, в которой он локализован [Jiang J. and Wang S., 2002].
Информация о хромосомной локализации другого гена устойчивости к пирикуляриозу - Pi-5 позволила прийти к выводу, что гены РІ-5 и Рг-3 представляют собой один и тот же ген, ранее известный как два отдельных гена [Jeon J.S. et al., 2003]. Молекулярные маркеры, сцепленные с генами устойчивости, были использованы в ряде работ по их клонированию и последующему сиквенированию. ф Так, ген Pi-b, изначально был картирован на генетической карте риса Miyamoto М. et al (1996) с использованием RFLP- маркерной системы. В дальнейшем, с учетом информации о его локализации на генетической карте, было выполнено тонкое картирование на молекулярном уровне той области хромосомы, в которой он локализован [Monna L. et al., 1997]. Это позволило, # в ходе последующих работ, его клонировать и сиквенировать [Wang Z.X. et al., 1999; Tsunoda Y. et al., 2000]. Что касается другого сиквенированного гена Pia, то нужно отметить, что на основе данных о его нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности его продукта, было выяснено, что рецессивная аллель отличается от доминантной заменой аминокислоты № аланин (доминантная аллель) на серии (рецессивная аллель) в последовательности продукта гена [Bryan G.T. et al., 2000]. Это явилось ценной информацией для выяснения вопросов, касающихся аллельных состояний гена Pia [Jia Y. et al., 2003]. Физическое картирование и определение нуклеотидной _j последовательности генов дает возможность создавать внутригенные ДНК маркеры, особо ценные для маркерной селекции и представляющие собой самые надежные маркеры, с точки зрения конаследования с геном интереса. Помимо главных генов устойчивости, для создания сортов риса, сочетающих как вертикальную, так и горизонтальную устойчивость к пирикуляриозу, необходимо введение в генотип локусов количественной устойчивости. Пожалуй, самая значимая работа по картированию локусов количественной устойчивости риса к пирикуляриозу была выполнена Wang G.L. et al в 1994, в ходе которой было выявлено 10 QTLs устойчивости у западноафриканского сорта Мороберекан (сорт риса подвида japonica с высокой устойчивостью к пирикуляриозу). Пять из выявленных десяти локусов объясняли порядка 80% фенотипического варьирования по признаку горизонтальной устойчивости к патогену. Селекция сортов риса, несущих наряду с главными генами устойчивости и количественные локусы, позволит получить сорта с длительной устойчивостью, т.е. с низкой степенью поражаемости даже при появлении новых рас патогена. Использование ДНК- маркеров, сцепленных с локусами интереса, дает возможность визуализировать наличие одновременно нескольких локусов, что при ведении селекции на устойчивость к пирикуляриозу классическими способами представляет собой весьма трудноразрешимую задачу. Более того, возможность отбора потомства без фитопатологической оценки, а только на основании данных ДНК-маркирования, позволяет значительно сэкономить время и ресурсы, что также немаловажно с точки зрения экономической эффективности селекционного процесса.
Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации
В качестве родительской пары для получения гибридной F3 популяции, необходимой для проведения QTL-анализа, были выбраны сорт Мороберекан - сорт подвидаУа/wi/ca, происходящий из западной Африки и несущий QTLs горизонтальной устойчивости к пирикуляриозу [Wang G.L. et al., 1994; Chen D. et al., 2000] и сорт отечественной селекции Белозерный, восприимчивый к указанному заболеванию.
При выполнении QTL-анализа и маркерной селекции самым первым и одним из наиболее важных этапов является отбор маркеров, полиморфных между выбранными для исследования сортами, и определение степени полиморфизма между этими сортами, так как при выявлении низкого полиморфизма между родительскими генотипами, исключается возможность их использования для картирования количественных локусов.
На этом этапе следует учитывать следующие требования: маркеры должны быть по возможности равномерно распределены по геному, с наибольшим насыщением областей расположения локусов интереса. Это позволяет более эффективно контролировать внедрение требуемых участков ц, генома в сорт реципиент. Также маркеры должны иметь ярко выраженную разницу в размере аллелей, что выражается в различии размеров продуктов ПНР каждого конкретного маркера при электрофоретическом разделении, и хорошо амплифицироваться, для четкой идентификации родительских аллелей в ходе маркерной селекции. В связи с этим данное исследование можно условно разделить на 2 Ф этапа (рис.2). На первом этапе оценили полиморфизм по максимально возможному количеству микросателлитных локусов между исследуемыми сортами, при этом старались максимально насытить области расположения локусов горизонтальной устойчивости к пирикуляриозу, картированные Wang G.L. et al в 1994 г. После оценки полиморфизма исследуемых локусов, было проанализировано качество продуктов ПЦР и степень различия размеров аллелей, учитывая позицию маркеров на генетической карте риса. Как видно из рисунка 2 для оценки полиморфизма между сортами Белозерный и Мороберекан было использовано 468 SSR маркеров, распределенных по всему геному риса. После проведения ПЦР и электрофоретического анализа размеров продуктов ПЦР с прайм ерами к микросателлитным маркерам у исследуемых сортов полиморфными оказались 177 маркеров, что составляет 37,8 %, Из рисунка 3 можно видеть пример, иллюстрирующий наличие и отсутствие различий в размерах микросателлитнои последовательности, выявляемых при электрофоретическом разделении продуктов ПЦР. Из 177 микросателлитных маркеров» проявивших полиморфизм между сортами Мороберекан и Белозерный, наибольшее количество полиморфных было выявлено на хромосомах 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 12, при этом на хромосомах 2, 4, 7, 11, 10 наблюдался наиболее высокий уровень полиморфизма (табл.3).
Маркеры, локализованные у областей QTL, проявили более высокий уровень полиморфизма между родительскими сортами (50,6%) , чем в других областях генома (35,3%) таблица 4.
Из 177 полиморфных между сортами Белозерный и Мороберекан было отобрано 119 маркеров (рис. 4, табл. 5) для дальнейшего использования в QTL-анализе, основываясь на качестве ПЦР-продукта, величине разницы размеров микросателлитнои последовательности и их позиции на генетической карте.
Анализ полиморфизма микросателлитных локусов между сортами Мороберекан и Белозерный в рамках исследований по картированию локусов устойчивости к пирикуляриозу
Из рисунка видно, что области распределения кластеров не перекрываются и одна из них (кластер 1) расположена в области отрицательных, другая (кластер 2) - в области положительных чисел. Это также свидетельствует о достоверном разделении сортов на два кластера.
Проведенный в рамках данной работы анализ степени генетического родства между сортами коллекции ВНИИриса позволяет говорить об объективности данных, получаемых при использовании полиморфизма микросателлитных ДНК-маркеров.
Информация о распределении сортов по признаку генетического родства может быть использована при подборе пар для гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в потомстве, что позволит повысить эффективность селекционного процесса. 1. Уровень полиморфизма между сортами Белозерный и Мороберекан, выявленный в ходе исследования свидетельствует о возможности их использования в QTL-анализе локусов устойчивости к пирикуляриозу. Общий процент полиморфизма между ними равен 37,8%, что составило маркеров, из которых было отобрано 119 для использования в QTL-анализе и маркерной селекции по данному признаку. 2. Генетический полиморфизм на хромосомах 2, 4, 7, 10 и 11 был выше, чем в других хромосомах: 44, 44, 48, 47 и 44% соответственно. Эти расхождения в степени полиморфизма каждой из хромосом могут быть объяснены различным уровнем сходства хромосом, который определяется различиями в происхождении сортов Мороберекан и Белозерный. 3. Маркеры, локализованные в областях локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу, проявили более высокий уровень полиморфизма между родительскими сортами (50,6%), чем в других областях генома (35,3%)- Наиболее высокий генетический полиморфизм в областях QTL устойчивости к пирикуляриозу, выявленный микросателлитными маркерами, вероятнее всего объясняется разным уровнем устойчивости у исследуемых сортов. 4. В ходе исследования у 10 сортов риса отечественной селекции с различным содержанием амилозы было выявлено три аллеля Ф микросателлитного локуса Wx гена с количеством СТ повторов-(СТ)п равным 18, 19, 21. Аллель с количеством СТ повторов в микросателлитной последовательности равным 21 был обнаружен впервые. 5. Отсутствие корреляции между числом СТ - повторов в микросателлитной последовательности первого интрона Waxy-гена и содержанием амилозы у исследованных нами сортов, говорит о щ неперспективности использования полиморфизма данного микросателлитного локуса как маркерной системы для ранжирования сортов риса отечественной селекции по признаку содержание амилозы в эндосперме. 6. При проведении анализа 5 области сайта сплайсинга у отечественных сортов с содержанием амилозы более чем 20% была выявлена последовательность agGtata, в то время как у сортов с содержанием 4 амилозы ниже 20% - agTtata, Достоверность взаимосвязи признака содержание амилозы с признаком G—»Т замена нуклеотида подтверждена проверкой по коэффициенту корреляции рангов Спирмена. Его значение оказалось равным 0,72 при Р 0,05, что говорит о достоверности результата. 7. Возможность четкой интерпретации результатов и достоверность полученных данных свидетельствуют о возможности использования полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена как эффективной маркерной системы для разделения сортов на содержащие более 20% и менее 20% амилозы, что может быть востребовано в селекции высокоамилозных сортов. 8. У 14 микросателлитных маркеров, использованных в работе по м изучению генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИ риса, был обнаружен различный уровень полиморфизма: от трех до семнадцати аллелей на один микросателлитный локус. Наиболее высокий уровень полиморфизма по результатам анализа показали маркеры RM1, RM11, RM70, RM122, RM164, - 8, 7, 12, 8, 17 аллелей по каждому из маркируемых локусов соответственно. 9. На основании данных об аллельных комбинациях использованных в работе микросателлитных маркеров было выявлено, что каждый из исследованных сортов обладает уникальным, свойственным лишь ему набором аллелей. Это свидетельствует о том, что микросателлитные маркеры обладают достаточным уровнем полиморфизма для использования их в сортовой идентификации и в целях выявления ложных гибридов, 10. Анализ частоты встречаемости аллелей микросателлитных маркеров выявил наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества сортов, что свидетельствует об их относительной генетической близости. 11. По результатам кластерного анализа, проведенного на основании комплекса данных о частоте встречаемости и о размере аллелей у исследованных сортов, было определено две основных группы сортов с наибольшей степенью генетического сходства.
