Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 10
Глава 1. Значение пуринового метаболизма и его отдельных ферментов в биологии и медицине 10
Часть II. Собственные исследования .25
Глава 2. Клиническая характеристика больных .25
2.1. Больные РРА 25
2.2. Больные РА .34
2.3. Больные РОА 43
2.4. Больные ОА .48
Глава 3. Методы исследований 56
3.1. Выделение клеток крови и приготовление их лизатов 56
3.2. Определение активности аденозиндезаминазы .60
3.3. Определение активности АМФ-дезаминазы 62
3.4. Определение активности адениндезаминазы .64
3.5. Определение активности 5-нуклеотидазы 65
Глава 4. Энзимные исследования у здоровых людей .. 70
Глава 5. Энзимные исследования у больных рра .71
5.1. Энзимные исследования у больных РРА с I степенью активности процесса 75
5.2. Энзимные исследования у больных РРА с II степенью активности процесса 79
5.3. Энзимные исследования у больных РРА с III степенью активности процесса 84
Глава 6. Энзимные исследования у больных ра . 88
6.1. I степень активности процесса у больных РА 93
6.2. II степень активности процесса у больных РА 97
6.3. III степень активности процесса у больных РА 103
Глава 7 . Энзимные исследования у больных роа 106
7.1. Энзимные исследования у больных РОА с синовитом 109
7.2. Энзимные исследования у больных РОА без синовита 114
Глава 8. Энзимные исследования у больных оа с длительностью болезни 2 и более лет .118
8.1. Энзимные исследования у больных ОА с синовитом. 123
8.2. Энзимные исследования у больных ОА без синовита.. 130
Глава 9. Сравнительные исследования энзимной активности у больных ОА и РА 136
9.1. Больные РОА – ОА (свыше 24 месяцев) 136
9.2. Больные РРА – РА 143
9.3. Больные РРА – ОА 149
9.4. Больные ОА > 12 месяцев - РА > 12 месяцев 152
9.5. Больные РОА - РА > 12 месяцев 154
9.6. Больные РОА – РРА 156
Обсуждение результатов 161
Выводы 206
Практические рекомендации .208
Перечень используемых сокращений .210
Список литературы
- Больные РА
- Определение активности АМФ-дезаминазы
- Энзимные исследования у больных РРА с II степенью активности процесса
- Энзимные исследования у больных РОА без синовита
Введение к работе
Актуальность проблемы и степень ее разработанности
Болезни костно-мышечной системы (БКМС), в которые входят остеоартроз (ОА) и ревматоидный артрит (РА), являются причиной 7-8% ежегодной первичной инвалидизации, находясь на 3-м месте после болезней сердечнососудистой системы и злокачественных новообразований и устойчиво сохраняют второе место по случаям (8,1 случай) и третье место по дням (126,2 дня) временной нетрудоспособности на 100 работающих (Фоломеева О.М. и др.,2003). Исходя из этого, борьба с этими заболеваниями является значимой и актуальной медико-социальной проблемой. В последние годы уделяется большое внимание диагностике РА на ранних стадиях болезни и использованию в эти сроки (1-2 года) базисных препаратов, что положительно отразилось на эффективности лечения (Сальникова Т.С., 2003; Демидова Н.В., 2010; Федоренко Е.В. 2010; Combe B. Et al., 2007). В то же время относительно мало работ по ранней диагностике ОА и тактике лечения больных на ранних стадиях болезни (1-2 года), клиническая картина которой нередко сходна с РА (Цурю В.В. и др., 2000; Лучихина Л.В., 2001; Jordan K.M. et al., 2003; Zhang W. et al., 2005). И хотя ОА характеризуется менее злокачественным течением, чем РА, его прогрессирование приводит к потере трудоспособности, уступая в этом только ишемической болезни сердца (Шостак Н.А., 2007; Чичасова Н.В., 2007). Поэтому диагностика и дифференциация РА и ОА на ранних стадиях болезни является актуальной и социально-значимой проблемой, так как подходы в лечении больных РА и ОА имеют существенные различия.
До настоящего времени, практически, отсутствуют работы по изучению биохимических и иммунологических изменений в крови больных ОА и РА в процессе эволюции заболеваний (от 1года до 10 и более лет). Однако, логично предположить, что по мере эволюции болезни меняется не только клиническая картина заболевания, но и иммуннобиохимический статус крови, данные о котором в процессе эволюции болезни позволяют точнее диагностировать
заболевание и более дифференцированно подходить к лечению больных РА и ОА, что имеет важное практическое значение.
В основе патогенеза РА и ОА лежат иммунобиохимические нарушения с
преобладанием при РА иммунных, а при ОА - биохимических компонентов.
Одной из основных причин нарушений регуляции иммунных процессов являются
функциональные расстройства лимфоцитов, метаболизм которых при РА и ОА
изучен недостаточно (Робинсон М.В. и др.,1986). Известно, что некоторые
метаболиты нуклеиновых кислот (аденозин, гуанозин и др.) играют важную роль
в метаболизме лимфоцитов, их созревании, пролиферации, дифференциации и
имеют прямое отношение к иммунорегуляторным процессам (Дмитренко
Н.П.,1990; Земсков В.М., 1990). Исходя из этого, нам представляется, что
изучение активности ферментов, участвующих в реакциях метаболизма этих
веществ, относящихся к пуриновым соединениям и влияющих на функции
лимфоцитов и эритроцитов, является актуальным и перспективным
направлением, способствующим пониманию отдельных звеньев патогенеза РА и ОА с иммунобиохимических позиций.
В нашей работе были изучены активности 4-ех энзимов адениловой ветви пуринового метаболизма - составного цикла нуклеинового метаболизма: аденозиндезаминазы (АДА), АМФ-дезаминазы (АМФДА), адениндезаминазы (АД) и 5-нуклеотидазы (5-НТ) в лизатах лимфоцитов и эритроцитов здоровых людей, а также больных РА и ОА при различной длительности заболеваний и в зависимости от их клинических особенностей.
Цель исследования
Выявление особенностей активности АДА АМФДА АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов больных РА и ОА с различной длительностью заболеваний для повышения качества диагностики, дифференциальной диагностики этих заболеваний и оценки эффективности проводимой терапии больных РА и ОА.
Задачи исследования
-
Изучить активность АДА АМФДА АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов практически здоровых людей в зависимости от пола и возраста, определить референтные пределы активности энзимов.
-
Изучить активность АДА АМФДА АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов больных ранним ревматоидным артритом (РРА) в процессе лечения и в зависимости от клинических особенностей заболевания.
-
Изучить активность АДА АМФДА АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов больных РА с длительностью болезни 1-5 лет, 6-10 лет, свыше 10 лет и провести сравнительные исследования активности энзимов в зависимости от длительности болезни.
-
Изучить активность АДА, АМФДА, АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов больных ранним остеоартрозом (РОА) с длительностью болезни до 2-х лет, больных ОА с длительностью болезни 2-5 лет, 6-10 лет и свыше 10 лет в процессе лечения, в зависимости от клинических особенностей заболевания и провести сравнительные исследования в зависимости от длительности заболевания.
-
Выявить наиболее информативные энзимные констелляции в лимфоцитах и эритроцитах больных РРА и РОА, способствующие их дифференциации.
-
Выявить энзимные различия в лизатах лимфоцитов и эритроцитов у больных ОА с длительностью болезни более 2-х лет и РА с длительностью болезни более одного года, больных РРА и РА, РРА и ОА.
-
Выявить энзимные тесты в крови больных РА и ОА, способствующие оценке эффективности терапии на различных этапах заболеваний.
Научная новизна исследования
Впервые у больных РА и ОА в лизатах лимфоцитов и эритроцитов были проведены исследования активности 4-ех энзимов пуринового метаболизма: АДА, АМФДА, АД и 5-НТ и проведен анализ зависимости активности этих ферментов от продолжительности заболеваний и их клинических особенностей. Доказано, что наибольшее влияние на энзимный статус лимфоцитов и эритроцитов у
больных ОА оказывает синовит, а у больных РА выраженность активности
патологического процесса. Показано, что у больных ОА чем длительнее болезнь,
тем в лимфоцитах ниже активность АДА, АД, 5-НТ, в эритроцитах выше
активность АДА, 5-НТ, ниже АМФДА, а у больных РА - в лимфоцитах ниже
активность АДА, АМФДА, выше АД, в эритроцитах выше активность АДА, ниже
активность АД, АМФДА и 5-НТ. Установлено, что отдельные энзимные
показатели способствуют дифференциации РА и ОА как на ранних, так и поздних стадиях заболеваний.
Теоретическая и практическая значимость работы
Исследования активности АДА, АМФДА, АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов у больных РА и ОА с различной длительностью заболеваний способствуют дифференциации РА и ОА, выявлению синовита у больных ОА и минимальной активации ревматоидного процесса, уточнению степени его активности, правильной трактовке энзимных показателей крови у больных ОА и РА с длительным течением заболеваний, объективизации оценки эффективности терапии больных.
Методы определения активности АДА, АМФДА, АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов с целью дифференциации РА и ОА на ранних стадиях заболеваний, выявления синовита у больных ОА, уточнения степени активности ревматоидного процесса, объективизации оценки эффективности лечения больных ОА и РА внедрены в практику работы государственного учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница №25» г. Волгограда. С результатами проведенных энзимных исследований, возможностями энзимной диагностики в ревматологии, их перспективой ознакомлены студенты Волгоградского государственного медицинского университета, аспиранты, клинические ординаторы, практические врачи на семинарах, научно-практических и клинических конференциях.
Методология исследования
Выполнение научной работы состояло из 2 этапов – теоретического и экспериментального. Теоретический этап исследования посвящен сбору и анализу
литературных данных, свидетельствующих о изучении активности ферментов, участвующих в реакциях метаболизма веществ, относящихся к пуриновым соединениям и влияющих на функции лимфоцитов и эритроцитов, способствующих пониманию отдельных звеньев патогенеза РА и ОА с иммунобиохимических позиций. Эмпирический этап выполнен с применением двух базовых гносеологических методов – научного наблюдения и эксперимента. Задачей научного наблюдения стало изучение активности АДА, АМФДА, АД и 5-НТ в лизатах лимфоцитов и эритроцитов у больных РА и ОА с различной длительностью заболеваний. Планирование и проведение экспериментальной части исследования было основано на принципах биоэтики и качественной клинической практики. Выводы сделаны на основании результатов, полученных в ходе наблюдений и экспериментов и обработанных методами статистики.
Положения, выносимые на защиту
В процессе эволюции заболеваний при РА и ОА в лизатах лимфоцитов и эритроцитов происходят разнонаправленные изменения активности всех изучаемых ферментов с тенденцией к снижению активности большинства энзимов через 10 – 12 лет болезни.
Изученные энзимные показатели крови способствуют дифференциации РА и ОА как на ранних, так и поздних стадиях заболеваний, уточнению степени активности ревматоидного процесса, объективизации оценки эффективности проводимой терапии больных.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обеспечена использованием достаточного числа наблюдений, формированием однородных по клиническим характеристикам групп наблюдения, сравнения и контроля, использованием современных методов лабораторных и инструментальных исследований, а также методов статистической обработки данных. Полученные данные полностью согласуются с опубликованными ранее результатами исследований со сходными целями и задачами. Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВолгГМУ (2011 - 2013 г.г.).
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 4 – в центральной и 9 – в местной печати, в том числе 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных материалов диссертационных исследований.
Больные РА
Метаболизм пуринов занимает ведущее место в синтезе и распаде белков. В процессе многоступенчататых энзимных реакций (рис. 14) образуются пуриновые нуклеотиды (ПН): ИМФ, АТФ, АДФ, АМФ, ГТФ, ГДФ и ГМФ, нуклеозиды: ксантозин: аденозин, гуанозин, инозин и основания: (аденин, гуанин). Они являются биологически активными веществами, обладающими регуляторными функциями и участвующими в контроле обмена нуклеиновых кислот (104, 182).
Биологическая роль ПН достаточно хорошо известна (53, 55, 56). Они принимают участие в синтезе нуклеиновых кислот (НК), входят в структуру коферментов, (54), регулируют сосудистый тонус, пластические процессы (98, 137, 175), участвуют в секреции простагландинов, процессах энергопродукции, свертываемости крови, мембранного транспорта и активации или ингибировании некоторых ферментов (57, 163).
Также важна и роль пуриновых нуклеозидов. Высокий уровень аденозина вызывает ингибицию рибонуклеотидредуктазы, что ведет к замедлению биосинтеза РНК, ДНК и гибели клеток. Особенно чувствительны к высокому содержанию аденозина Т-лимфоциты, которые утрачивают свои специфические функции (180, 193, 217). Низкий уровень аденозина оказывает цитотоксический эффект на лимфоциты, тормозит их пролиферацию, блокирует Т-лимфоциты в G-фазе, а в В-лимфоциты — в S-фазе клеточного цикла, снижает супрессорное действие Т-лимфоцитов (164, 256, 311).
В норме уровень аденозина в клетках низкий (не более 10-6 м), что обеспечивается наличием в клетках мощной системы удаления избытка аденозина с помощью АДА и аденозинкиназы (АДК). АДА участвует в гидролизе аденозина с образованием инозина и аммиака, а АДК фосфорилирует аденозин до АМФ. Сродство АДК к аденозину на порядок выше, чем у АДА. Аденозин в микромолярных концентрациях фосфорилируется в адениннуклеотиды, а в миллимолярных — большей частью дезаминируется (53). Аденозин принимает участие в регуляции различных физиологических функций, взаимодействии клеток иммунной системы, секреторной, нейроэндокринной, мышечной и других систем (60, 61, 67, 85, 157, 158, 180, 193, 217).
За счет аденозина подавляется синтез S-аденозилметионина, что ведет к нарушению метилирования ДНК и процессов пролиферации лимфоцитов (53, 83). Аденозин активирует аденилатциклазу, что способствует накоплению циклического АМФ в клетках и снижению функции лимфоцитов (53). Аденозин принимает участие в регуляции кровотока в коронарных сосудах, замедляет агрегацию тромбоцитов, повышает синтез АТФ в миокарде, оказывает антиадренергическое, антиаритмическое, антигипоксическое и антигипотензивное действие (11, 23, 59, 60, 61, 62). Эндогенный аденозин участвует в регуляции продукции опухолевого некротизирующего фактора (27, 247), секреции различных нейротрансмиттеров, изменяя в нервных клетках уровень ц-АМФ (85, 227, 274, 363). Достаточно важную биологическую роль играет и другой пуриновый нуклеозид — гуанозин, который обладает кардиотоническим, антигипоксическим действием, участвует в синтезе белковых молекул, в качестве посредника во взаимодействии гормонов с рецепторами клеток (77, 83, 158).
Имеются данные о выраженном иммуномодулирующем действии производных гуанозина (154, 413). Гуанозин и его структурные аналоги применяются в фармакологической промышленности для получения антивирусных препаратов (ацикловир, зовиракс, виразол), угнетающих вирусную ДНК-полимеразу и нарушающих синтез ДНК вирусов (76, 135, 464). Еще один нуклеозид - инозин нашел применение в качестве лечебного препарата рибоксина в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Он повышает пролиферацию лимфоцитов, активирует клеточный и гуморальный иммунитет (76).
Недостаточно изучено биологическое значение пуриновых оснований: аденина и гуанина, но наличие их в структуре ДНК свидетельствует об их несомненной важности (105). Доказано, что повышенное содержание аденина способствует снижению трансплантационного иммунитета (76). Синтетические аналоги пуриновых оснований (азатиоприн, 6 меркаптопурин, теобромин) успешно используются в практической медицине (24, 25).
Далее представлены краткие сведения о физико-химических свойствах и биологической роли ферментов, включенных в настоящей работе, участвующих в регуляции концентрации пуриновых метаболитов.
Аденозиндезаминаза (ЕС 3.5.4.4.) — фермент, катализирующий дезаминирование аденозина до инозина и аммиака (14, 104, 112, 233, 398). Он имеет третичную структуру, в активном центре которого имеются атомы цинка, остатки цистеина, гистидина, аспарагиновой кислоты (13, 218, 436).
Оптимум рН реакции: 6,0-8,0 (126, 251, 301, 430). Основные субстраты АДА: аденозин и дезоксиаденозин (122, 251, 367). Имеется большое количество ингибиторов АДА (185, 208, 237, 277, 298, 309, 332, 367, 432, 487), наиболее известными из которых являются этанол, оксазепам, нитразепам, мепробамат, лоразепам, хлордиазепоксид, имипрамин, фенилбутазон, напроксен, теофиллин, рифампицин, лидофлазин, кетотифен, повышенные концентрации гуанозина, инозина, аденина, кортикостерон (219, 262, 264, 430, 449). Активируют энзим: АТФ, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, (86, 87, 124, 251, 279).
Фермент широко распространен в природе. Он обнаружен у млекопитающих (196, 362, 407, 437, 545), птиц (463, 481), бактерий (307, 322, 483, 525), червей, омаров, насекомых, рыб, пресмыкающихся (308, 429, 430). Высокой АДА-активностью обладают быстро пролиферирующие ткани, лимфоидные ткани, селезенка, лимфоузлы, вилочковая железа (56, 122, 140). Активность АДА в 10-20 раз больше в Т-лимфоцитах, чем в В-лимфоцитах, а в процессе созревания Т-лимфоцитов активность АДА повышается (164, 234, 238, 322, 327). В порядке убывания наибольшее содержание АДА у человека определяется в селезенке, затем в кишечнике, печени, почках, сердце, мозге, легких (34, 41, 132, 221). В периферической крови АДА имеется во всех форменных элементах крови с наибольшей активностью в лимфоцитах (467139 нмоль/мг/ч), затем в тромбоцитах (2147,9 нмоль/мг/ч) и в эритроцитах (56,720,5 нмоль/мг/ч) (126).
Фермент преимущественно локализован в цитозоле клетки, и только 2% от его общей активности определяется в плазматических мембранах эритроцитов и тромбоцитов в комплексе с гликопротеидами (88, 229, 241, 263, 340, 421), что позволяет ему участвовать и во внеклеточном превращении аденозина в инозин. Обнаружена также и митохондриальная форма АДА (34, 251).
АДА человека относится к генетически полиморфным ферментам, и его молекулярные формы контролируются двумя аллельными генами, определяемыми в 20-й хромосоме. Аллели обуславливают 3 фенотипа АДА (126, 142, 231).
Изоферменты АДА, содержащиеся в различных клетках и тканях человека, имеют различия по молекулярной массе и некоторым физико-химическим свойствам (34, 142, 235). В тканях с высокой активностью АДА преобладает низкомолекулярная форма энзима и наоборот (179, 467).
Во всех форменных элементах крови преобладает низкомолекулярная форма АДА (164, 423, 431, 467). Высокомолекулярная форма АДА обнаружена в печени, почках, легких, фибробластах кожи и мышцах, (34, 121).
Определение активности АМФ-дезаминазы
HТ относится к классу гидролаз, расщепляющих сложные эфирные связи фосфомоноэстеров (257, 452). Молекула энзима состоит из одной полипептидной цепи из 589 аминокислотных остатков (489). Молекулярная масса фермента варьирует от 60 000 до 120 000 Да. и зависит от источника, из которого был выделен фермент (197, 212). 5-HТ представляет димерную структуру с наличием субъединиц и генетически обусловленных изоформ (198, 280, 285).
В качестве субстратов 5-НТ может использовать более 10 нуклеотидов (362). Оптимальная концентрация субстрата для фермента зависит от природы выделения фермента. Энзим, выделенный из синовиальной жидкости, по сродству фермента к субстратам по степени уменьшения будет выглядеть следующим образом: ЦМФ УМФ д-АМФ=д-ЦМФ=АМФ ИМФ (487). Если же фермент выделен из плаценты человека и его сродство к 5-АМФ принять за 100%, то сродство к другим субстратам представлено следующим образом: ЦМФ — 122%, ГМФ — 68%, ПМФ — 63%, КМФ — 28% (261).
Активность 5-HT зависит от рН среды и источника выделения: для энзима мембран лимфоцитов оптимум рН — 7,5 (360), сердца крысы — рН 9,5 (364), синовиальной жидкости — рН 7,5-9,5 (488).
Ионы двухвалентных металлов в концентрации до 3-4 мкмоль активируют 5-HT, а свыше 5 мкмоль — его ингибируют (365, 488). Активаторами фермента служат ионы марганца, магния, цинка, (290, 461), некоторые цитокины (321), глюкокортикоиды (412), паратиреоидный гормон (435), простагландины Е-2 (157, 224). По поводу влияния АТФ на активность цитозольной 5-HT имеются противоречивые мнения (289, 364, 368). Ингибируют 5-HT инсулин (319), гамма-интерферрон (225), АДФ (362, 488), холестерин (477), этанол, фенобарбитал (225), никель (191), неорганический фосфор (365, 371), ксантиновые производные (266).
При зональном электрофорезе сыворотки крови в агаровом геле получено две изоформы 5-HT (226, 299), на ацетатцеллюлозе — три фракции (374), в полиакриламидном геле - также три фракции, обладающие 5-HT активностью: одна большая и две маленькие фракции (362).
Различают две формы 5-НТ: цитозольную (эндо-5-НТ) и мембрано-связанную (экто-5-НТ), которая размещена на внешней клеточной плазматической мембране (191, 250, 348). Обе формы имеют одинаковое сродство к 5-АМФ и 5-ГМФ (289, 336). В синовиальной жидкости две трети 5-НТ находятся в цитозольной форме, а одна треть — в виде экто-5-НТ (488). В плазме крови преобладает экто-5-НТ (58).
Активность 5-НТ обнаружена в печени (312, 425, 475), сердце (317, 357, 372), простате (428), мозге (196, 254, 328), селезенке и тимусе (246), костях, суставном хряще (466), синовии (269), ретикулоэндотелиальной ткани (453), эндотелии кровеносных и лимфатических сосудов (90, 311, 342),
Данные о количественном содержании 5-НТ в различных органах и тканях противоречивы (271, 311). Это обусловлено как видовым различием животных, так и методическими подходами. 5-НТ, выделенная из различных тканей, имеет свои специфические особенности, и для определения ее активности требуются различные условия: вид буфера, субстраты, активаторы и т.д. (364, 486). Из этого следует, что если определять активность 5-НТ в экстрактах тканей из различных органов в одной и той же инкубационной среде, то невозможно получить истинное представление об органном распределении энзима.
Учитывая специфику 5-НТ, у человека выявлено следующее распределение активности энзима в процентном соотношении: простата — 80%, гипофиз — 21,2%, щитовидная железа — 4,8%, печень — 0,9%, почки — 1,5%, мозг – 1,3%.(44). Активность 5-НТ у человека в В-лимфоцитах выше, чем в Т-лимфоцитах, а в незрелых клетках ниже, чем в зрелых (215, 267).
Имеются данные о содержании 5-НТ в тканях крыс: сердце — 100%, легкие — 84%, почки — 65%, печень — 61%, мозг — 34%, скелетные мышцы — 20% (51). В сердце крыс активность 5-НТ в 5 раз выше, чем у человека (455). В тканях птиц максимальная активность 5-НТ выявляется в селезенке (425) и наибольшее содержание 5-НТ определяется в ядре клетки (317, 463, 468).
Более всего изучена роль 5-НТ в реакции по превращению АМФ в аденозин, который оказывает разнообразные воздействия на многие функции организма. За счет регуляции аденозина в крови 5-НТ влияет на тонус кровеносных сосудов и содержание кислорода в тканях (316, 352, 420). Установлена роль 5-НТ в регуляции свертываемости крови, катаболизме белка, нейромедиаторной деятельности (207, 265, 414). Предотвращение избытка аденозина достигается снижением концентрации АМФ ниже константы Михаэлиса для 5-НТ. Энзим способствует поступлению нуклеотидов в клетку, участвует в регуляции энергетического заряда клетки, созревании лимфоцитов, иммунном статусе (194, 200, 225, 356, 460).
Определение активности 5-НТ с субстратом АМФ затруднено наличием в биологических средах щелочной фосфатазы (ЩФ), которая также использует АМФ в качестве субстрата, что вынуждает искать различные методические подходы для нивелирования влияния ЩФ (192, 205, 484).
Методы определения активности 5-НТ можно условно разделить на три группы: 1. По определению продуктов дефосфорилирования АМФ. 2. По содержанию неорганического фосфора при реакции с солями молибдена. 3. По определению содержания аммиака, высвобождающегося после дезаминирования аденозина. Методы первой группы просты в исполнении, но имеются трудности в подборе оптимальных концентраций субстрата (239, 310).
Методы второй группы базируются на окрашивании неорганического фосфора в реакции с молибдатом аммония и оценке интенсивности этой окраски (422, 482).
Методы третьей группы основываются на определении свободного аммиака, образующегося в ходе катализируемой реакции. Для этого необходимо введение в инкубационную среду дополнительного фермента — аденозиндезаминазы (АДА) (205, 400). Эти методы очень чувствительные и позволяют определять активность 5-НТ в 20 мкл сыворотки с точностью до 0,0005 МЕ/мин (394).
Энзимные исследования у больных РРА с II степенью активности процесса
Диагностика РРА проводилась на основании диагностических и классификационных критериев, разработанных совместно Американской коллегией ревматологов (ACR) и Европейской антиревматической лигой (EULAR) в 2010 году (186), исходя из 10-ти бальной системы, где для постановки диагноза РРА требуется не менее 6 баллов.
Основными критериями включения больных в исследование были: информированное согласие, наличие не менее 6 баллов по критериям ACR/EULAR-2010 (78) длительность заболевания не более 12 месяцев, не менее чем 1 стадия поражения суставов по Штейнброккеру возраст больных 19-65 лет.
Группу составили 55 больных, из которых 40 (72,7%) женщин и 15 (27,3%) мужчин. В исследования не входили больные с сопутствующими внутренними болезнями с функциональными нарушениями, злокачественными новообразованиями, лица, злоупотребляющими алкоголем. Возраст больных колебался от 42 лет до 55 лет. Средний возраст – 48,1 ± 0,4 (=3,2), медиана – 48,0 лет. Возраст мужчин – 47,3 ± 0,7 (=2,6), медиана – 47,0 лет. Возраст женщин – 48,4 ± 0,5 (=3,4), медиана – 48,0 лет. Средняя продолжительность заболевания – 5,35 ± 0,38 (=2,8), медиана – 4,0 месяцев, с колебаниями от 2 до 11 месяцев.
I стадия поражения суставов определялась у 36 (65,5%) больных, II стадия – у 19 (34,5%). Функциональная недостаточность суставов или функциональный класс (ФК) I степени (ФК-1) установлен у 9 (16,4%), ФК-2- у 23 (41,8%) и ФК-3 – у 23 (41,8%) больных. Серопозитивный (по РФ) вариант выявлен у 35 (63,6%) больных. Преимущественно суставная форма определялась у 49 (89,1%) больных, с системными поражениями – у 6 (10,9%) больных. Отмечено преобладание полиартрита (78,2%).
Сумма баллов по критериям ACR/EULAR составила 7,09 ± 0,12 (=0,87), медиана - 7,0 баллов.
Активность ревматоидного процесса оценилась по индексу DAS 28, рекомендованному EUlAR (471) и ассоциацией ревматологов России (117).
I (минимальная) степень активности процесса определялась у 12 больных (21,8%), среди которых 8 (66,7%) женщин и 4 (33,3%) мужчин. Средний возраст мужчин – 50,5 ± 0,6 (=1,3), медиана – 50,5 лет, женщин – 52,8 ± 0,6 (=1,7), медиана – 53,0 лет, всей группы – 52,0 ± 0,5 (=1,9), медиана – 52,0 лет. Продолжительность болезни у мужчин – 9,5 ± 0,3 (=0,6), медиана – 9,5 месяцев, всей группы – 9,42 ± 0,3 (=1,2), медиана -9,5 месяцев. Индекс DAS 28(3) составил 2,93±0,04 (=0,14), медиана-2,9 баллов. Сумма баллов по критериям ACR/EULAR – 6.5±0.19 (=0.67), медиана-6,0 баллов.
По длительности заболевания были сформированы 2 группы. 1-ю группу с длительностью заболевания 7 – 9 месяцев составили 6 больных, из которых 4 женщины и 2 мужчин. Средний возраст больных – 51,3 ± 0,67 (=1,63), медиана 51,5 лет, средняя продолжительность болезни – 8,5 ± 0,34 (=0,84), медиана – 9 месяцев. 2-ю группу с длительностью заболевания 10 – 11 месяцев составили 6 больных, из которых 2 мужчин и 4 женщины. Средний возраст больных – 52,5 ± 0,76 (=1,87), медиана – 52,5 лет, средняя длительность болезни – 10,33 ± 0,21 (=0,52), медиана – 10 месяцев.
У всех больных определялась суставная форма, полиартрит – у 8 (66,7%) больных, олигоартрит – у 4 (33,3%) больных, серопозитивный вариант – у 6 (50%) больных. I стадия поражения суставов выявлена у 9 (75%) больных, II стадия – у 3 (25%) больных, ФК-1 – у 9 (75%), ФК-2 – у 3 (25%) больных. Индекс DAS 28 составил 2,93 ± 0,04 (=0,14), медиана – 2,9 баллов.
II (умеренная) степень активности процесса была представлена 25 (45,5%) больными, из которых 6 (24%) мужчин и 19 (76%) женщин. Средний возраст мужчин – 47,5 ± 0,4 (=1,0) лет, медиана – 47,5 лет, женщин – 48,9 ± 0,5 (=2,4), медиана – 49,0 лет, всей группы – 48,6 ± 0,4 (=2,2), медиана – 48,0 лет. Длительность болезни у мужчин – 4,33 ± 1,0 (=2,5), медиана – 3,5 месяцев, у женщин – 5,1 ± 0,4 (=1,9), медиана – 5,0 месяцев, всей группы – 4,88 ± 0,4 (=2,0), медиана – 5,0 месяцев. Сумма баллов по критериям ACR/EULAR - 7,0±0,14 (=0,71), медиана - 7,0 баллов.
По длительности заболевания были сформированы 2 группы больных. В 1-ю группу с длительностью болезни 2 – 4 месяца вошли 12 больных, из которых 4 мужчин и 8 женщин. Средний возраст больных – 47,9 ± 0,63 (=2,19), медиана – 48,0 лет, средняя длительность заболевания – 3,33 ± 0,22 (=0,78), медиана - 3,5 месяцев.
2-ю группу с длительностью болезни 5 – 10 месяцев составили 13 больных, из которых 2 мужчин и 11 женщин. Средний возраст больных – 49,2 ± 0,58 (=2,09), медиана – 50 лет, средняя длительность болезни – 6,3 ± 0,47 (=1,70), медиана – 6,0 месяцев.
Серопозитивный вариант отмечен у 16 (64%) больных, суставная форма – у 22 (88%), полиартрит – у 20 (80%), олигоартрит – у 5 (20%). I стадия поражения суставов определялась у 17 (68%), II стадия - у 8 (32%) больных, ФК-2 - у 16 (64%), ФК-3 - у 9 (36%) больных.
Индекс DAS 28(3) при поступлении- 4,2±0,1 (=0,5), медиана-4,2 баллов.
III степень (высокая) активности установлена у 18 больных, из которых 5 (27,8%) мужчин и 13 (72,2%) женщин. Средний возраст мужчин - 44,4 ± 0,2 (=0,5), медиана - 44,0 лет, женщин - 45,0 ± 0,5 (=1,6), медиана - 45,0 лет. Длительность болезни у мужчин - 3,2 ± 0,4 (=0,8), медиана - 3,0 месяцев, женщин - 3,3 ± 0,4 (=1,4), медиана - 3,0 месяцев. Сумма баллов по критериям ACR/ EULAR - 7,61 ± 0,22 (= 0,92), медиана- 8,0 баллов.
По длительности болезни были сформированы 2 группы больных. 1-я группа состояла из 6 человек, из которых 1 мужчина и 5 женщин, с длительностью болезни 1,5 - 2 месяца. Средний возраст больных 44,3 ± 0,42 (=1,03), медиана - 44 года, средняя продолжительность заболевания - 1,67 ± 0,21 (=0,52), медиана - 2 месяца.
Во 2-ю группу с длительностью болезни 3 - 6 месяцев вошли 12 больных, из которых 4 мужчины и 8 женщин. Средний возраст больных -44,9 ± 0,48 (=1,68), медиана 45,0 лет, средняя длительность болезни - 3,83 ± 0,27 (=0,94), медиана - 4,0 месяца.
Энзимные исследования у больных РОА без синовита
Особое место занимает III степень активности ревматоидного процесса, где значительно выражен воспалительный компонент, но, тем не менее, активность АДА снижена как у больных РА, так и РРА, хотя АДА-тест считается показателем воспаления при многих воспалительных заболеваниях. Этот парадокс при III степени можно объяснить суммарным воздействием вышеупомянутых факторов, влияющих на снижение активности ферментов и не полностью задействованных при I – II степенях активности: закислением рН среды, избытком супероксидных и других свободных радикалов, провоспалительных цитокинов, повышенным содержанием инозина, гуанозина, аденина и других ингибиторов АДА. Эти причинные факторы вполне устранимы, и при эффективной терапии больных РА активность АДА восстанавливается до нормальных параметров, что исключает генетические поражения молекулы АДА при РА.
В данном разделе мы уделили больше внимания анализу энзимной активности в лимфоцитах, так как они имеют непосредственное отношение к иммунной регуляции в организме человека. Тем не менее, выраженные изменения активности энзимов были выявлены и в эритроцитах больных РА. Причем, энзимные изменения в лимфоцитах и эритроцитах имели как некоторую сходность, так и отдельные различия. Так, у больных РРА в лимфоцитах и эритроцитах повышенные активности АДА, АМФДА, 5 -НТ, но в лимфоцитах активность АД снижена, а в эритроцитах – повышена.
У больных РА в лимфоцитах и эритроцитах повышены активности АМФДА и 5 -НТ, но в лимфоцитах активность АДА и АД снижена, а в эритроцитах повышена.
Эти энзимные различия, вероятно, обусловлены функциональными особенностями лимфоцитов и эритроцитов. Тем не менее, выраженные изменения активности энзимов ПМ в эритроцитах, выявленные нами у больных РА, могут привести к нарушению функциональных свойств клеток, 190 нарушить транспорт кислорода, вызвать ускоренный апоптоз клеток. Кроме того, имеются данные о том, что сниженная активность АДА в эритроцитах ведет к иммунорегуляторным нарушениям (222, 294). Последствия повышенной активности АДА в эритроцитах неизвестны, но определение активности АДА и других ферментов при РА имеют определенное значение в диагностическом аспекте, оценке тяжести заболевания и контроля эффективности проводимой терапии.
Под наблюдением находились 57 больных РОА. При поступлении на лечение, по сравнению со здоровыми, в лимфоцитах выше активность АД (р 0,001), в эритроцитах выше активность АДА (р=0,004), АМФДА (р=0,038), АД (р=0,037).
Через 7 – 8 дней лечения существенной положительной динамики энзимных показателей не отмечалось, и только наблюдалась тенденция к снижению активности всех энзимов в обеих биологических средах.
По окончании лечения произошла положительная статистически значимая динамика всех энзимных показателей, и только активность АД в лимфоцитах осталась повышенной, а активности других энзимов не имели отличий от здоровых в обеих биосредах.
Конечно, по анализу энзимных показателей у больных РОА всей группы нет возможности дать объективное заключение по динамике изменений энзимной активности в процессе лечения, так как индивидуальные особенности больных значительно влияют на энзимные показатели. Поэтому проведенный анализ дает лишь ориентировочное представление, и только анализ энзимной активности с учетом клинических особенностей болезни имеет важное практическое значение.
Так, у больных РОА с полиостеоартрозом, по сравнению с больными с моно-олигоартрозом, в лимфоцитах выше активность АМФДА, АД, 5 -НТ и ниже АДА, в эритроцитах выше активность всех ферментов.
При I стадии, по сравнению с II стадией, в лимфоцитах выше активность АДА, ниже активность АМФДА, АД и 5 -НТ, в эритроцитах ниже 191 активность всех ферментов. У больных с ФК-1, по сравнению с ФК-2, в лимфоцитах выше активность АДА, ниже АМФДА, АД и 5 -НТ, в эритроцитах ниже активность всех ферментов. Анализируя вышеприведенные результаты, можно выявить определенную закономерность: чем тяжелее клиническое состояние больных, сопровождающееся полиартрозом, более высокой стадией поражения и ФК суставов, тем в лимфоцитах ниже активность АДА, выше активность АМФДА, АД и 5 -НТ, а в эритроцитах выше активность всех ферментов.
В процессе исследований выявлено значительное влияние на энзимные показатели крови синовита в пораженных суставах. Если у больных РОА без синовита не выявлено статистически значимых энзимных различий по сравнению со здоровыми, то у больных РОА с синовитом, по сравнению со здоровыми, в лимфоцитах выше активность 5 -НТ и АД, в эритроцитах выше активность всех ферментов, а по сравнению с больными без синовита, и в эритроцитах, и в лимфоцитах выше активность всех ферментов. Сравнительные исследования у больных РОА с синовитом, стадией I и ФК-1, по сравнению с больными РОА без синовита, стадией II и ФК-2, показали, что влияние синовита на энзимные показатели значительно больше, чем стадии и ФК суставов.
У больных с синовитом наиболее чувствительными энзимными показателями, реагирующими на изменения клинического состояния больных в первые 7 – 8 дней лечения, были показатели активности АД в лимфоцитах и эритроцитах. Причем, и по окончании курса лечения активность АД в лимфоцитах осталась повышенной, а активность других энзимов не имела отличий от здоровых.
У больных РОА без синовита через 7 – 8 дней лечения статистически значимой динамики энзимных показателей не отмечалось, что можно объяснить незначительными изменениями энзимной активности при поступлении. Но по окончании курса лечения в эритроцитах снизилась 192 активность АДА и АМФДА, и все энзимные показатели в лимфоцитах и эритроцитах не имели отличий от здоровых.
Анализ энзимной активности больных РОА с синовитом в зависимости от длительности заболевания показал, что у больных РОА с длительностью болезни 12 – 23 месяца, по сравнению с больными РОА с синовитом и длительностью болезни 3 – 11 месяцев, в лимфоцитах ниже активность АДА, АМФДА, АД и 5 -НТ, в эритроцитах также ниже активность всех энзимов.
У больных РОА без синовита и с длительностью болезни 12 – 23 месяца, по сравнению с больными РОА без синовита и длительностью болезни 3 – 11 месяцев, в лимфоцитах ниже активность АДА и АД, в эритроцитах ниже активность АДА, АД и АМФДА.
Если же сравнивать группы больных РОА без учета наличия синовита, то у больных с длительностью болезни 12 – 23 месяца, по сравнению с больными РОА с длительностью болезни 3 – 11 месяцев, то в лимфоцитах ниже активность АДА, АМФДА и 5 -НТ, в эритроцитах ниже активность АДА, АМФДА, АД и 5 -НТ.
Повышенную активность энзимов в обеих биосредах у больных РОА с синовитом можно объяснить воспалительным процессом в пораженных суставах, так как, практически, любое воспаление сопровождается ускорением отдельных метаболических реакций в клетках тканей. У больных РОА без синовита воспалительный процесс, вероятно, имеет меньшую интенсивность, клинически маловыраженную, и поэтому активность энзимов также повышается, но не столь значительно и находится на верхних границах нормы, не превышая ее.
