Содержание к диссертации
Введение 8
Глава I. Обзор литературы 14
1.1. Причины, определяющие актуальность исследования генных
мутаций в соматических клетках человека, с 14
радиобиологической точки зрения
Различие механизмов формирования генных и 15 структурных мутаций в близкие сроки после радиационного воздействия
Индукция нестабильности генома потомков 21
облученных клеток
1.1.3. Ключевая роль генных и структурных мутаций в 31
радиационно-индуцированном канцерогенезе
1.2. Возможности и перспективы изучения мутагенеза в 38
соматических клетках человека на уровне отдельных генных
локусов
HPRT-тест 41
HLA-тест 43
TCR-тест 44
Принцип метода определения TCR- 45 мутантных лимфоцитов
Результаты оценки частоты TCR-мутантных 49 клеток в группах контрольных и облученных
лиц
1.2.4. GPA-тест 56
Принцип и различные способы определения 56 мутантных по локусу гликофорина А клеток.
Частота GPA-мутантных клеток у 63 контрольных доноров
Влияние радиационного воздействия разной 66 интенсивности на частоту GPA-мутантных
клеток
1.2.5. Hb-тест 72
1.3. Практическое значение исследования генных мутаций в 75
соматических клетках облученных лиц
Оценка количества клеток с генными мутациями как 75 метод биологической дозиметрии
Увеличение уровня соматического мутагенеза как 81 показатель повышенного канцерогенного риска
* 1.4. Эффективность апоптотической гибели поврежденных клеток 86
- важный фактор, определяющий количество мутантных
клеток
Апоптоз и его роль в поддержании генетической 87 стабильности клеточных популяций
Вариабельность индивидуального уровня 97 апоптотической гибели клеток человека после повреждающего воздействия
Глава II. Материалы и методы 102
2.1. Характеристика групп исследования показателей 102
соматического мутагенеза
2.1.2. Группы лиц, обследованных с помощью GPA- теста... 102 2.1.2. Группы лиц, обследованных с помощью TCR- теста.... 108
2.2. Подготовка проточного цитометра к анализу и сортировке 115
клеток
2.3. Методика определения частоты GPA-вариантных клеток 115
Процедура фиксации и окрашивания клеток 115
Предварительная работа по приготовлению меченных 120 антител к разным формам гликофорина А
Определение частоты TCR-мутантных клеток 123
Методы определения радиационно-индуцированного 123 апоптоза лимфоцитов
Определение доли клеток с гиподиплоидным 126 содержанием ДНК
Определение доли клеток, связывающих аннексии V, 128 в разных субпопуляциях лимфоцитов
Морфологический анализ апоптоза 129
2.6. Определение субпопуляционного состава лимфоцитов 130
2.7. Статистический анализ 131
Глава III. Результаты исследования 132
3.1. Анализ частоты мутантных клеток в группах контрольных 132
необлученных лиц
3.1.1. Воспроизводимость результатов многократного 132
определения изучаемых показателей
Частота TCR-мутантных клеток у контрольных лиц 133 разного возраста, пола и образа жизни
Влияние возраста на частоту GPA-мутантных клеток с 137 разным фенотипом
Зависимость частоты GPA-мутантных клеток от дозы 138
облучения
Частота N0- и NN-вариантных клеток у лиц, 138 подвергшихся острому облучению в разных дозах
Увеличение частоты GPA-мутантных клеток в 139 зависимости от дозы пролонгированного воздействия.
Сопоставление частоты TCR-мутантных клеток с дозой в 145
разные сроки после облучения
Влияние внешнего облучения на частоту лимфоцитов 145 мутантных по TCR-локусу
Частота TCR-мутантных клеток после смешанного 147 внешнего и внутреннего радиационного воздействия в различных дозах
Оценка эффектов действия ионизирующего излучения в 150
малых дозах на частоту клеток с генными мутациями
Частота GPA-мутантных клеток после радиационного 150 воздействия в малых дозах
Повышение частоты TCR-мутантных клеток у лиц, 154 подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах
Результаты обследования ликвидаторов 155 аварии на ЧАЭС через 9-17 лет облучения ...
Результаты обследования жителей 160 загрязненных радионуклидами территорий...
Оценка влияния возраста при радиационном 162 воздействии в малых дозах на частоту TCR-мутантных клеток
Сравнительное исследование частоты мутантных клеток у 165
пациентов со злокачественными, доброкачественными
новообразованиями и здоровых лиц
Сравнительный анализ данных, полученных при 171
одновременном использовании GPA- и TCR-методов
Исследование апоптотической элиминации поврежденных 177
лимфоцитов и влияния этого процесса на количество TCR-
мутантных клеток
3.7.1. Гибель лимфоцитов путем апоптоза после гамма- 178
облучения in vitro
Подбор оптимальных условий исследования 178 апоптотической гибели с помощью метода проточной цитометрии
Зависимость апоптотической гибели 181 лимфоцитов от дозы облучения in vitro у
контрольных доноров
3.7.1.3. Отсутствие влияния субпопуляционного 183
состава лимфоцитов на
радиочувствительность в отношении
апоптоза
3.7.1.4. Уровень апоптотической гибели лимфоцитов 187
после облучения in vitro у ликвидаторов
аварии на ЧАЭС в сравнении с
контрольными лицами
3.7.2. Сопоставление уровня радиационно-индуцированного 188
апоптоза лимфоцитов и частоты TCR-мутантных
клеток
Глава IV. Обсуждение результатов исследования 190
Частота мутантных клеток в контрольной группе 190
Количество радиационно-индуцированных мутаций в разных 194 локусах в зависимости от дозы, мощности дозы и сроков радиационного воздействия
4.2.1. Зависимость «доза-эффект» в отношении GPA- 194
мутантных клеток при остром и пролонгированном
облучении
Анализ частоты TCR-мутантных клеток после 198 радиационного воздействия
Возможности использования методов определения 201 TCR- и GPA-мутантных клеток в целях биологической дозиметрии
4.3. Влияние ионизирующего излучения в малых дозах на 204
показатели соматического мутагенеза в отдельных генных
локусах
4.3.1. Повышение частоты TCR-мутантных клеток у 205 облученных в малых дозах лиц как следствие радиационно-индуцированной нестабильности генома
% 4.3.2. Отсутствие признаков генетической нестабильности в 212
кроветворных клетках стволового типа по данным GPA-обследования лиц, облученных в малых
дозах
4.3.3. Закономерности проявления генетической 214
нестабильности после радиационного воздействия в
малых дозах
Заключение по результатам одновременного определения 221 частоты клеток с разными вариантными фенотипами
Высокая частота мутантных клеток как показатель 224 повышенного риска возникновения онкологических заболеваний
Анализ апоптотической элиминации поврежденных in vitro 230 клеток в группах контрольных лиц и ликвидаторов аварии на ЧАЭС
Заключение 235
Выводы 240
Список литературы 242
Список использованных сокращений
ГНЦ ФЭИ -Государственный научный центр Физико-энергетический
институт
ИП -йодистый пропидий
РГМДР -Российский государственный медико-дозиметрический регистр
ФИТЦ -флуоресцеинизотиоционат
ЭПР -электронный парамагнитный резонанс
BDIS - Becton Dickinson Immunocytometry Systems
CD - claster of differentiation (кластер дифференцировки)
FISH -fluorescence in situ hybridisation (флуоресцентная
in situ гибридизация)
GPA -glycophorin А (гликофорин A)
Hb -hemoglobin (гемоглобин)
HLA -human leukocyte antigen (человеческий лейкоцитарный антиген)
HPRT - hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (гипоксантин
гуанин фосфорибозилтрансфераза)
TCR -T- cell receptor (T- клеточный рецептор)
UNSCEAR - United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic
Radiation
Введение к работе
Достигнутые в прошлом веке успехи в изучении радиационно-индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека in vivo были сделаны, главным образом, благодаря анализу структурных мутаций в лимфоцитах периферической крови. За более чем 40-летний период использования цитогенетических методов определения хромосомных аберраций накоплен огромный массив данных о закономерностях индукции этих мутаций в разнообразных радиационных ситуациях и их последующей элиминации. Генные мутации исследованы в этом отношении несравненно хуже, что было связано, прежде всего, с отсутствием надежных и удобных методов их определения. В то же время изучение генных мутаций представляется весьма актуальным для радиобиологии и радиационной медицины в силу, по крайней мере, нескольких причин.
Во-первых, существуют известные различия в механизмах формирования генных и структурных мутаций, о чем свидетельствуют многочисленные данные об индукции и репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках разнообразных биологических объектов in vivo и in vitro. Поэтому наши представления о соматическом мутагенезе вообще, и радиационном в частности, были бы неполны без знания радиобиологических закономерностей возникновения и элиминации генных мутаций.
Во-вторых, анализ генных мутаций делает возможными регистрацию и количественную оценку небольших по размеру изменений ДНК. Исследование именно таких мутаций приобретает в последнее время все большее значение в связи с обнаружением феномена нестабильности генома у потомков облученных клеток, которая характеризуется, главным образом, небольшими по размеру изменениями ДНК в отличие от мутаций, обусловленных непосредственным действием радиации. При этом следует
9 отметить, что возможное проявление этого феномена на генном уровне при облучении человека практически не исследовано.
В-третьих, механизмы и уровень мутагенеза в клетках с разной степенью дифференцировки, вероятно, отличаются, как можно полагать на основании немногочисленных пока исследований процессов репарации радиационных повреждений ДНК и апоптотической гибели в клетках стволового типа. Существующие в настоящее время методы клеточной и молекулярной биологии позволяют провести раздельный анализ генных мутаций в высоко-и низко дифференцированных клетках и тем самым существенно расширить представления о соматическом мутагенезе.
В-четвертых, имеются основания полагать, что изучение соматического мутагенеза на уровне отдельных генных локусов имеет не только теоретическое, но и практическое значение. С одной стороны, как показано для хромосомных аберраций нестабильного типа, по количеству мутаций в клетках периферической крови можно судить о дозе радиационного воздействия в близкие сроки после его окончания. Однако из-за естественного обновления популяции лимфоцитов количество традиционных маркеров радиационного воздействия - дицентрических хромосом — постепенно снижается со временем после облучения, делая невозможным проведение биологической дозиметрии в отдаленные сроки. Одним из подходов к решению проблемы ретроспективной дозиметрии могло бы стать использование методов определения генных соматических мутаций в долгоживущих клетках стволового типа. Однако информативность таких методов изучена пока недостаточно, особенно для случаев пролонгированного действия радиации. С другой стороны, одним из основных отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на соматические клетки является повышение канцерогенного риска. Как известно, спектр изменений генетического материала при злокачественной трансформации не исчерпывается структурными мутациями. Молекулярно-биологические исследования канцерогенеза показывают, что генные мутации
10 имеют не меньшее, если не большее значение. Поэтому можно полагать, что изучение генных соматических мутаций у облученных лиц имеет важное значение для выяснения механизмов радиационного канцерогенеза, оценки канцерогенного риска (особенно при воздействии в малых дозах) и, наконец, для формирования группы повышенного риска возникновения онкологических заболеваний.
Таким образом, необходимость исследования соматического мутагенеза в
отдельных генных локусах после радиационного воздействия не вызывает
сомнений. Однако методические возможности изучения генных мутаций в
соматических клетках человека были до недавнего времени сильно
ограничены сложностью, трудоемкостью, недостаточной
воспроизводимостью и неоднозначностью интерпретации результатов, что связано, главным образом, с низкой частотой мутаций по отдельным локусам. Эти проблемы удалось в значительной мере преодолеть с внедрением полуавтоматических методов проточной цитометрии, позволяющей анализировать сотни тысяч клеток за относительно небольшое время и, в конечном, счете обследовать значительные контингента людей. В настоящее время известно несколько методов, позволяющих при массовом обследовании определять частоту клеток с генными мутациями по отдельным локусам. Практически все методы основаны на иммунофлуоресцентном анализе белковых продуктов соответствующих генов, а не на исследовании самой ДНК. При этом по наличию или отсутствию нормального продукта немутировавшего гена оценивают частоту клеток с вариантным (мутантным) иммунофенотипом. В данной работе использованы методы оценки генных мутаций по двум локусам -гликофорина A (glycophorin A , GPA) и Т-клеточного рецептора (Т-се11 receptor, TCR)- в клетках периферической крови.
Несмотря на то, что оба метода разработаны более 10 лет тому назад, они интенсивно используются только в ограниченном числе лабораторий за пределами РФ. По всей видимости, это является главной причиной
недостаточности данных об основных радиобиологических закономерностях в отношении указанных генных мутаций: о зависимости доза - эффект радиационного воздействия с разной мощностью, о влиянии возраста в момент облучения на количество мутантных клеток, о возможных эффектах малых доз и т.д. Результаты, полученные в данной диссертационной работе, в значительной мере восполняют указанные пробелы.
По современным представлениям о мутагенезе, частота мутантных клеток определяется как скоростью возникновения мутаций (которая зависит от дозы и мощности дозы генотоксического воздействия, эффективности репарации повреждений ДНК и т.д.), так и скоростью элиминации мутантных клеток различными способами, в том числе путем апоптоза. Несмотря на интенсивные исследования апоптоза, известны лишь единичные данные об индивидуальной вариабельности апоптотической гибели нормальных клеток человека (Crompton, 1998). Тем более неясно, существует ли корреляция между индивидуальным уровнем апоптоза в ответ на повреждение ДНК и частотой мутантных клеток у человека in vivo. Хотя отдельные данные, полученные при обследовании лиц с синдромом Ли-Фраумени, позволяют предполагать наличие такой корреляции. В связи с этим в данной диссертационной работе проведен анализ роли апоптотической элиминации клеток с поврежденной ДНК как одного из механизмов поддержания генетической стабильности клеточных популяций после радиационного воздействия на организм человека in vivo.
Таким образом, целью данной работы является исследование закономерностей и некоторых механизмов формирования генных мутаций в соматических клетках человека после радиационного воздействия in vivo.
При этом поставлены следующие задачи:
1. проанализировать зависимость частоты GPA- мутантных клеток от дозы острого и пролонгированного радиационного воздействия;
определить зависимость частоты TCR-мутантных клеток от дозы пролонгированного и хронического облучения в ближайшие и отдаленные сроки после воздействия, а также возможные изменения этого показателя на индивидуальном уровне (по результатам повторных обследований);
оценить информативность GPA- и TCR- методов для биологической дозиметрии радиационного воздействия в различных ситуациях;
провести сравнительное исследование частоты клеток с мутациями по 2-м указанным локусам у необлученных контрольных доноров и лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах, включая ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 сГр, и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ;
исследовать влияние возраста в момент радиационного воздействия на частоту TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ;
оценить возможность использования показателей соматического мутагенеза (частоты GPA- и TCR-мутантных клеток) в целях формирования группы лиц с повышенным риском возникновения злокачественных новообразований;
провести сравнительное исследование частоты TCR-мутантных клеток и индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов после облучения in vitro у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах.
13 Положения, выносимые на защиту:
Увеличение частоты клеток с генными мутациями на единицу дозы зависит от режима (острый/пролонгированный) радиационного воздействия на организм человека. Проведение биологической дозиметрии на основе анализа генных мутаций возможно после облучения в достаточно высоких дозах и более эффективно в случае острого воздействия;
Динамика проявления радиационно-индуцированных мутаций по разным локусам различается;
В отдаленные сроки после действия радиации в малых дозах отмечается высокая частота клеток с генными мутациями, что, вероятно, свидетельствует о нестабильности генома соматических клеток. Признаки генетической нестабильности наблюдаются не у всех облученных лиц и не во всех популяциях соматических клеток;
Повышение частоты клеток с генными мутациями у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 Гр, не связано с нарушением элиминации поврежденных клеток путем апоптоза;
Частота соматических клеток с генными мутациями, вероятно, может являться критерием для формирования группы лиц с повышенным канцерогенным риском.
