Содержание к диссертации
Введение
2 Основная часть 13
2.1 Обзор литературы 13
2.1.1 Современное состояние проблемы загрязнения окружающей среды, утилизации отходов и ремедиации почв в условиях техногенеза . 13
2.1.2 Микробные технологии в решении экологических проблем . 22
2.1.2.1 Биодеструкция ксенобиотиков 22
2.1.2.2 Микроорганизмы как фунгициды и стимуляторы роста 29
2.1.2.3 Биоремедиация нефтезагрязненных почв и водных объектов . 32
2.1.2.4 Утилизация отходов . 35
2.1.3 Пробиотические препараты в ветеринарии и медицине 40
2.1.4 Дрожжевые грибы в природных экосистемах, их биологические свойства и практическое применение 44
2.2 Материалы и методы исследований 54
2.3 Результаты исследований 69
2.3.1 Разработка средств утилизации органических отходов 69
2.3.1.1 Выделение и отбор микроорганизмов-деструкторов из природных биотопов 69
2.3.1.2 Идентификация отобранных изолятов и создание эффективных ассоциаций 78
2.3.2 Токсикологическая оценка Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia
kudriavzevii-96 . 83
2.3.2.1 Изучение вирулентности, токсичности и токсигенности 83
2.3.2.2 Изучение раздражающего действия 86
2.3.2.3 Оценка безвредности при хроническом воздействии 89
2.3.2.4 Выявление возможного токсического эффекта в отношении перевиваемых клеточных линий и растений 101
2.3.3 Оценка биологической активности Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 . 104
2.3.3.1 Антагонистическая активность в опытах in vitro 104
2.3.3.2 Антагонистическая активность в опытах in situ . 114
2.3.3.3 Влияние метаболитов Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 на биопленкообразование патогенных энтеробактерий и стафилококка 119
2.3.3.4 Ультраструктурные изменения грамотрицательных и грамположительных бактерий под воздействием метаболитов Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 120
2.3.3.5 Анализ биологически активных веществ Saccharomyces cerevisiae-11
и Pichia kudriavzevii-96 125
2.3.4 Разработка и определение показателей безопасности средства для утилизации органических отходов - УФ-2 133
2.3.4.1 Толерантность Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 к неблагоприятным факторам 133
2.3.4.2 Подбор условий культивирования и разработка УФ-2 151
2.3.4.3 Изучение безвредности УФ-2 157
2.3.5 Утилизация органических отходов . 159
2.3.5.1 Отработка оптимальных доз использования УФ-2 в лабораторных условиях 159
2.3.5.2 Утилизация бесподстилочного птичьего помета 182
2.3.5.3 Утилизация подстилочного птичьего помета . 194
2.3.5.4 Утилизация бесподстилочного и подстилочного свиного навоза 200
2.3.5.5 Утилизация подстилочного навоза крупного рогатого скота 206
2.3.5.6 Изучение влияние УФ-2 на содержание аммиака и сероводорода в воздухе 208
2.3.5.7 Утилизация осадков сточных вод 209
2.3.5.8 Очистка и обезвреживание сточных вод 215
2.3.6 Оценка детоксицирующей активности Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в отношении пестицидов 220
2.3.7 Разработка и оценка эффективности Энтероспорина 224
2.3.7.1 Технологическая схема производства Энтероспорина. 224
2.3.7.2 Эффективность Энтероспорина при желудочно-кишечных болезнях животных . 225
2.3.7.3 Профилактическая эффективность Энтероспорина при микотоксикозах . 234
3 Заключение 267
Список сокращений и условных обозначений . 311
- Дрожжевые грибы в природных экосистемах, их биологические свойства и практическое применение
- Выявление возможного токсического эффекта в отношении перевиваемых клеточных линий и растений
- Толерантность Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 к неблагоприятным факторам
- Технологическая схема производства Энтероспорина
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Характерной особенностью современности является тенденция возрастания антропогенного воздействия на окружающую среду, приводящая к ухудшению экологического состояния. Наибольшая роль в загрязнении атмосферы, почвенных и водных объектов принадлежит промышленным предприятиям и сельскому хозяйству [13; 16]. Накопление токсикантов техногенного и природного происхождения приводит к снижению резистентности, часто регистрируемым в практике отравлениям животных [3; 5; 12].
Основной и в большинстве случаях нерешенной проблемой ведения животноводства по-прежнему остается утилизация отходов. Значительное количество навоза/помета, распространяя зловонный запах на большие территории, являясь местом выплода мух, представляя эпизоотологическую опасность, остается неиспользованным в условиях агропромышленного комплекса при наблюдаемом снижении плодородия почв и дефиците органических удобрений [15]. Для решения данной проблемы предложены способы утилизации отходов, среди которых биологические методы, в силу экономичности, отсутствия дополнительного ущерба экосистемам становятся все более востребованными [1; 17; 19]. Средства микробного происхождения, применяемые в реабилитационных технологиях, как при самостоятельном, так и сочетанном воздействии с другими технологическими приемами, позволяют улучшить качество субстрата в санитарно-гигиеническом отношении и получить ценный продукт в виде органического удобрения.
Микробная обсемененность навоза/помета напрямую зависит от состояния кишечного биоценоза, нарушение которого вызывается различными этиологическими факторами, в том числе и воздействием экотоксикантов. Для профилактики и лечения дисбактериозов, повышения резистентности широко используются пробиотические препараты [2; 8; 11].
Однако, несмотря на наличие средств утилизации отходов, широкого ассортимента пробиотиков, разработка, изучение механизма действия и внедрение новых препаратов в условиях ужесточения требований к охране окружающей среды, получения безопасной растениеводческой и животноводческой продукции, остается актуальной задачей. Их применение позволит улучшить экологическую ситуацию, ветеринарное благополучие хозяйств, а использование пробиотиков отдельно и в комплексе лечебно-профилактических мероприятий снизит заболеваемость и повысит сохранность животных.
Степень её разработанности. В настоящее время в мире значительное внимание уделяется вопросам охраны окружающей среды. Одним из аспектов снижения негативных последствий рассматривается ограничение использования в агропромышленном комплексе химических средств и, при возможности, замена их биологическими. Разработанные на основе микроорганизмов препараты применяются для ремедиации нефтезагрязненных объектов, в ветеринарной медицине, в качестве средств защиты растений и т.д.
В литературе встречаются отдельные сообщения о разработке средств и методов утилизации органических отходов сельскохозяйственных предприятий [4; 10; 18]. Несмотря на постоянно растущий интерес исследователей к данной проблеме, научных публикаций явно недостаточно, а имеющийся арсенал препаратов из-за больших объемов разнообразного субстрата не всегда является доступным и эффективным.
В «ФЦТРБ-ВНИВИ» проводятся научно-исследовательские работы, посвященные разработке биологических препаратов - деструкторов органических отходов, а также пробиотиков для профилактики и комплексной терапии токсикозов животных. В результате целенаправленных исследований сотрудниками Центра разработаны технологии изготовления и использования средств утилизации органических отходов (ускорителей ферментации) и пробиотика Энтероспорин. Результаты этих исследований и отражены в нашей работе.
Цели и задачи. Целью настоящей работы явилось научно-практическое обоснование способов снижения техногенной и микробиологической нагрузки на организм животных и окружающую среду с использованием средства УФ-2 для утилизации органических отходов и пробиотика Энтероспорин.
Достижение указанной цели предполагало решение следующих задач:
-выделение и отбор микроорганизмов из природных биотопов с экспериментальным обоснованием выбора наиболее активных изолятов, их идентификация, создание на их основе средств утилизации органических отходов;
-оценка безопасности, толерантности к неблагоприятным воздействиям и изучение антагонистической активности отобранных микроорганизмов в условиях in vitro и in situ;
-определение показателей безопасности разработанного средства УФ-2 и изучение его деструктивной активности для утилизации органических отходов животноводства, сточных вод и их осадков в лабораторных и производственных условиях;
-изучение детоксицирующей активности отобранных микроорганизмов в отношении ксенобиотиков (карбаматные и хлорорганические пестициды: тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД), дихлордифенилтрихлорметан (ДДТ) и его метаболит ДДЕ, гексахлоран);
-оценка эффективности применения Энтероспорина для коррекции кишечного биоценоза животных и снижения негативного влияния микотоксинов на клинические, гематологические, биохимические, микробиологические показатели и факторы неспецифической резистентности.
Научная новизна. В процессе исследований получены новые научные данные теоретического и прикладного характера.
Впервые на основе сформулированных критериев отбора проведен скрининг микроорганизмов с целью использования их для утилизации органических отходов. В результате целенаправленного поиска создана коллекция наиболее активных бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей, способных к деструкции органического сырья. С учетом принципа биосовместимости подобраны консорциумы эффективных, технологичных микроорганизмов и на их основе разработаны биопрепараты.
Научно аргументировано, теоретически и экспериментально обосновано применение дрожжей семейства Saccharomycetaceae для утилизации органических отходов. Изоляты, обозначенные как Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 (анаморфа Candida krusei) идентифицированы классическими микробиологическими методами и на основе данных молекулярно-генетического анализа.
Оценена биологическая активность и доказано отсутствие токсического эффекта рассматриваемых микроорганизмов при длительном воздействии и отрицательного влияния на гематологические, биохимические и иммунологические показатели.
Впервые с помощью электронно-микроскопических исследований проведена оценка ультраструктурных изменений клеток патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus) под воздействием диффундирующих в агар метаболитов дрожжей.
Выявлена детоксицирующая активность отобранных микроорганизмов в отношении карбаматного и хлорорганических пестицидов.
В лабораторных и производственных условиях на птицеводческих, свиноводческих и скотоводческих комплексах, очистных сооружениях показана эффективность применения разработанного на основе Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 средства УФ-2.
Показана эффективность использования разработанного и зарегистрированного в Российской Федерации лекарственного препарата Энтероспорин. Изучено состояние микробиоценоза кишечника животных на фоне применения Энтероспорина. Использование пробиотика в период потребления кормов, содержащих микотоксины, способствует улучшению морфо-биохимических показателей крови, естественной резистентности, положительно влияет на клиническое состояние и динамику живой массы.
Результаты исследований научно обосновывают применение разработанных средств утилизации органических отходов и пробиотика Энтероспорин в животноводстве, ветеринарной медицине, позволяющих снизить техногенную и микробиологическую нагрузку на животных и окружающую среду.
Новизна исследований подтверждена патентами РФ (№ 2298031; 2491942) и положительным решением о выдаче патента на изобретение «Способ микробиологической переработки птичьего помета».
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных исследований. Полученные данные дополняют представления о биологических свойствах и практическом применении дрожжей и бактерий Bacillus subtilis.
На основании проведенных экспериментов теоретически и практически обоснованы, разработаны и предложены производству биологические препараты.
Результаты диссертационной работы имеют важное практическое значение для решения экологических проблем, способствуя охране окружающей среды и рациональному использованию органического сырья.
На фоне улучшения микробиоценоза применение пробиотика с лечебной и профилактической целью снижает выделение с экскрементами в окружающую среду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что в комплексе с биопрепаратами для утилизации отходов позволит более эффективно проводить реабилитационные мероприятия, обеспечивая ветеринарное благополучие хозяйств.
Результаты проведенных исследований использованы при составлении методических рекомендаций и пособий, нормативной документации, утвержденных на федеральном уровне.
Методология и методы исследования. Для решения поставленной цели и задач в диссертационной работе использован комплекс как общенаучных, так и частнонаучных методов исследования.
Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования, таких как системный подход, моделирование, анализ, эксперимент, измерение, сравнение и т.д.
Из частнонаучных использованы токсикологические, микробиоло-гические, хроматографические, спектрометрические, колориметрические, электронно-микроскопические, иммунологические, гистологические и другие методы исследования, выполненные на высокотехнологичном оборудовании научных подразделений «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Положения, выносимые на защиту:
-скрининг микроорганизмов - потенциальных деструкторов органического сырья;
-токсикологическая оценка и биологическая активность отобранных микроорганизмов;
-разработка средства УФ-2 для утилизации органических отходов, с изучением его безопасности для животных и отработка доз в модельных экспериментах;
-эффективность использования УФ-2 для утилизации птичьего помета, навоза крупного рогатого скота и свиней, сточных вод и их осадков;
-оценка деструктивной активности отобранных микроорганизмов в отношении карбаматных и хлорорганических пестицидов;
-эффективность использования пробиотика Энтероспорин для нормализации кишечного биоценоза и снижения негативного влияния микотоксинов у лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обусловлена значительным объемом экспериментального материала, полученного с использованием высокоинформативных методов исследования в лабораторных и производственных условиях с подтверждением данных математической статистикой.
Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2006-2013 гг.; ежегодных международных, межрегиональных, всероссийских научно-практических конференциях; международных конгрессах; съездах микологов, ветеринарных фармакологов и токсикологов (Казань, 2006, 2007, 2013; Воронеж, 2007; Москва, 2008-2010, 2012, 2013; Ульяновск, 2008; Махачкала, 2012; Прага, 2012, 2014; Саратов, 2013; Екатеринбург, 2013; Стамбул, 2014).
По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 27-в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Диссертация изложена на 419 страницах стандартного компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результатов исследований, заключение, списки сокращений и условных обозначений, литературы, иллюстрированного материала, приложения. Работа иллюстрирована 88 таблицами и 52 рисунками. Список использованной литературы включает 587 источников, в том числе 182 иностранного автора.
Дрожжевые грибы в природных экосистемах, их биологические свойства и практическое применение
Дрожжевые грибы широко распространены в природе и играют важную роль в различных пищевых связях [1]. В природных экосистемах дрожжи тесно ассоциированы с живыми растениями или их мертвыми остатками, животными, используя их как местообитание и источник пищи [117].
Особенно многочисленные и разнообразные дрожжевые сообщества формируются на поверхности живых частей растений [215; 403]. В этих биотопах дрожжи существуют как копиотрофы за счет потребления легкодоступных соединений экскретированными растениями (сахара, органические кислоты, сахароспирты, аминокислоты) и стимулируют их ассимиляционные процессы [303]. Дрожжевые грибы могут присутствовать в плодах с толстыми плотными покровами, например, в желудях дуба [137]. Естественным обитанием ближайших диких родственников культурных дрожжей рода Saccharomyces являются сокотечения и кора широколиственных деревьев [195; 578]. Векторами распространения этих дрожжей являются насекомые [520]. Дрожжи Saccharomyces являются компонентом биоценоза леса -обнаруживаются в лесной подстилке и самой почве [66; 556].
Имеются данные о присутствии в микробиоценозе кишечника Saccharomyces cerevisiae [63].
Дрожжевые сообщества присутствуют в сфанговых мхах и болотных сосудистых растениях. В сфагновой дернине дрожжи рассматриваются как первичные сапротрофы, принимающие участие при торфообразовании на начальных этапах разложения органического вещества. На дальнейших этапах сукцессии главная роль принадлежит уже мицелиальным грибам с активной гидролитической активностью, а дрожжи функционируют как микрофлора рассеяния за счет роста на вторичных продуктах метаболизма микромицетов [152].
По мере развития и постепенного отмирания растительных субстратов эпифитные виды дрожжевых грибов закономерно оказываются в подстилке и верхних почвенных горизонтах [23]. В подстилке и почвенных горизонтах в большей степени проявляется гидролитическая активность дрожжей, а также способность некоторых видов существовать в условиях олиготрофии. В разлагающихся растительных остатках доминируют базидиомицетовые дрожжи.
Дрожжевые грибы, обнаруженные в образцах хвойного опада, обладали способностью утилизировать широкий набор соединений, в том числе полисахариды. Некоторые изоляты характеризовались амилолитической, липазной, ксиланазной и пектиназной активностью [68]. Наличие липазной активности свидетельствует об участии дрожжей в первом этапе разложения хвои, а именно в деградации восков кутикулы, представленных в основном эфирами жирных кислот и спиртов [92]. Многие дрожжи, обнаруженные на опаде, ассимилируют ряд фенольных соединений, повсеместно распространенных в растениях в качестве биогенетических предшественников либо продуктов деструкции [111], в частности, лигнина, преобладающего среди органических веществ елового хвойного опада [489]. Возможно, благодаря этому дрожжи, хотя сами не способны разлагать лигнин и почти не обладают целлюлазной активностью, стимулируют дереворазрушающую активность мицелиальных базидиомицетов [428].
Исследованиями А.М. Глушаковой и др. показано, что дрожжи Saccharomyces paradoxus часто выделяются с молодых листьев растений, а также с опавших листьев в лесной подстилке [66]. Некоторые виды дрожжей могут ингибировать развитие фитопатогенных микроорганизмов [22]. Дрожжи, присутствующие на хвойном опаде, секретируют как микоцины [71], так и гликолипиды [67], оказывая при этом фунгицидное действие. По данным В.И. Голубева, доминирующее число штаммов дрожжей, представленных во Всероссийской коллекции микроорганизмов, выделены из почвы и растительного опада [70]. Среди изолятов из очистных сооружений нефтеперерабатывающих заводов преобладает (78 %) Yarrowia lipolytica. В этой публикации констатируется большой интерес к фонду дрожжей зарубежных организаций. Причем внимание привлекают не только традиционные области применения дрожжей, но использование их для получения астаксантина, полиолов, коэнзима Q-10, биотоплива, полисахаридов, некоторых ферментов, антифунгальных препаратов, трансформации органических соединений, биоремедиации. Дрожжи рассматриваются как продуценты многих важных для человека соединений – витаминов, липидов, нуклеиновых кислот, ферментов, органических кислот, спиртов. С экологических позиций дрожжи представляют интерес как особые жизненные формы, приспособленные для развития в водной, воздушной или почвенной среде обитания.
В 60-е годы прошлого века в связи с развернувшимися во всем мире работами по использованию углеводородов нефти в качестве сырья для производства микробного белка выявлена способность дрожжей продуцировать органические кислоты. В институте биохимии и физиологии микроорганизмов под руководством Лозинова А.Б. обнаружена способность алканассимилирующих дрожжей продуцировать значительные количества органических кислот – интермедиатов цикла Кребса – -кетоглутаровой, лимонной и трео-Ds(+)-изолиминной из жидкого парафина [365]. В основном, в качестве продуцентов лимонной кислоты рассматривались грибы рода Candida [209], которые в советское время путем культивирования на n-парафинах нефти использовали для получения белковых веществ.
Выявление возможного токсического эффекта в отношении перевиваемых клеточных линий и растений
С использованием альтернативных методов исследования изучена токсичность культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в отношении перевиваемых культур клеток: почечные линии Vero, MDВK и легочная линия LEK.
Культуральная жидкость Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 не обладает острой и хронической цитотоксичностью в отношении тестируемых культур клеток.
Коэффициент жизнеспособности клеток LEK при внесении культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae-11 через 24 и 72 ч составил 98,4 и 97,5 %. Культуральная жидкость Pichia kudriavzevii-96 также не обладала острой (99,2 % жизнеспособность клеток) и хронической цитотоксичностью (98,6 % жизнеспособность клеток). 100 % жизнеспособность клеток LEK отмечена при разведении культуральной жидкости в соотношении 1:80.
В случае почечных линий (MDBK, Vero) коэффициент жизнеспособности при внесении культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 через 24 и 72 ч составил 100 %.
В связи с тем, что исследуемые микроорганизмы предполагалось использовать в качестве объектов ремедиационных технологий, следующей задачей была оценка их безопасности для растительных объектов. Выявление возможной фитотоксичности исследуемых микроорганизмов проводили с использованием семян (n=100) овса, ячменя, пшеницы, редиса. Анализировали прорастание семян, определяли длину проростков и корней растений.
В таблице 16 представлены параметры растений при проращивании семян с использованием культуральной жидкости с исследуемыми изолятами. Видно, что изоляты не оказывают токсического действия на все изучаемые параметры тест-растений. Напротив, отмечали стимулирующий эффект, выражающийся в улучшении всхожести семян, увеличении наземной и корневой частей растений.
Таблица 16 – Оценка фитотоксичности культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96
При выдерживании семян в КЖ исследуемых микроорганизмов отмечали увеличение количества пророщенных семян. Так, количество пророщенных семян овса, ячменя, пшеницы при исследовании Saccharomyces cerevisiae-11 было выше относительно контроля на 9,4; 9,8 и 7,8 %, Pichia kudriavzevii-96 на 11,8; 12,2 и 8,9 % соответственно.
Наибольшее стимулирующее действие на семена редиса оказал Pichia kudriavzevii-96, уже на 3 сут в этом варианте регистрировали появление листочков при их отсутствии в контроле. Длина проростков и корней была на 74,1 (Р 0,001) и 22,5 % (Р 0,01) выше показателей в контрольной группе. В случае с Saccharomyces cerevisiae-11, длина проростков была на 43,1 % (Р 0,001), корней -на 10,6 % выше аналогичных показателей контрольного варианта.
При тестировании фитотоксичности на семенах других культур также отмечен стимулирующий эффект, который был более выражен у Pichia kudriavzevii-96. Длина проростков и корней пшеницы была выше, чем в контроле, в 3,0 раза и на 69,6 % (Р 0,001) соответственно. Длина проростков и корней при выдерживании в КЖ Saccharomyces cerevisiae-11 семян пшеницы была выше на 85,6 и 52,3 % (Р 0,001).
104 При выдерживании в КЖ Pichia kudriavzevii-96 семян овса и ячменя, длина проростков была выше относительно контроля в 2,2 раза и 49,6 % (Р 0,001), Saccharomyces cerevisiae-11 - на 52,5 и 32,1 % (Р 0,001) соответственно. Регистрировали достоверные изменения в длине корней овса и ячменя. При исследовании Pichia kudriavzevii-96 этот показатель был выше контроля на 48,7 и 89,1 % (Р 0,001), Saccharomyces cerevisiae-11 - на 22,3 (Р 0,01) и 71,9 % (Р 0,001).
Подбирая различные варианты исследования антагонизма (методы отсроченного антагонизма и методы прямого совместного культивирования: метод штрихов, перевернутого агара, двуслойного агара и т.п.), мы выбрали метод, предложенный Р. Fredericq (1957). Этот метод оказался наиболее приемлемым для изучения антагонизма Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий из-за разницы в среде культивирования индикаторных культур и исследуемых микроорганизмов.
В качестве тест-культур использовали референтные и полевые штаммы условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, обладающие типичными для своего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Тестировали различные серологические группы эшерихий и серотипы сальмонелл, протей, стафилококк, энтерококк, клебсиелла, бациллы, выделенные из навоза, помета и осадка сточных вод, а также при бактериологическом исследовании павших животных. В опытах использовали также изоляты, не обладающие патогенными свойствами и идентифицированные как Pseudomonas putida и P. fluorescens, Azotobacter chroococcum, отобранные при скрининговых исследованиях.
Оценивали антагонистическую активность Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в отношении некоторых видов грибов рода Candida, присутствующих в кишечнике, а также попадающих в навоз с выделениями больных животных при кандидозе половых органов. Тест-культурами в этих опытах были полевые изоляты C. albicans и С. tropicalis, выделенные от коров, больных эндометритами. Изолят C. albicans при культивировании в сыворотке крови крупного рогатого скота образовывал ростовые трубочки, что свидетельствует о его патогенности.
Наиболее выраженная антагонистическая активность отмечена у Saccharomyces cerevisiae-11. Зона отсутствия роста эшерихий, сальмонелл, стафилококка, энтерококка, протея, клебсиелл, бацилл составила 14-22 мм (таблица 17). Задержка роста индикаторных культур при исследовании Pichia kudriavzevii-96 составила 10-20 мм (рисунок 11). Антагонизм в отношении P. putida и P. fluorescens, A. chroococcum зафиксирован не был.
Толерантность Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 к неблагоприятным факторам
Важным условием эффективного использования микробных технологий утилизации органического сырья является сохранение жизнеспособности инокулированных микроорганизмов. Зачастую обрабатываемые субстраты отличаются высоким содержанием химических соединений, имеют щелочную или кислую реакцию среды, ингибирующе влияя на биообъекты.
В связи с этим, на следующем этапе исследований, имитируя различные воздействия, изучали устойчивость отобранных микроорганизмов к возможным ингибирующим факторам.
Изучение влияния рН среды на рост исследуемых микроорганизмов проводили при их культивировании в МПБ, отклоняя реакцию среды от нейтральных значений гидроокисью натрия или уксусной кислотой.
Оптимальные и ограничительные для роста культур дрожжей значения рН (диапазон 3-10) оценивали по количеству колониеобразующих единиц при посевах клеточных суспензий на агаризованную среду.
Исследуемые микроорганизмы обладают повышенной кислото- и щелочеустойчивостью: границы роста находятся в пределах рН 3,5-9,5, оптимум роста при рН 4-6 (таблица 27).
Максимальный рост отмечен при рН 5, урожайность биомассы превышала исходную концентрацию клеток у Saccharomyces cerevisiae-11 в 3,2 раза, Pichia kudriavzevii-96 в 2,8 раз (Р 0,001). Концентрация биомассы Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 при рН 6 была выше в 3,0 и 2,7 раз (Р 0,001). При нейтральных значениях рН биомасса Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 превышала посевную в 2,5 и 2,4 раза (Р 0,001). При рН 8 регистрировали увеличение биомассы Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в 2,2 и 2,0 раза (Р 0,001). Снижение прироста Pichia 134 kudriavzevii-96 отмечали при рН 9, биомасса от исходных значений увеличилась на 16,7 % (Р 0,05), против увеличения в 1,4 раза биомассы Saccharomyces cerevisiae-11 (Р 0,001). При рН 4 биомасса Saccharomyces cerevisiae-11 превышала посевную в 3,0 раза, Pichia kudriavzevi-96 в 2,5 раза (Р 0,001). Кислото- и щелочеустойчивость исследуемых микроорганизмов варьировала. Так, хороший рост Pichia kudriavzevi-96 регистрировали при рН 3,5 (биомасса от исходных значений увеличивалась на 63,5 % (Р 0,001)), против – 10 % увеличения биомассы у Saccharomyces cerevisiae-11. Напротив, при культивировании в сильно щелочной среде (рН 9,5) лучший рост отмечали у Saccharomyces cerevisiae-11, биомасса увеличивалась на 17,3 % (Р 0,05), против – 4,0 % у Pichia kudriavzevii-96. Ингибирующий эффект отмечали при культивировании дрожжей при рН 3 и 10. Через 72 ч культивирования при значении рН среды 3, жизнеспособными оставались 38,3 % Saccharomyces cerevisiae-11 и 71,0 % Pichia kudriavzevii-96. Количество Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 при рН 10 составило 2,00±0,09 и 1,80±0,04 lg КОЕ/см3, что на 66,7 и 70,0 % (Р 0,001) ниже исходной посевной дозы.
Обнаруженный рост в широком диапазоне рН показывает преимущество этих изолятов перед другими деструкторами, в частности бактериальной природы, характеризующимися способностью роста при нейтральных значениях.
Снижение антагонистической активности исследуемых микроорганизмов при изменении рН культивирования (диапазон от 3,5 до 8,5) не наблюдали.
Способность к росту при низких и высоких значениях рН свидетельствует о приспособленности отобранных изолятов к изменяющимся условиям внешней среды и представляет значительный интерес для практического использования при очистке объектов, утилизации субстратов, характеризующихся повышенной кислотностью и щелочностью.
Изучение устойчивости Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 к воздействию фенола проводили в условиях модельного эксперимента. В пробирки с питательной средой вносили посевной материал исследуемых микроорганизмов и различное количество фенола. В контрольные пробирки фенол не вносили.
Хороший рост микроорганизмов и увеличение биомассы, аналогичное контрольным вариантам, наблюдали при содержании фенола в среде до 1,0 мг/см3. При содержании фенола в среде 1,5 мг/см3 прирост биомассы Saccharomyces cerevisiae-11 был ниже контрольного варианта на 36,6 % (Р 0,001), 10,20±0,09 против 16,10±0,17 lg КОЕ/см3. Pichia kudriavzevii-96 – на 22,0 % (Р 0,001), 10,30±0,07 против 13,20±0,13 lg КОЕ/см3. Прирост Saccharomyces cerevisiae-11 при культивировании в среде, содержащей 2,0 мг/см3 фенола, был ниже контрольного варианта на 49,7 %, Pichia kudriavzevii-96 на 40,1 % (Р 0,001) соответственно.
Концентрация фенола в среде более 2,0 мг/см3 ингибировала рост дрожжей. Однако при культивировании Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в среде, содержащей 2-10 мг/см3 фенола (диапазон доз исследования), не отмечали 100 % гибель микроорганизмов.
Рассматривая Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 как объекты ремедиационных технологий, представляло интерес оценить их устойчивость к тяжелым металлам, в частности, высокие концентрации которых обнаруживаются в активном иле.
В модельных экспериментах исследовано влияние свинца и кадмия на рост Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 при культивировании в бульоне Сабуро с добавлением различных концентрацией их солей.
Технологическая схема производства Энтероспорина
Процесс приготовления Энтероспорина включает в себя несколько этапов, представленных в виде технологической схемы на рисунке 42.
Первый этап включает приготовление питательных сред и посевного материала. Для получения посевного материала штамм Bacillus subtilis-93 засеивали «штрихом» на поверхность скошенного МПА. Инкубировали в условиях термостата при температуре 370С в течение 24 ч. По истечении этого времени с поверхности агара 0,9 % - ным раствором натрия хлорида смывали выросшие колонии микроорганизмов. Полученную суспензию разбавляли до содержания клеток 10 lg КОЕ/см3. При исследовании световой микроскопией окрашенных по Грамму мазков проверяли чистоту выросшей культуры – отсутствие контаминации посторонней микрофлоры.
На втором этапе проводили глубинное культивирование путем засева 10 %-ного посевного материала в МПБ, разлитый в колбы различного объема. В жидкой питательной среде инкубировали в течение 48-72 ч при температуре 370С. После культивирования вновь проверяли чистоту КЖ на отсутствие посторонней микрофлоры. Третий этап включал внесение полученной микробной суспензии в 0,9 % - ный раствор натрия хлорида в объеме 1 %. На четвертом этапе проводили упаковку, маркировку и контроль готовой продукции. Соответствие качества лекарственного средства регламентируется требованиями действующей нормативной документации и включает оценку следующих показателей: внешний вид, цвет; наличие посторонних примесей; количество жизнеспособных бактерий в 1 см3; контаминация посторонней микрофлорой; безвредность. Концентрация микробных клеток в 1 см3 препарата не менее 9,3 lg КОЕ. 2 Оценка эффективности Энтероспорина для лечения желудочно-кишечных болезней телят Опыты проведены на 30 телятах черно-пестрой породы, 1-2 дневного возраста. По принципу аналогов было сформировано три группы животных. Первая группа – биологический контроль, клинически здоровые животные, манипуляции не проводили. Животные второй и третьей группы были с характерной клинической картиной простой диспепсии. У животных этих групп отмечали снижение пищевой возбудимости, усиление перистальтики кишечника с выделением жидких фекалий желто-серого цвета. Температура тела была в пределах физиологической нормы.
Животных второй группы лечили по традиционной схеме, принятой в хозяйстве: пропускали выпойку молозива, из сосковой поилки задавали слегка подсоленный отвар лекарственных трав (зверобой и тысячелистник). В следующее кормление молозиво выпаивали в небольшом количестве, с постепенным его увеличением. Отвар трав задавали в каждое кормление.
Животным третьей группы задавали пробиотик Энтероспорин в дозе 10 см3/гол до выздоровления вместе с молозивом 1 раз в сутки (Приложение О).
Улучшение общего клинического состояния у животных второй и третьей группы отмечали на 3 и 5-е сут после начала лечения соответственно.
Проведенный микробиологический анализ кишечного содержимого животных второй и третьей группы показал изменения в микробиоценозе (таблица 70).
В сравнении со здоровыми животными у телят второй и третьей групп отмечали снижение количества бифидобактерий на 56,9 и 51,4 % (Р 0,001); лактобактерий - на 56,7 % (Р 0,001), эшерихий с нормальной ферментативной активностью на 32,5 и 31,2 % (Р 0,001); увеличение частоты высеваемости дрожжей на 15,4 и 15,6 % (Р 0,05) соответственно.
Пробиотик Энтероспорин способствовал коррекции кишечного биоценоза. На 5-е сут опыта количество бифидобактерий у животных второй и третьей групп было меньше биологического контроля на 34,1 (Р 0,001) и 6,3 %. Уровень лактобактерий был ниже у животных второй группы на 37,6 (Р 0,001), третьей -на 15,3 % (Р 0,01).
Численность обнаруженных эшерихий у телят второй и третьей групп была ниже, чем в первой на 32,5 (Р 0,001) и 5,0 % соответственно. У животных второй и третьей групп содержание дрожжей в сравнении с биологическим контролем было выше на 26,5 (Р 0,001) и 11,2 %.
Количество бифидобактерий на 10-е сут опыта у животных второй и третьей групп было меньше значений биологического контроля на 27,0 (Р 0,001) и 6,7 %. Содержание лактобактерий было ниже на 30,6 (Р 0,001) и 5,5 %; эшерихий на 35,8 (Р 0,001) и 4,1 % у второй и третьей групп соответственно. В эти сроки популяционный уровень дрожжей в кишечнике телят второй группы превышал данные животных биологического контроля на 28,7 % (Р 0,001). Этот показатель у телят третьей группы находился на уровне здоровых животных. Использование Энтероспорина для нормализации микробиоценоза после применения антибактериальных средств Длительное, а чаще необоснованное применение антибактериальных средств приводит к нарушению микробного пейзажа желудочно-кишечного тракта. В следующей серии опытов проведено исследование кишечного биоценоза после курсового применения антибиотика. Опыты проведены на 10 телятах черно-пестрой породы живой массой 30-40 кг, разделенных по принципу аналогов на две группы. В комплексе лечебных мероприятий при токсической диспепсии был использован антибиотик пролонгированного действия «Трисульфан», разработанный в «ФЦТРБ-ВНИВИ» (трехкратно, с интервалом 72 ч, в дозе 1 см3/30 кг). Через 24 ч после последней инъекции антибиотика животным первой группы (опыт) задавали Энтероспорин в дозе 10 см3/гол. С животными второй группы (контроль) манипуляции не проводили. Как видно из данных, приведенных в таблице 71, применение антибиотика приводило к существенным изменениям микробиоценоза: отмечено снижение представителей нормофлоры, повышение количества дрожжей. Использование Энтероспорина после курса антибиотикотерапии положительно влияло на кишечный биоценоз. Содержание бифидобактерий и лактобактерий было выше на 26,3 (Р 0,001) и 20,0 % (Р 0,01); количество дрожжей меньше на 29,4 % (Р 0,001), чем у животных 2-й группы. Показатель эшерихий с номальной ферментативной активностью в кишечнике телят опытной группы превышал данные животных группы контроля на 22,5 % (Р 0,01).
