Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
И ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ
СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ 13
1. Основные варианты электрофоретических методов,
применяемых для фракционирования
ГУМУСОВЫХ В ЄІЦЄСТВ м«п««і«иіиінмімнмн»мнн>імншініманн«наніяіпп>ФиаиііМмтііни««1Ч
а). Электрофорез в растворе, на бумаге,
целлюлозе и агар-агаре 14
б). Электрофорез в полнакриламидном геле 18
в). Изотахофорез и изоэлектрическое
фокусирование 22
г). Капиллярный электрофорез и капиллярный
изотахофорез 2 5
2. Принципы и проблемы эксклюзивной
хроматографии гумусовых веществ 29
а). Эксклюзивная хроматография при низком
давлении .. 30
б). Высокоэффективная жидкостная
эксклюзивная хроматография ..... .. 34
в). Проблемы эксклюзивной хроматографии
гумусовых веществ 3 б
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
1. Характеристика почв 41
а). Дерново-подзолистая почва 41
б). Серая лесная почва 44
в) . Чернозём 4 7
г) . Краснозём 4 9
Экстракция и очистка гуминовых кислот 52
Определение элементного состава, содержания
золы и влажности препаратов гуминовых кислот 54
4. Электрофорез гуминовых кислот в полиакриламидном
геле в присутствии дезагрегирующих агентов 54
5. Эксклюзивная хроматография гуминовых кислот на
сефадексе G-75 57
6. Определение спектров поглощения,
коэффициентов экстинкции и цветности
препаратов гуминовых кислот 60
7. Анализ структурных компонентов гуминовых
кислот с помощью пиролитической газовой
хроматографии/масс-спектрометрии в
присутствии те траме тил аммония „.„ 62
8. Определение аминокислотного состава
гуминовых кислот 63
9. Ультрафильтрация гуминовых кислот 63
10. Реактивы, использованные в работе 65
ГЛАВА III. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ГУМИНОВЫХ
КИСЛОТ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ
ji^н*."АгРкі"|ДРУКдцИх AJ."ijjНТОВ «« «--.-ОD
ГЛАВА IV. СОЧЕТАНИЕ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ГУМИНОВЫХ
Выбор оптимальных условий эксклюзивной хроматографии на сефадексе для получения электрофоретических фракций гуминовых кислот 75
Применение сочетания эксклюзивной хроматографии с электрофорезом для препаративной наработки электрофоретических фракций почвенных гуминовых кислот различного генезиса 8 О
ГЛАВА V. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ФРАКЦИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ СОЧЕТАНИЕМ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Спектрофотометрическое исследование 87
Пиролитическая газовая хроматография/масс-спектрометрия 97
а). Идентификация структурных
компонентов 97
б). Оценка происхождения исследуемых
препаратов 108
3. Аминокислотный состав
ГЛАВА VI. ВЗАИМОСВЯЗЬ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ХАРАКТЕРИСТИК ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ
ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ С ГЕНЕЗИСОМ ПОЧВ 131
ГЛАВА VII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОЧЕТАНИЯ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ И
Xx^JJXLAX^S^^ X УЦ(Г ЧЛЗЛЫЛУЛЛ «(«ИІНІІМНІНІНІННІ>НаМіи»ННММ»ИНІРИ»«НІНІМ*НІ«ІНІМІМ>М«М«МІИ«ІММ«ММІ ""
1. Анализ эффективности фракционирования
почвенных гуминовых кислот методом
уль трафиль трации 14 5
2. Мониторинг созревания гуминоподобных
веществ в процессе компостирования
органических отходов 151
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 158
ВЫВОДЫ 162
ЛИТЕРАТУРА 168
ПРИЛОЖЕНИЯ 228
Введение к работе
По данным ЮНЕСКО более половины органического вещества природных экосистем нашей планеты содержится в виде гумусовых веществ (ГВ) - сложного комплекса природных органических гетерополимеров, различающихся молекулярными размерами и мономерным составом. Общая масса органического углерода почвы - 3 миллиарда тонн, значительно больше, чем масса других соединений углерода, включённых в глобальные геохимические циклы. Углерод газов атмосферы составляет 0.7, живых организмов - 0.48, поверхностных вод -0.25, морских вод - 0.5-0.8 млрд. тонн (Bohn, 1976). Принимая во внимание тот факт, что до 50% органического вещества почвы и до 80% органики природных вод представлены ГВ, становится ясной огромная роль этих соединений как в глобальном цикле углерода, так и в процессах трансформации живого вещества и образовании углекислого газа. Гумус является одновременно продуктом разложения живого вещества и источником его последующего образования, то есть одним из звеньев системы трофических связей между различными формами живых организмов. В последнее время доказано, что ГВ, будучи самым большим природным резервуаром углерода, являются одним из определяющих факторов парникового эффекта и связанного с ним глобального потепления климата планеты (Маппо, 2000).
Являясь обязательным и стабильным компонентом почв и природных вод, ГВ в значительной мере влияют на основные физико-химические свойства и обеспечивают многие токсикопротекторные функции экосистем, связывая и/или инактивируя пестициды, гербициды, тяжелые металлы, полициклические углеводороды и другие поллютанты.
История изучения ГВ насчитывает два столетия, и многие их функции (сельскохозяйственная, экономическая, экологическая и т.д.), а также условия формирования достаточно хорошо изучены как в России Тюриным И.В., Драгуновым С.С., Трусовым А.Г., Кононовой М.М., Александровой Л.Н., Христевой Л.А., Орловым Д.С., Кауричевым И.С., Гаджиевым И.М., Ганжарой Н.Ф., Комиссаровым И.Д., Фокиным А.Д. и др., так и за рубежом Фляйгом В. (Flaig), Шнитсером М. (Schnitzer), Стевенсоном Ф. (Stevenson), Малколмом Р. (Malcolm), Фриммелем Ф. (Frimmel), Сайз-Хименесом Ц. (Saiz-Jimenez), Вершау Р. (Wershaw), Джессингом Е. (Gjessing), Клавинчем М. (KlavinS) и др. Однако до сих пор не существует единого представления о механизмах образования и принципах строения ГВ, что частично связано с отсутствием стандартных подходов к изучению этого исключительно сложного класса соединений и многообразием используемых источников ГВ. В последнее время усиленно пропагандируется научная концепция, согласно которой определение структуры ГВ в принципе невозможно, так как по своему составу и условиям образования эти вещества являются исключительно неоднородным, и их структурные особенности тесно связаны с конкретным местом формирования и способом выделения. С другой стороны всё больше сторонников получает теория, в соответствии с которой структуру ГВ целесообразно рассматривать не как однозначные химические структуры (как например белки или нуклеиновые кислоты), но как ансамбль полидисперсных компонентов, обладающих физико-химическими свойствами, присущими данному классу соединений и позволяющими объяснить те или иные природные функции ГВ. В соответствии с вьппеизложенным теоретическая разработка и экспериментальное подтверждение смысловых закономерностей в молекулярной структуре ГВ является одной из центральных задач современного
физико-химического почвоведения и молекулярной экологии. Такие
исследования открывают возможность идентификации и анализа процессов гумификации на молекулярном уровне, позволяют определять биогеохимическую роль ГВ, условия их образования, комплексообразвания с ионами металлов, а также создают основу для фундаментального усовершенствования диагностики гумусового режима в природных экосистемах и разработки методов мониторинга природных биосферных ресурсов.
ГВ, содержащиеся в природных плотных средах (почвах, донных отложениях, торфах, углях, компостах и т.д.), разделяют на три фракции -гуминовые кислоты (ГК), растворимые в щелочных и нейтральных растворах и выпадающие в осадок при рН<2, фульвокислоты (ФК), растворимые как в щелочных, так и в кислых растворах, а также гумин, нерастворимый ни в кислых, ни в щелочных растворах. ГВ, выделяемые из природных вод (морей, океанов, рек, озер, болот и т.д.), разделяют на ГК и ФК. Наиболее хорошо исследованные ГК и ФК из различных источников являются полидисперсными смесями органических гетерополимеров, и для анализа их структурных особенностей требуется применение современных методов фракционирования, т.е. разделения на индивидуальные вещества (что до сих пор не удавалось сделать) или группы соединений со сходными физико-химическими свойствами. Необходимо отметить, что в природной среде нет чёткой границы между гумусовыми и негумусовыми веществами (белками, полисахаридами и т.п.), между ними могут существовать ковалентные, электростатические, водородные и другие типы связей. Задачей любого метода фракционирования является обеспечение отделения ГВ от сопутствующих им веществ. Необходимо отметить, что традиционные методы фракционирования биополимеров и органических
соединений ограничено применимы для ГВ в связи с их амфифильностью
(наличию гидрофобной и гидрофильной частей в структуре) и способностью к
комплексообразованию. Процедуру фракционирования необходимо осуществлять
таким образом, чтобы по возможности предотвратить образование агрегатов и
межмолекулярных комплексов. В силу вышеуказанных факторов
фракционирование ГВ требует разработки новых нестандартных подходов.
Одним из наиболее эффективных методов фракционирования природных биополимеров является электрофорез, основанный на разделении макромолекул по таким важнейшим параметрам как электрический заряд, размер (или молекулярная масса) и пространственная конфигурация. Рядом исследователей (Кононовой М.М., Кауричевым И.С., Степановым В.В., Пахомовым А.Н., Каспаровым СВ., Тихомировым Ф.А., Курветто Н. (Curvetto), Ориоли Г. (Orioli), Клокинг P. (Klocking), Гонзалезом Н. (Gonzales) и др.) была показана принципиальная возможность электрофоретического разделения ГВ по заряду. Различные варианты метода были использованы для оценки гумусового состояния экосистем.
Другим методом, широко применяемым для изучения ГВ, является эксклюзивная хроматография (гель-фильтрация или гель-проникающая хроматография), основанная на пространственном разделении молекул различных размеров с помощью пористых гелей. С появлением эксклюзивной хроматографии (ЭХ) химия ГВ несомненно получила новый, исключительно информативный и достаточно простой метод для изучения структуры и функции ГВ, широко применяемый как российскими учеными Александровой Л.Н., Тихомировым Ф.А., Фокиным А.Д., Карпухиным А.И., Ганжарой Н.Ф., Кауричевым И.С., Орловым Д.С., Милановским Е.Ю., Перминовой И.В. и др., так
и зарубежными исследователями Джессингом Е. (Qjessing), Познером A. (Posner), Свифтом P. (Swift), Де Нобили М. (De Nobili), Бехером Г. (Becher), Пикколо А. (Piccolo) и др. Однако следует отметить, что результаты ЭХ одного и того же образца ГВ при различных хроматографических условиях (рН и ионная сила подвижной фазы и образца, тип геля, высокое или низкое давление в колонке, ионный состав элюирующего буфера и образца, концентрация образца и т.д.) часто противоречивы, а иногда взаимоисключающи. Проблему оценки эффективности фракционирования ГВ различными вариантами ЭХ можно легко разрешить, имея эталонные препараты ПС и ФК известного размера и молекулярной массы (ММ). Однако при существующей неопределённости структуры ГВ возможность создания универсальных ММ стандартов на сегодняшний день практически исключена. В этой ситуации представляется целесообразным оценить эффективность ЭХ, приняв во внимание распределение в хроматографическом профиле отдельных фракций, различающихся по другим физико-химическими свойствам (например, электрофоретической подвижности). Анализ результатов эксклюзивной хроматографии с помощью электрофореза предпринимался неоднократно, однако попытки обнаружить взаимосвязь между хроматографическим профилем и электрофоретическими зонами ГК или ФК были безуспешны.
Разработка стабильного метода электрофореза и его сочетания с эксклюзивной хроматографией является весьма актуальным направлением исследования молекулярного строения и функции ГВ в природных экосистемах. Это позволило бы глубоко и всесторонне изучить взаимосвязь между генетическими особенностями почв и электрофоретическими и хроматографическими параметрами почвенных ГВ. Можно с уверенностью
утверждать, что от развития таких подходов во многом будет зависеть будущее физико-химического почвоведения и отдельных направлений молекулярной экологии.
Автор выражает глубокую благодарность научному сотруднику Гайде Владиславовне АФАНАСЬЕВОЙ, научному сотруднику Ольге Ивановне РЕЗНИКОВОЙ и старшему научному сотруднику, кандидату химических наук Ольге Евгеньевне ТРУБЕЦКОЙ за неоценимую помощь в работе.
Автор считает своим приятным долгом поблагодарить профессора Цезарео САЙЗ-ХИМЕНЕСА (С. Saiz-Jimenes), заведующего отделом биогеохимии Института природных ресурсов и агробиологии (Севилья, Испания) за помощь в выполнении некоторых экспериментов и профессора Клаудио ЧИАВАТТА (С. Ciavatta), заведующего лабораторией по исследованию гуминовых веществ почв и компостов факультета агробиологии Университета г.Болоньи (Италия) за любезно предоставленные образцы гуминоподобных кислот, вьщеленных из компостов различных сроков созревания.
Автор также благодарит Российский Фонд Фундаментальных Исследований (проект РФФИ-а-01-64666), Международный Научный Фонд (проект ISF-MU-0300) и Международную ассоциацию содействия сотрудничеству с учеными независимых государств бывшего Советского Союза (проект ENTAS-01-0186), при финансовой поддержке которых была вьшолнена значительная часть настоящей работы.
