Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Этиопатогенез раневого процесса и современные подходы к лечению инфицированных ран 8
1.2 Поверхностно-активные соли четвертичного аммония и их использование в ветеринарии и медицине 27
2. Материалы и методы исследований 42
3. Собственные исследования 48
3.1 Изучение физико - химических свойств и стабильности клемацида 48
3.1.1 Физико-химические свойства 48
3.1.2 Изучение стабильности препарата клемацид 49
3.2 Токсические свойства препарата клемацид 51
3.2.1 Изучение острой токсичности клемацида 51
3.2.2 Изучение субхронической токсичности 57
3.2.3 Местнораздражающее и кожно - резорбтивное действие препарата 59
3.2.4 Изучение аллергизирующего действия клемацида 64
3.2.5 Эмбриотоксические и тератогенные свойства при применении клемацида 65
3.2.6 Изучение иммунотоксичности при применении клемацида 67
3.3 Фармакологические свойства препарата клемацид 71
3.3.1 Влияние клемацида на показатели красной крови 71
3.3.2 Изучение влияния клемацида на показатели обмена веществ 72
3.3.3 Влияние клемацида на функции органов и систем организма 74
3.4 Изучение терапевтической эффективности препарата клемацид при лечении раненых животных 77
3.4.1 Изучение биологической активности клемацида 77
3.4.2 Определение противовоспалительного действия и влияние клемацида на регенеративные процессы 82
3.4.3 Лечебная эффективность клемацида при открытых механических повреждениях у лошадей 85
3.4.4 Исследование морфологических изменений в тканях раненых животных при воздействии препарата клемацид 93
3.4.5 Экономическая эффективность результатов исследований 103
4. Обсуждение результатов исследований 109
5. Выводы 117
6. Практические предложения 119
7. Список литературы 120
Приложения 133
- Поверхностно-активные соли четвертичного аммония и их использование в ветеринарии и медицине
- Местнораздражающее и кожно - резорбтивное действие препарата
- Изучение биологической активности клемацида
- Исследование морфологических изменений в тканях раненых животных при воздействии препарата клемацид
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Травматизм в спортивном коневодстве является одной из серьёзных проблем современной ветеринарии и наносит значительный экономический ущерб животноводству (К.И.Шакалов, 1972; А.Ф.Бурденюк, 1976; И.С.Панько, 1982; В.А.Лукьяновский, 2003; Э.И.Веремей, В.А.Журба, 2004; R.Kastner, E.Schmidt, 2001).
Опыт борьбы с травматизмом животных и прежде всего с открытыми механическими повреждениями убедительно показал, что основная роль при этом отводится лекарственной терапии, позволяющей значительно снизить наносимый экономический ущерб. Для этого используют различные фармакологические средства. Наиболее широкое распространение из них на сегодняшний день получили мази и линименты на основе антибиотиков, сульфаниламидов, нитрофуранов. Однако их эффективность в последнее время значительно снизилась из-за изменения биологических свойств микроорганизмов, проявления множественной резистентности после многократного пассажирования и усиления их вирулентных свойств. Устойчивые формы возбудителей, в качестве новой биологической популяции циркулируют в природе и инфицируют животных, что существенно затрудняет их терапию (Г.Н.Васин, 1984; А.Н.Елисеев, 1993; Х.Американов, 1999; И.Н.Мяхнов, 2007; С.Д.Панасюк, 2007; D.Baggot, 1976; G.Rowlands et.al. 1985; J.T.Sohrt, 2000; W.Kehler, T.Gerwing, 2004 и др.).
С рассматриваемых позиций значительный практический интерес представляют антисептические средства, содержащие в качестве действующих веществ соединения из группы поверхностно-активных веществ, в частности, четвертичные аммониевые соединения (ЧАС) (В.А. Антипов, И.С. Жолобова, 2004; П.П. Яковенко, 2005).
Они обладают иным, чем антибиотики и сульфаниламиды механизмом
действия на микробную клетку. Лекарственная устойчивость к ним развивается
медленно и не достигает высоких пределов. Установлены выраженное лечебное и
профилактическое действие поверхностно-активных веществ и экономическая
обоснованность их применения при различных заболеваниях
сельскохозяйственных животных и птиц. Это делает разработку и внедрение новых лекарств из группы поверхностно-активных веществ, в частности, четвертичных аммониевых соединений актуальной научной проблемой. К числу таких средств, прежде всего, относят новые препараты: этоний, тионий, димеколин, бромбиоцид, обладающие ярко выраженными бактериостатическими и бактерицидными свойствами (И.И.Сидорчук, Е.И.Тищенко, 1979; В.А.Березовский, 1983; Е.Б.Иванова, 2000).
Настоящая работа посвящена проведению исследований по разработке оптимальной лекарственной формы и определению режимов применения нового лечебного средства наружного применения при инфицированных кожно -мышечных ранах у лошадей. Данная тема является разделом общей тематики кафедр факультета ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Кубанского го-
сударственного аграрного университета по заданию 4.12 (№ госрегистрации 01910049842).
1.2 Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы
состоит в том, чтобы на основе различных сторон этиопатогенеза открытых
механических повреждений, усовершенствовать лечебно - профилактические
мероприятия при кожно - мышечных ранах у лошадей, путём разработки нового
лекарственного средства наружного применения. Исходя из цели исследования,
были поставлены следующие основные задачи:
уточнить некоторые аспекты патогенеза открытых механических повреждений, а также направления терапии указанной патологии у лошадей;
разработать эффективный, экологически безвредный препарат для терапии инфицированных кожно - мышечных ран у лошадей;
изучить основные токсикологические и фармакологические свойства клемацида;
разработать и внедрить в практику животноводческих хозяйств новый метод лечения лошадей с открытыми механическими повреждениями.
Научная новизна. Проведена разработка, фармако-токсико-логическая оценка и научное обоснование применения мази при открытых механических повреждениях у лошадей в сравнительном аспекте с другими препаратами, применяемыми при инфицированных кожно - мышечных ранах. Разработана схема лечения при ранениях лошадей.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований предложен новый эффективный препарат - клемацид для лечения инфицированных кожно - мышечных ран у лошадей путем наружного его применения.
Основные положения, выносимые на защиту.
результаты морфологических и бактериологических исследований кожно -мышечных ран;
результаты клинического проявления раневого процесса;
разработка и фармако - токсикологическая оценка препарата клемацид для лечения инфицированных кожно - мышечных ран у лошадей;
комплексный метод лечения лошадей с открытыми механическими повреждениями;
1.6 Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и
одобрены на научно - производственных конференциях профессорско -
преподавательского состава Кубанского государственного аграрного университета
(2007 - 2009 гг.), учёных советах факультета ветеринарной медицины Кубанского
ГАУ (2006 - 2009 гг.), на международной научно - практической конференции
«Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних
животных» (г. Воронеж - 2006г.), на международной научно - практической
конференции «Трансферт инновационных технологий в животноводстве» (г. Орёл -
2008г.), на XIII московском международном ветеринарном конгрессе (г. Москва -
2009г.), на международной научно практической конференции посвященной 35 -
летию факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного
аграрного университета (г. Краснодар - 2009).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в четырех научных статьях и бюллетене изобретений, в том числе в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК России - «Труды Кубанского государственного аграрного университета».
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста в компьютерном варианте и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Список литературы включает 137 источников, в том числе 24 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей, 10 рисунками.
Поверхностно-активные соли четвертичного аммония и их использование в ветеринарии и медицине
В последнее время, большой практический интерес представляют, антисептические средства, содержащие в качестве действующих веществ соединения из группы поверхностно-активных веществ, в частности, четвертичные аммониевые соединения (ЧАС).
Начало изучению четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) положил немецкий химик W.Hofman, который в 1851 году синтезировал простейшую соль - йодистый тетрамиламмоний (В.П. Денисенко, 1972). Все ЧАС можно разделить на моночетвертичные и бисчетвертичные, с общей формулой для моночетвертичных аммониевых соединений
По данным В.П. Денисенко и В. П. Руди (1975), биологические и физические свойства бисчетвертичных аммониевых соединений находятся в определенной зависимости от длины углеродной цепочки гидрофобного радикала, расстояния между четвертичными атомами азота, наличия сложно-эфирной группы в гидрофобном радикале. Соединения с меньшим расстоянием (п=2) и величиной гидрофобного радикала R=CioH2i обладают наибольшей поверхностной активностью, у них лучшая смачивающая способность. Кроме того, с уменьшением расстояния между четвертичными атомами азота увеличивается адсорбционная способность бисчетвертичных аммониевых солей на гидрофильных и гидрофобных поверхностях. В больших концентрациях данные соли обладают стабилизирующей и эмульгирующей способностью, что представляет интерес для приготовления лекарственных форм.
Антибактериальная активность катионных ПАВ определяется строением и свойствами молекулы в целом, которые зависят как от гидрофобной, так и гидрофильной части молекулы ПАВ и их взаимного влияния (М.А. Чернявская с соавт., 1984). Для достижения оптимального бактериостатиче-ского действия катионных ПАВ необходимо, чтобы количество атомов углерода в их алкильных цепочках и алкильных радикалах фосфолипидов цито-плазматических мембран микробов соответствовали друг другу (Н.А. Ляпунов с соавт., 1984).
Г.Е. Мартиросян, А.В. Зильфан и др. (1985) рекомендуют для лечения гнойных ран применять новое соединение из класса четвертичных аммониевых соединений в виде ежедневных аппликаций 0,1% водным раствором в течение 4-6 мин. На 4-е, 6-е сутки отмечалось заживление ран по первичному натяжению, а вегетирующие в ране золотистый стафилококк, кишечная палочка и протей вульгарный не высевались. Г.Т. Писько (1977) отмечает, что применение 0,05-0,25% водного раствора этония, который является катион-активным соединением, стимулирует заживление язвенно-некротических по 29 вреждений кожных покровов и слизистых оболочек. При этом к нему чувствительны золотистый стафилококк, кишечная палочка, протей вульгарный, синегнойная палочка, грибы рода кандида. По данным чешских ученых V. Ciganekva, J. Kallova, F. Pevinsky (1989), соединения из класса четвертичных аммониевых соединений обладают сильными ранозаживляющими и противовоспалительными свойствами.
Для лечения свежих инфицированных ран у крупного рогатого скота В.Н. Видении, М.М. Широбокова (1983) предлагают 0,5% раствор этония. Установлено, что обработка свежей инфицированной раны 0,5% водным раствором этония предупреждает гнойное осложнение у 94,5% коров. Подобные результаты были получены группой ученых, Б.С. Семеновым, В.Н. Видениным, В.Н. Антоновой, В.И. Соколовым (1988), которые изучали влияние этония и катапола на заживление экспериментальных, инфицированных ран у крупного рогатого скота.
Н.Н. Филипповым в 1985 году установлено, что при использовании катапола с целью профилактики гнойных осложнений заживление ран происходит быстрее и чаще по первичному натяжению в сравнении с фурацили-ном.
Американский ученый D.A. Shutt (1994) применял после кастрации баранов присыпку, в состав которой входили четвертичные аммониевые соединения. При этом заживление кастрационной раны проходило быстрее, наблюдалось меньше осложнений в сравнении с препаратами, содержащими антибиотики.
А.К. Чулков в 1983 году изучал лечебную эффективность, а также фармакологическое действие на организм больных колибактериозом телят этония и фтазина отдельно и в сочетании с регидратационным солевым раствором. Возбудителями болезни в хозяйстве были E.coli 0-серогруппы 018, 01, 0101, 09, 0138, 0119, 015, 078, 0127. Опыты по определению бактериостати-ческой и бактерицидной активности этония как самого по себе, так и совместно с фтазином проведены in vitro на 5 серогруппах E.coli. Сочетание этония и фтазина повышает бактериостатическую и бактерицидную силу комплексного препарата в 8 раз. В опыте использовали телят 1-3 дн. возраста. Установлена зависимость между течением заболевания и изменением уровня активности Nasyb(+), Ksyb(+) -Атф-азы, а также содержанием ионов Nasyb(+) и Ksyb(+) в сыворотке и эритроцитах крови. Этоний применяли внутрь в дозе 10 мг/кт, фтазин - 100 мг/кг живой массы. Раствор этония и фтазина готовили по следующей прописи: необходимое количество этония (10 мк/кг) растворяли в 1 л кипяченой, охлажденной до 45-50С воды. Добавили в раствор 9 г хлорида натрия. Раствор тщательно перемешивали и постепенно, при постоянном механическом помешивании, добавляли в него фтазин (100 мг/кг), а затем 30 г глюкозы. Выпаивали раствор из сосковой поилки. Указанный раствор показал высокую терапевтическую эффективность при лечении телят, больных колибактериозом на ранней стадии заболевания.
О.А. Полякова, А.К. Чулков (1984) изучали эффективность фтазина при совместном применении с катионактивным, четвертичным аммониевым соединением - этонием и регидратационным солевым раствором хлорида натрия при лечении телят, больных бактериозом. Совместное назначение сульфаниламидных препаратов с поверхностно-активными соединениями способствует повышению активности сульфаниламидов и преодолению лекарственной резистентности микроорганизмов.
Курс лечения суспензией фтазина (доза 100 мг/кг) и этония (10 мг/кг) на основе изотонического раствора хлорида натрия обеспечивает клиническое выздоровление животных после 2-3-разового перорального применения препарата (О. А. Полякава, 1984).
А.Ф. Евтушенко, В.И. Гуменюк (1987) установили, что сочетанное применение этония с сульфаниламидами сокращают потери от вынужденного убоя на 54,1%, падежа на 35,6% при острых респираторных и желудочно-кишечных болезнях телят. В.Ф. Солошенко, В.П. Онуфриев (1987); Е.Ф. Макаренко (1985) - отмечали хороший профилактический эффект этония при применении его для профилактики острых респираторных заболеваний.
Японские ученые Tamura, Bokun, с соавт. (1989) синтезировали новую четвертично-аммонивую соль и установили положительный терапевтический эффект при лечении телят больных колибактериозом. Причем при изучении ЧАС in vitro была установлена его активность по отношению к сальмонелле, кишечной и синегнойной палочке золотистого и эпидермального стафилококков, а также грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Penicillium.
Э.Э. Яппаров, Г.Б. Карапетян (1984) изучали бактериостатические и бактерицидные свойства химиотерапевтических препаратов этония и тиония по отношению к лептоспирам. Действие этих препаратов изучали на 6 диагностических штаммах лептоспир (гриппотифоза, помона, тарассови, каникола, иктерогеморрагия, гебдомадис). Этоний в разведении 1:1600 оказывает бактерицидное, а в разведении 1:3200 - бактериостатическое действие на лептоспир, тионий - соответственно в разведениях 1:1200 и 1:1600. Адаптации культур лептоспир к этонию и тионию не наблюдали.
И.Д. Бурлуцкий, Г.Б. Карапетян, М.О. Лозинский (1984) испытали препарат этоний при диареях телят невыясненной этиологии. Препарат применяли внутрь в виде 0,1%-ного р-ра в дозе 10 мг/кг. Выздоровление наступало к 11-13 дню. Эффективность - 97,7%. В качестве контроля препарата служили антибиотики и гипериммунная сыворотка УзНИВИ против коли-бактериоза телят.
Е.М. Уколова, И.В. Сидоров, Н.А. Костромитинов (1998) создали комплексный препарат для лечения телят, больных сальмонеллезом, состоящий из этония и нитроксолина. Проверена его антимикробная активность, параметры токсичности, терапевтическая эффективность. Последнюю изучали в сравнении с препаратами - фтазином, бициллином и канамицином. Одновременно с препаратами использовали средства патогенетической терапии. Лечение проводили под контролем гематологических и иммунологических показателей. Терапевтическая эффективность этония в дозе 1 мг/кг больным сальмонеллезом телятам (88 гол.) составила 80% при 60%-ной эффективности других препаратов. Сочетание этония и нитроксолина в комплексном препарате носит синергидный характер. Н.А. Костромитинов (1998) рекомендует применение этония при паратифе телят.
Местнораздражающее и кожно - резорбтивное действие препарата
Первую серию опытов по изучению раздражающего действия препарата клемацид провели на 2 кроликах породы «Белый великан». За два дня до эксперимента тщательно выстригали шерсть на спине, избегая механических повреждений кожных покровов. Исследуемый препарат наносили в виде 1 %-ного раствора, площадь нанесения составляла 80-82 см" (5% от общей поверхности тела животных).
Препарат равномерно распределяли по поверхности участка в дозах от 0,02-0,10 мл/см при экспозиции 4 часа, после чего кожу аккуратно протирали ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой. Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения.
В результате визуальной оценки состояния кожи и измерения толщины её складки было отмечено, что исследуемый препарат не вызывал поврежде 60 ния в виде эритемы или отеков. Аппликация препарата не вызывает местную реакцию в виде десквамации, аллергической экземы, дерматита.
Во второй серии опытов изучили местнораздражающее действия препарата клемацид, 2 кроликам однократно наносили клемацид на конъюнктиву. Визуальную оценку проводили в баллах от 0 (раздражающий эффект отсутствует) до 10 (раздражающий эффект сильно выражен). Клиническое состояние организма кроликов после нанесения на конъюнктиву глаз препарата клемацид для накожного применения оставалось в пределах нормы, т.е. не выявлялись изменения в температуре тела, частоте пульса и количестве дыхательных движений (табл. 10).
Таким образом, клемацид обладает слабораздражающим действием при наружном применении. По истечении шести и двадцати четырёх часов после аппликации изменений в поведении животных, слезотечения, отёка век, изменений со стороны конъюнктивы и диаметра зрачка установлено не было.
При визуальной оценке состояния конъюнктивы, роговицы и век глаз кроликов установлено, что клемацид вызывает слабое раздражение конъюнктивы спустя 1 час после закапывания, которое проходило уже к 2-му часу (табл. 11).
В четвёртой серии опытов препараты вводили шести подопытным крысам однократно внутрижелудочно в рекомендуемых терапевтических дозах. Через 6 часов животных подвергали декапитации, вскрывали и проводили макро - и микроскопическое исследование слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
При осмотре и гистологическом исследовании желудочно-кишечного тракта патологических изменений обнаружено не было. Слизистые оболочки глотки и пищевода гладкие, блестящие, розового цвета. Желудок в объёме не увеличен, стенки тонкие, упругие. Слизистая и подслизистая желудка и двенадцатиперстной кишки не утолщена, клетки покровного и железистого эпи 62 телия имеют нормальную форму и размеры. Слизистая оболочка толстого и тонкого отдела кишечника, также имеет характерную розовую окраску, не утолщена, гладкая, блестящая.
Проведённые исследования позволяют сделать вывод, что изучаемый препарат клемацид местнораздражающим действием не обладает.
Оценка кожно-резорбтивного действия клемацида проведена с использованием «пробирочного метода» на 40 белых мышах с массой тела 18 ± 1,7г. Сущность метода сводится к длительному воздействию кожных покровов хвоста мышей с неразбавленным препаратом. Животных фиксировали в специальном станке, разработанном ГНУ ВНИВИПФиТ, время экспозиции препарата - 2 часа в сутки в течение 14 суток. Учет реакции проводили по гибели животных, по изменению массы и температуры тела, состава периферической крови, общему состоянию и внешнему виду животных, визуальной оценке кожных покровов. Полученные данные (табл. 12) свидетельствуют, что препарат не обладает кожно-резорбтивным эффектом. Органического повреждения хвоста подопытных животных не выявлено.
При оценке кожно-резорбтивного действия клемацида в опытах на 40 белых крысах с массой тела 190+10 г препарат наносили на предварительно подготовленные участки кожи при плотности нанесения 50-60 мг/см и экспозиции 2 часа. Продолжительность опыта - 20 суток, кратность нанесения -6 раз в неделю. Критериями кожно-резорбтивного действия препарата служили выживаемость животных, изменения их массы и температуры, состав периферической крови, внешний вид, поведение, изменения со стороны кожных покровов (табл. 13).
В опытах установлено, что 20-ти кратная аппликация клемацида на кожные покровы крыс не вызывает гибели животных, не нарушает целостности кожи на месте нанесения, не нарушает функционирования организма животных.
Полученные данные (табл. 12, 13) свидетельствуют, что препарат не обладает кожно-резорбтивным эффектом. В опытах установлено, что 20-ти кратная аппликация клемацида на кожные покровы мышей и крыс не вызывает гибели животных, не нарушает целостности кожи на месте нанесения, не нарушает функционирования организма животных.
Изучение биологической активности клемацида
Антимикробные свойства клемацида проверяли при помощи следующих методов: диффузии в агар с использованием лунок и последовательных серийных разведений.
Изучение антимикробной активности клемацида проводили в сравнительном аспекте со следующими препаратами: йодинол, ривициклин, стрептомицин, левомицитин, цефазолин. Опыт проводили в пяти повторностях, используя раствор бромацида, выработанный в одной серии. В качестве тест-культур использовали одно-двухдневные полевые очищенные изоляты микроорганизмов, выделенные из раневого отделяемого лошадей с инфицированными кожно - мышечными ранами.
Новый препарат обладает выраженным бактериостатическим действием по отношению к культурам золотистого стафилококка, кишечной палочки, протея вульгарного, синегнойной палочки и грибов.
Таким образом, культуры условно-патогенной микрофлоры оказались высоко чувствительны к клемациду и показали зону задержки роста в пределах 20,1 до 35,5 мм, что превосходит применяемые препараты: йодинол, ривициклин, стрептомицин, левомицитин, цефазолин.
При определении бактерицидной активности клемацида, в жидкой питательной среде делали его дробные (кратные) разведения в МПБ. В бульон, содержащий препарат в убывающей концентрации (разведение от 1:2 до 1:256) вносили тест-культуры. Микробная нагрузка составляла 1млрд. мик 78 робных тел в 1мл. Пробирки с питательной средой инкубировали в термостате в течение 18-20 часов при температуре 37С Активность препарата определяли по интенсивности задержки роста и ингибиции микроорганизмов. За минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) принимали наименьшее количество препарата задерживающего рост микроорганизмов.
Клемацид обладает выраженным антимикробным действием в разведениях от 1:2 до 1:32 по отношению к культуре Staphylococcus aureus. МБцК, для Е. соП и Proteus vulgaris составила 1:16, а МБсК - обнаружена при разведении препарата 1:32 (таблица 24).
Сравнительные данные антимикробной и фунгицидной активности препарата клемацид представлены в таблице 25. Таким образом, клемацид обладает высокой антибактериальной и фунгицидной активностью против основной условно-патогенной микрофлоры, являющейся одним из этиологических факторов инфицированных ран.
С целью сравнения особенностей формирования устойчивых вариантов микроорганизмов к клемациду, а также к широко используемым антибиотикам была проведена серия пассажей 5 тест-культур в присутствии левомицетина.
При этом установлено, что формирование устойчивых вариантов условно-патогенных бактерий к этому антибиотику происходило уже к 10-му пассажу (табл. 26).
Только St.epidermidis к 15 пассажу проявлял некоторую чувствительность к антибиотику (зона задержки роста 3,4 мм против 23,1 в 1 пассаже, для левомицетина. Также Е. соП к 15 пассажу была чувствительна к левомицетину (4,6 мм против 22,4 мм в 1 пассаже). При этом S.aureus уже к 5 пассажу резко снижал уровень чувствительности к антибиотику и был устойчив к нему после 10 пассажа.
Бактерии кишечной группы (E.coli) были отнесены к умеренно-чувствительным.
При изучении развития устойчивости этих же тест - культур к клема-циду установлено, что P. vulgaris смогла выработать устойчивость к 20 пассажу, у всех других испытуемых микроорганизмов к этому времени чувствительность оставалась довольно высокой (таблица 27). Характерно, что начальные уровни чувствительности патогенных и условно-патогенных бактерий также были заметно выше, чем к антибиотику.
Не наблюдалось также и скачкообразного изменения чувствительности.
Исследование морфологических изменений в тканях раненых животных при воздействии препарата клемацид
Патоморфологические исследования были выполнены в период с декабря 2009 по март 2010 года на кафедре анатомии сельскохозяйственных животных при техническом содействии кандидата ветеринарных наук, доцента Кравченко Виктора Михайловича.
Материалом для исследования послужили кусочки кожи и подлежащих тканей от 10 лошадей двух групп по 5 из каждой. Животных первой группы с гнойно-некротическими ранами лечили препаратом «Клемацид», а лошадей второй группы с аналогичными ранами - препаратом «Клефурин». Материал для исследования отбирали до лечения, а затем на 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 дни лечения и наблюдения. Отбор проб осуществляли после местной анастезии 5%-ным раствором новокаина, справа или слева от раны, на границе поражённой и граничащей с ней здоровой тканью. Кусочки, толщиной около 1 мм вырезали на всю глубину раны. В дальнейшем материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. После формалиновой фиксации материал промывали в проточной воде, затем обезвоживали в спиртах нарастающей концентрации от 50 до 96%, а затем уплотняли в парафине в термостате при температуре +57С и заливали в парафин (Меркулов Г. А., 1969 в нашей модификации).
После этого при помощи санного микротома МС-2 готовили серийные парафиновые срезы толщиной 5-6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Всего было изготовлено и исследовано 100 микропрепаратов от 10 лошадей двух групп.
Фотографии изготавливали при помощи микроскопа «Микмед - 1» и цифрового фотоаппарата «Canon А470». Фотографирование осуществляли при увеличении х150 (окуляр 15, объектив 10), хЗОО (окуляр 15, объектив 20) и хбОО (окуляр 15, объектив 40).
Морфометрию гистологических структур проводили при помощи окуляр-микрометра. Расчёт осуществляли по формуле: m = (а х с), где а - число делений объект-микрометра, в - число делений окуляр-микрометра, с -величина одного деления объект-микрометра (в мкм или мм). Одно деление объект-микрометра для окуляра 7 и объектива 3,5 составляет 32 мкм, для окуляра 7 и объектива 8 составляет 14 мкм, для окуляра 7 и объектива 20 составляет 5,5 мкм, для окуляра 7 и объектива 40 составляет 2,9 мкм (1 мкм = 0,001 мм).
Патоморфологические исследования
При визуальном исследовании у животных обеих групп раны носили характер рваных, инфицированных, гнойно-некротических. Вне зависимости от места их локализации, они представляли собой глубокое нарушение целостности кожи и подлежащих тканей. Размер их в среднем составлял 6,2 см длины, 3,5 см ширины, 1,5 см глубины. Края ран были неровными, припухшими и пропитанными кровью с гнойным экссудатом. В раневом канале ран находились остатки некротизированных тканей и волос вперемешку с гнойным экссудатом. Ткань, расположенная по периферии ран была покрыта гнойным экссудатом, гиперемированная, отёчная и болезненная при пальпации.
При патогистологическом исследовании ран до лечения клемацидом определяли альтеративные процессы, которые охватывали все структуры кожи и подлежащих тканей. Среди процессов альтерации преобладали некротические процессы. При этом вокруг и внутри некротической субстанции локализовывались гнойные инфильтраты, состоящие из распавшихся нейтро-фильных лейкоцитов (рис. 1, 2). По периферии гнойных инфильтратов определялись, в небольшом количестве, полибласты, нейтрофильные лейкоциты и лимфоциты (рис. 3). Кровеносные сосуды вокруг очагов инфильтратов были гиперемированными (рис. 4).
При патогистологическом исследовании ран до лечения клефурином, также определяли гнойно-некротические процессы всех поверхностных и подлежащих структур (рис. 5). По периферии таких участков выявляли молодые клетки соединительной ткани - полибласты, лимфатические клетки и лейкоциты.
При патогистологическом исследовании выявлено, что заживление ран происходило по вторичному натяжению путём репаративной регенерации, которая характеризовалась замещением дефекта вначале на грануляционную, а затем на зрелую соединительную ткань. В заживлении ран животных первой и второй группы хорошо определились три морфологических периода: формирование грануляционной ткани (рис. 6), формирование фиброзной соединительной ткани (рис. 7), формирование рубцовой соединительной ткани (рис. 8). Однако в первой и второй группе эти периоды имели различное временное значение.
Так, у животных первой группы, период формирования грануляционной соединительной ткани происходил в течение шести дней с начала лечения (рис. 9). В начале регенерационного процесса в грануляте преобладали различного размера капилляры, заполненные кровью, эндотелиальные и лимфатические клетки, и полибласты. Затем к концу этого периода большая часть капилляров была дифференцирована в артерии и вены, а количество соединительнотканных клеток увеличивалось. При этом в пролиферате преобладали эпителиоидные клетки и фибробласты. Количество соединительнотканных волокон и фиброцитов было не большим.
Второй период - формирования фиброзной соединительной ткани, происходил с шестого по девятый день от начала лечения. При этом фиброзная соединительная ткань в своём составе имела большое количество хорошо дифференцированных вен и артерий, и соединительнотканных клеток, среди которых преобладали фибробласты и фиброциты. Между этими клетками хорошо выявлялись параллельно расположенные пучки соединительнотканных волокон.
Третий период - формирования рубцовой соединительной ткани, проходил с девятого по пятнадцатый день от момента лечения. Зрелая соедини тельная ткань состояла из большого количества пучков соединительнотканных волокон и небольшого количества фиброцитов.
Дифференцировки эпидермиса кожи и подлежащих под ним тканей, сальных и потовых желез, волосяных луковиц мы не определяли.
При патогистологическом исследовании ран животных второй группы первый период - формирования грануляционной соединительной ткани, протекал в течение девяти дней с момента лечения (рис. 9). В начале, гранулят состоял из множественных капилляров и большого количества полибластов, эпителиоидных и эндотелиальных клеток, среди которых выявлялись одиночные лейкоциты и плазматические клетки. К концу данного периода регенерации происходила дифференцировка капилляров на различного диаметра вены и артерии. Количество волокон соединительной ткани и фиброцитов было незначительным.
Второй период регенерации протекал с шестого по двенадцатый день и морфологически характеризовался образованием фиброзной соединительной ткани. Вначале в её составе преобладали артерии, вены и молодые клетки соединительной ткани. Затем происходило увеличение количества дифференцированных клеток и пучков соединительнотканных волокон.
Третий период протекал с двенадцатого по восемнадцатый день лечения и морфологически характеризовался образованием рубцовой соединительной ткани. Рубцовая соединительная ткань состояла из дифференцированных клеток соединительной ткани - фиброцитов и параллельно расположенных пучков соединительнотканных волокон.
Дифференцировка эпидермиса кожи, а также подлежащих под ним тканей, сальных и потовых желез, волосяных луковиц не происходила.
Исходя из полученных результатов патоморфологического исследования ран нами установлено, что препарат клемацид обладает более выраженным регенерационным действием, чем препарат клефурин. Процесс регенерации у животных обеих групп, носил характер репаративного и протекал в три морфологических периода, отличавшихся по времени. У животных первой группы период формирования грануляционной соединительной ткани происходил с первого по шестой дни с момента лечения; второй период формирования фиброзной соединительной ткани происходил с шестого по девятый день лечения; третий период формирования рубцовой соединительной ткани происходил с девятого по двенадцатый день.
У животных второй группы период формирования грануляционной соединительной ткани происходил с первого по девятый дни лечения; второй период формирования фиброзной соединительной ткани происходил с девятого по двенадцатый день лечения; третий период формирования рубцовой соединительной ткани происходил с двенадцатого по восемнадцатый день лечения.
