Введение к работе
Актуальность_темы.Решение фундаментальных проблем биологии, таких как нормальный и злокачественный рост, связано с изучением стимулированной пролиферации клеток. В настоящее время установлено, что у взрослых животных в некоторых тканях и органах большинство дифференцированных клеток находится в состоянии покоя, переход к активной пролиферации наблюдается ігри неоплазми или компенсаторном росте органов (Епифанова, 1983). Типичным примером являются клетки печени половозрелых особей, которые характеризуются .крайне низкой величиной митотического индекса; одновременно в митозе находится один ге-патоцит из 10-20 тыс. клеток (Bucher, І97І).При вирусном гепатите, циррозах, гепатотоксических реакциях'и обширных некрозах печени гибель клеток и уменьшение массы органа стимулирует пролиферацию гепэ-тоцитов. Переход части клеток паренхимы из состояния покоя в митоти-ческий цикл также может быть адаптивным ответом на присутствие в составе пищи гексахлорбензена и хлорорганических инсектицидов, которые вызывают минимальную гибель гепатоцитов (Short, 1972; Pausto, 1989).
Известно, что длительная и/или интенсивная физиологическая или репаративная регенерация органов увеличивает риск образования опухолей (Акоев.1988). Исследования In vitro и In vivo показали,что ионизирующее излучение обладает канцерогенним эффектом (Coglle, 1985). Сопоставление с данными по химическому гепатоканцерогенезу, который изучен лучше радиационного, позволяет, предположить, что при сочетаний стимулированной пролиферации и воздействия радиации вероятность реализации опухолевой трансформации клеток паренхимы печени возрастает.
Исследования проблемы регуляции пролиферации облученных и/или трансформированных клеток,по-видимому, целесообразно проводить в два этапа. Во-первых,необходимо выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе пострадиационных нарушений пролиферации гепатоцитов. В свя-
-4--зи с этим особый интерес вызывает изучение влияния радиации на экспрессию "клеточный цикл-зависимых" генов, т.е. генов, которые активируются после воздействия пролиферативпого стимула на покоящиеся клетки (Baserga, 1985).
Удобной моделью для исследования клеточных и молекулярных процессов in vivo является регенерирующая печень крыс. В ответ на удаление 2/3 печени значительная часть покоящихся гепатоцитов синхронно переходит к пролиферации (Grlsham, 1962; Fabrlcant, 1969; Терских, 1973).Воздействие радиации приводит к изменению стимулированной пролиферации клеток паренхимы. Основной эффект заключается в пострадиационном удлинении всех стадий клеточного цикла.Продолжительность задержки перехода гепатоцитов из одного периода цикла в другой зависит от дозы излучения и момента воздействия. После снятия блока' клетки относительно синхронно возобновляют прерванную пролиферацию (Сидорова, 1966; Окада, 1974; Полищук, 1986).
Результаты экспериментов по определению радиочувствительности. биосинтеза разных типов РНК в клетках регенерирующей печени показали, что ионизирующее излучение преимущественно воздействует на экспрессию генов, активирующихся после операции (Магсоу, 1975; Комар, 1980). Проблема избирательного действия радиации на гены до сих пор остается.нерешенной. Возникает вопрос - в какой степени пострадиаци-онная регїляїщвкспрессш индивидуальных.'генов зависит от их функций в клетке и от состояния генома в момент облучения. Для изучения этого вопроса необходимо исследовать влияние радиации на экспрессию
,. .-' ' . , - :' /
различных в функциональном отношении групп генов:протоонкогенов; генов, кодирующих ферменты, белки цитоскелета, белки-регуляторы пролиферации, секреторные белки и. т.д.. Согласно данным литературы, в печени после частичной генатэкгомш активация экспрессии' генов связана со стимулированной пролиферацией клеток или с реакцией "острой фазы" (Sobczak, 1986; Schreiber,. 1987). По-видимому, индукция экспрессии
- 5 - ' этих генов происходит в разных гопуляцих клеток: пролиферирующих и покоящихся (Епифанова, 1983). При планировании наших исследовагаїй мы остановили свой выбор на следующих генах, связанных с пролиферацией клеток: протоонкогены c-fos и с-На-газ, т.к. экспрессия этих генов является "клеточный цикл-зависимой", а их белковые продукты, по-видимому, принимают участие в регуляции пролиферации (Ferainlsco, 1984; Wilson, 1988); гены, кодирующие'Gs- и О^-белки, которые регулируют активность эденилат циклазн, передавая сигнал от рецепторов плазматической мембраны (Gilman, 1987); пируват киназу Ь-тшта - основной фермент гликолиза в клетках печени взрослых животных, катализирует реакцию превращения фосфоенолпирувата в пируват с образованием АТФ .(Cognet, 1987);- NatK+-AT4>a3y - ассоциированный с плазматической мембраной фермент, ответственный за активный транспорт ионов На+и К+ (Неггега, 1987). В группу генов, белковые продукты которых сокрети-руются клетками паренхимы печени, вошли: с^-макроглобулин - типичный белок "острой фазы" (Sohreiber,1987); сывороточный альбумин - основной белок плазмы крови взрослых животных и а-фэтопротеин - его аналог у эмбрионов (Selem, 1984)..
Исходя из представлений о радикальном изменении метаболизма клеток при переходе из состояния покоя к пролиферации (Епифанова, 1983), можно предположить, что пострадиационные изменения экспрессии генов будут существенно различаться при облучении в фазе Ga или в одном иа периодов митотического цикла.
Ц&лью работы явилось изучение влияния рентгеновского облучения (в дозе 5 Гр) на экспрессию "клеточный цикл-зависимых" и "клеточный цикл-независимых" генов в регенерирующей печени крыс при воздействии радиацией на гепатоциты, находящиеся в состоянии покоя (Gq) или в середине пререпликативного периода (G-г).
Исходя из этого были поставлены следующие задачи: I. Исследовать вступление в S-период клеток печени на ранних сроках
после удалвішя 2/3 органа в норме и после Облучения на стадиях G0 и Gt. Выявить пострадиационные нарушения пролиферации гепатоцитов в используемой экспериментальной модели.
2, Изучить динамику изменения экспрессии генов, связанных с проли
ферацией гепатоцитов: протоонкогенов с-Юэ и с-На-газ и генов, коди
рующих Ыа" 1"К+-АТФязу, нируваї киназу, G-белки, на ранней стадии реге
нерации, печени в норме и после облучения на стадиях GQ и Gj шюточ-г
ного цикла. Исследовать возможную взаимосвязь между пострадиационны
ми изменениями экспрессии "клеточный цикл-зависимых" генов и наруше
ниями пролиферации клеток паренхимы печени.
3. Изучить экспрессию генов, белковые продукты которых секретируют-
ся гепатоцитами: сывороточный альбумин, а-фбтопротеин и ад-макрогло
булин, на ранней стадии регенерации печени в норме и при двух выб-
рашшх схемах облучения. Определить общие закономерности и индивиду
альные особенности регуляции экспрессии клеточных генов в гепатоци-
тах регенерирующей печени крыс после облучения. '. . '
ИХчная_ндвизна. Впервые проведен анализ влияния рентгеновского облучения на экспрессию лрогоонкогенов e-fos, c-Ha-ras и генов, кодирующих а-субъединицу NatK+-AT*a3H, ішруват киназу L-типа,. «-субъ-едшшцу G|- и Gg-6ojmoB, сывороточный альбумин и о^-макроглобулин, в клетках регенерируыцей печени. Установлено, что после.облучения уровень экспрессии изученных генов в гепатоцитах регенерирующей печени снижен по .сравнению: с контролем. Ингибирущее действие радиации .на экспрессию генов проявляется сильнее при облучении на стадии Gj, чем на стадии GQ. Иеклйчением из этого общего правила'являются три гена, для которых обнаружено превышение уровня экспрессии над контролем при'облучении в'С0-периоде клеточного цикла гелатоцигов (c-fos.c-Ha-гав) и при облучении в Gj-гюриоде (ген пируват киназы L-типа).Усиление экспрессии этих генов совпадает но времени'с задержкой перехода. G0/Gj для c-foa И Gj/S для с-На-гая, пируват кинааы. По-видимому,
.-7-
активация экспрессии этих генов необходима для снятия пострадиацион
ного блока пролиферации гепатоцитов. Полученные данные об изменениях
экспрессии изученных генов в гепатоцитах регенерирующей печени крыс
после облучения свидетельствуют об отсутствий общего пострадиацион
ного механизма регуляции уровня транскриптов. Регуляция экспрессии
каждого гена осуществляется индивидуальным образом. *
Научно-практическая значимость. Исследование относится к раз
ряду теоретических работ.Полученные данные.об экспрессии генов в ге
патоцитах регенерирующей печени, облученных'на стадиях G0 и Gj, на
ряду с данными о.нарушениях пролиферации расширяют и углубляют пред
ставления о молекулярных событиях, связанных с пострадиационной ре
гуляцией клеточного цикла. Сведения об активации экспрессии c-foa и
с-На-газ в облученных гепатоцитах представляют интерес для последую
щих исследований радиационного геггатокэнцерогенеза.
Фрма_внедрвиия. Работа проведена в рамках планових заданий ВДИРРК МЗ СССР по программе 0.74.05 "Молекулярная биология и молекулярная генетика медицине" (постановление ГК.НТ СССР, Госплана СССР и президиума АН СССР № 492/245/146 от 8.12.81). Номер государственной регистрации темы 01860049367.
АОКбЭЦ!!я_работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной школе-семинаре "Современные проблемы радиационной медицины" (Киев-Канев* 1983), на научном заседании Ленинградского общества рентгенологов и радиологов (Ленинград, 1989), нэ I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
?ЇЕЇЇТ1Е9_и_дбьем_дйссертац. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на /«^страницах машинописного текста, иллюстрированна 17 рисунками и-фотографиями. Указатель лите-
- 8 -ратуры содержит fflty ссылок на публикации отечественных и'зарубежных авторов.
