Содержание к диссертации
Введение
1. Закономерности аккумуляции фосфора органических соединений в почвах 14
1.1. Источники органических фосфатов почв 14
1.2. Содержание фосфора органических соединений в почвах 17
1.3. Содержание фосфора в органическом веществе почв 22
1.4. Взаимосвязь аккумуляции фосфора органических соединений со свойствами почв 27
1.5. Фосфор органо-минеральных комплексных соединений 30
1.6. Геохимическая подвижность органических соединений фосфора в почвах 34
1.7. Устойчивость органических соединений фосфора в почвах 41
2. Фосфор органических соединений в физических и химических фракциях органического вещества и в микробной биомассе почв
2.1. Фосфор органических соединений гранулометрических и денсиометрических фракций почв
2.2. Содержание фосфора во фракциях органического вещества почв
2.3. Фосфор микробной биомассы почв
3. Неспецифические фосфорсодержащие соединения органического вещества почв
3.1. Инозитфосфаты
3.2. Нуклеиновые кислоты
3.3. Фосфолипиды
4 Изучение фосфорсодержащих компонентов органического вещества почв методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса
4.1. Идентификация пиков на спектрах 31Р ЯМР
4.2. Количественный анализ фосфатов методом 31Р ЯМР спектроскопии
4.3. Состав органических фосфатов почв
4.4. Органические фосфаты гранулометрических и денсиометрических фракций почв
4.5. Состав фосфатов фракций органического вещества почв
4.6. Изменение состава органических фосфатов почв при антропогенном воздействии
5. Изменение содержания фосфора органических соединений в почвах при сельскохозяйственном использовании 119
5.1. Содержание фосфора органических соединений в почвах 119
5.2. Содержание фосфора в органическом веществе почв 132
6. Объекты и методы исследования
6.1. Объекты исследования
6.2. Методы исследования
7 Возможности и ограничения метода 31Р ЯМР спектроскопии при исследовании органических фосфатов почв 156
7.1. Идентификация пиков на 31Р ЯМР спектрах и количественный анализ органических фосфатов методом 31Р ЯМР спектроскопии 156
7.2. Использование 31Р ЯМР спектроскопии для идентификации источников органических фосфатов почвы 188
7.3. Использование Р ЯМР спектроскопии для характеристики биологической активности почв
8. Фосфор органических соединений в почвах
8.1. Закономерности аккумуляции фосфора органических соединений
8.2. Состав органических фосфатов почв
8.3. Фосфор в примитивных почвах начальной стадии почвообразования на покровном суглинке
9. Фосфор органических соединений гранулометрических фракций почв 257
9.1. Распределение фосфора по гранулометрическим фракциям 257
9.2. Состав органических фосфатов гранулометрических фракций 270
10. Фосфор во фракциях органического вещества почв 282
10.1. Распределение фосфора по фракциям гумусовых кислот 282
10.2. Фосфор в препаратах гуминовых кислот и фульвокислот 293
10.3. Состав фосфатов фракций органического вещества почв 307
10.4. Фосфор в структуре гипотетической молекулы гумусовой кислоты 316
11. Влияние антропогенного воздействия на содержание и состав органических соединений фосфора в почвах
11.1. Органические фосфаты дерново-подзолистой почвы при разных системах удобрений
11.2. Органические фосфаты горной бурой лесной почвы при разном землепользовании
Выводы
- Содержание фосфора органических соединений в почвах
- Содержание фосфора во фракциях органического вещества почв
- Количественный анализ фосфатов методом 31Р ЯМР спектроскопии
- Использование 31Р ЯМР спектроскопии для идентификации источников органических фосфатов почвы
Введение к работе
Актуальность
Круговорот многих химических элементов в экосистеме определяется комплексным взаимодействием химических, биохимических и биологических процессов и тесно связан с синтезом и разложением органического вещества. Фосфор (Р), безусловно, относится к таким элементам, поскольку в процессе почвообразования переходит из состава минеральных фосфатов горных пород в органические соединения и в таком виде накапливается в почвах. В результате аккумуляции органических фосфатов на их долю может приходиться до 90% от общего содержания Р в почве. Аккумуляция большого количества Р органических соединений (Рорг) и низкая растворимость в почвенном растворе многих минеральных фосфатов способствуют тому, что трансформация фосфорсодержащих органических соединений в почве является важным звеном круговорота Р в экосистеме. В частности, их минерализация обеспечивает преобладающую часть фосфорного питания растений в естественных фитоценозах (Dai et al., 1996; Firsching, Claassen, 1996). Среди органических фосфатов, соединения с фосфодиэфирной связью (нуклеиновые кислоты, фосфолипиды, фосфополисахариды) имеют особое значение. Они составляют преобладающую часть поступающих в почву фосфатов биологического происхождения и, будучи относительно малоустойчивыми вне биологических объектов, являются ключевыми соединениями в трансформации органических фосфатов в почве и круговороте Р в экосистеме.
Изучению органических фосфатов почвы посвящено большое число исследований, результаты которых обобщены в ряде обзоров (Anderson, 1967; 1975; 1980; Smeck, 1985; Harrison, 1987; Stewart, Tiessen, 1987; Sanyal, De Datta, 1991; Magid et al., 1996). Краткая сводка на русском языке представлена в монографии К.Е. Гинзбург (1981), а наиболее детальный анализ места и роли нуклеиновых кислот в почвах дан в монографии Н.С. Паникова с соавторами (1984).
Размеры аккумуляции органических фосфорсодержащих соединений в почвах оценивались в зависимости от экологических факторов, таких как климат, растительность, почвенные свойства, почвообразующие породы, характер землепользования и др. Использовался и математический анализ для описания закономерностей аккумуляции Рорг в почве (Harrison, 1987). Заметные усилия были направлены на изучение химической природы органических фосфатов почвы. Эти исследования включают исследования: 1) неспецифических фосфорсодержащих органических соединений (инозитфосфатов, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и др.) химическими методами; 2) групп органических фосфатов, ассоциированных с разными физическими и химическими фракциями органического вещества почв; 3) групп фосфорсодержащих соединений, имеющих разный характер связи атома Р в органической молекуле (фосфорных моно- и диэфиров, фосфонатов, полифосфатов), методом ядерного магнитного резонанса по фосфору-31 (31Р ЯМР); 4) закономерностей взаимодействия органических фосфатов почвы со специфическими фосфатазами; 5) органо-минеральных фосфат-гумусовых взаимодействий.
На основе выполненных исследований сложилось современное представление о природе и закономерностях аккумуляции и трансформации органических фосфатов в почвах, которое можно сформулировать в следующих основных положениях:
• аккумуляция Р в большей степени выражена в органическом веществе кислых почв, где органические фосфаты стабилизируются в результате взаимодействия с Fe и AI с образованием устойчивых органо-минеральных комплексов;
• часть Рорг почвы ассоциирована с неспецифическими соединениями органического вещества почвы; среди специфических соединений почвенного гумуса, гуминовые кислоты (ГК) отличаются низким содержанием Р, тогда как фульво-кислоты (ФК) гораздо более насыщены этим элементом;
• Рорг почв имеет двойственную природу: одна часть его представлена собственно органическими соединениями, тогда как другая - хемосорбированным неорганическим ортофосфатом;
• в составе органических фосфатов почвы преобладают инозитфосфаты растительного происхождения, тогда как относительное содержание фосфорных диэфиров микробного происхождения невелико.
Несмотря на сделанные обобщения, фосфор, как элемент органического вещества почвы, остается гораздо менее изученным в сравнении с углеродом или азотом. Проведенные исследования свидетельствуют о сложности характеристики химической природы органических фосфатов почвы, которая, вероятно, связана с образованием комплексных соединений органического вещества почв с индивидуальными фосфорными эфирами и комплексов неорганических фосфатов и органического вещества почв. Анализ накопленных данных показывает, что, с одной стороны, в экспериментальных исследованиях получено много противоречивых результатов, а с другой, при изучении органических фосфатов почвы сформировался ряд стереотипов, которые не имеют достаточного экспериментального обоснования, но широко используются при интерпретации получаемых данных. Например, очень противоречива информация о соотношении Р индивидуальных органических фосфатов и фосфорсодержащих гумусовых соединений, а также о распределении Р по фракциям органического вещества почв. Ряд стереотипов сложился в интерпретации результатов исследований органических фосфатов методом 31Р ЯМР. К таким экспериментально необоснованным заключениям относятся, прежде всего, трактовка принадлежности ряда пиков на спектрах 31Р ЯМР, а также происхождения (растительное или микробное, грибное или бактериальное) идентифицируемых фосфорсодержащих соединений.
Области интересов ученых, изучающих органическое вещество почв, с одной стороны, и органические фосфаты, с другой, практически не пересекаются. Об этом наглядно свидетельствуют программы всех конференций Международного общества по изучению гумусовых веществ (International Humic Substances Society - IHSS). Как следствие, Рорг, несмотря на его достаточно высокую концентрацию в почве, не был включен в состав современных структурных формул не только ГК, но и общего органического вещества почвы, содержащего, тем не менее, 0,4% серы (Schulten, Schnitzer, 1997). Поэтому вполне естественно, что Р не упоминался и ранее в составе ни одной из ряда структурных формул ГК, предлагавшихся на протяжении достаточно долгой истории их исследования (Драгунов и др., 1948; Орлов, 1974; Fuchs, 1931; Flaig, 1964; Schnitzer, 1978; Schulten, Schnitzer, 1993; и ДР) Все отмеченные обстоятельства позволяют сделать вывод о том, что важнейшие вопросы фундаментальной химии Рорг почвы, которые могли бы дать количественную и качественную характеристики состояния органических фосфатов в почве, едва ли можно считать убедительно освещенными в современной литературе. На основании опубликованных данных не представляется возможным формирование целостной концепции, описывающей наиболее общие закономерности аккумуляции и трансформации органических фосфатов почв в разных экологических условиях.
Цель работы
Установить основные закономерности аккумуляции Р в составе органического вещества почв и основные факторы, определяющие качественный состав органических фосфатов почв, формирующихся в разных экологических условиях, включая антропогенное воздействие.
Задачи исследования
1. Определить содержание Рорг в почвах основных биоклиматических зон Европейской части России и вертикальных зон Северного Кавказа и его распределение по физическим (гранулометрическим) и химическим (группам органического вещества) фракциям почв.
2. Изучить качественный состав органических фосфатов почв, отдельных гранулометрических фракций и химических фракций органического вещества почв методом 31РЯМР.
3. Изучить качественный состав органических фосфатов растений и микроорганизмов на основе анализа экстрактов, используемых при исследовании органического вещества почв.
4. Оценить степень трансформации данных о состоянии Рорг в почвах в результате использования стандартных методов изучения органического вещества почв (кислотно-щелочное фракционирование, получение препаратов гумусовых кислот).
5. Определить изменение количественных и качественных характеристик состояния Р0рг в почвах под влиянием антропогенных факторов, таких как применение разных систем удобрений и разный характер землепользования.
Защищаемые положения
К защите представляется общая концепция состояния фосфора органических соединений в почвах, базирующаяся на следующих положениях:
1. Уровень аккумуляции Рорг в почвах и в органическом веществе почв определяется совокупностью факторов, как контролирующих накопление органических соединений в целом, так и оказывающих селективное влияние на минерализацию органических фосфатов.
2. Распределение Р по группам органических соединений, выделяемым на основе разной растворимости (или устойчивости) в кислоте и щелочи (неспецифические соединения, группы гумусовых кислот), контролируется взаимодействием "фосфат-металл", зависящим от кислотно-основного состояния почв. Такое распределение может быть принципиально изменено при использовании разных методов фракционирования органических фосфатов.
3. Фосфор является обязательным структурным элементом высокомолекулярных гумусовых кислот, в состав которых входят молекулы (фрагменты молекул) индивидуальных органических фосфатов (прежде всего, фосфолипидов, нуклеиновых кислот и продуктов их гидролиза). Однако большая часть индивидуальных фосфорсодержащих соединений (прежде всего, инозитфосфатов) взаимодействует с гумусовыми кислотами через "металлические мостики", образуя высокомолекулярные органо-минеральные комплексы.
4. 31Р ЯМР спектроскопия позволяет определять качественный состав органических фосфатов и количество фосфора отдельных групп соединений и на этой основе оценивать относительную активность минерализации органических фосфатов в почве, а в некоторых случаях, и определять их преимущественное происхождение (растительное, микробное).
5. Большая часть фосфорсодержащих биологических молекул, относительно неустойчивых в почвенных условиях (нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и фосфополисахариды), стабилизирована в составе органического вещества почв вне микробной биомассы.
6. Определение содержания в почвах органических фосфатов разной степени лабильности (доступности для биохимической минерализации) на основе их экстрагируемости разными растворителями является неэффективным. Лабильные органические фосфаты входят в состав разных фракций органического вещества, а их качественный состав зависит от уровня биологической активности почв.
Научная новизна
В работе впервые обоснован механизм, определяющий распределение Рорг по фракциям органического вещества почв, и показана чувствительность такого распределения к методическим особенностям фракционирования. Принадлежность фосфорсодержащих органических компонентов к фракциям, выделяемым на основе разной растворимости (или устойчивости) в кислоте и щелочи (неспецифические соединения и группы гумусовых кислот), контролируется взаимодействием "фосфат-металл", зависящим от кислотно-основного состояния почв. В кислых почвах преобладает взаимодействие фосфатной группы органической молекулы с Fe и AI, тогда как в нейтральных и карбонатных - с Са и Мд. Разная растворимость образующихся солей (комплексных соединений) в кислоте и щелочи и определяет их разное поведение в процессе фракционирования органического вещества почв. Методические особенности фракционирования, способные оказать воздействие на связь фосфат-металл и, следовательно, на растворимость фосфорсодержащих компонентов (обработка почвы кислотой перед щелочной экстракцией, переосаждение ГК), могут способствовать принципиальному перераспределению Р0рг между отдельными фракциями органического вещества почвы.
Впервые предложено структурно определенное место Р в составе молекулы ГК и место Р0рг в структуре высокомолекулярных органо-минеральных комплексов органического вещества почв. Гуминовая кислота содержит около 0,2% Р в виде ковалентно связанных биологических фосфорсодержащих молекул или их фрагментов (фосфолипидов, нуклеиновых кислот и продуктов их гидролиза). В несколько раз больше Р входит в состав органо-минеральных комплексов в виде индивидуальных соединений (прежде всего, инозитфосфатов), взаимодействующих с молекулами ГК через "металлические мостики".
Показано, что понятие "фосфор фульвокислот" неопределенно как качественно, так и количественно. В составе органического вещества кислоторастворимой фракции щелочного экстракта Р представлен преимущественно неспецифическими соединениями, в том числе, гидролизуемыми из состава высокомолекулярных органо-минеральных комплексов в результате кислотного и щелочного воздействия. Количественная неопределенность связана как с зависимостью содержания Рорг во фракции ФК от интенсивности гидролиза (кислотная обработка перед щелочной экстракцией, переосаждение ГК), так и с принципиальным влиянием типа используемого сорбента на содержание Р в препаратах ФК.
На основе Р ЯМР спектроскопии экстрактов из естественных почв и культур микроорганизмов, а также выполненных инкубационных экспериментов впервые утверждается, что 1) большая часть фосфорсодержащих биологических молекул, относительно неустойчивых в почвенных условиях (нуклеиновые кислоты, фос-фолипиды и фосфополисахариды), стабилизирована в составе органического вещества почв вне микробной биомассы; 2) качественный состав лабильных фосфорных диэфиров зависит от уровня биологической активности почв; 3) соотношение фосфорных моноэфиров и диэфиров является показателем активности минерализации фосфорсодержащих органических соединений в почвах.
Установлено, что результаты 31Р ЯМР спектроскопии, не сопровождающиеся дополнительными исследованиями, не позволяют непосредственно определить растительное или микробное происхождение органических фосфатов почв и степень их ассоциированности с микробной биомассой, как это часто делается в работах, характеризующих состояние Рорг в почвах с использованием метода 31Р ЯМР. Состав органических фосфатов растений и микроорганизмов, определяемый на основе спектроскопии щелочных экстрактов, очень сходен, и только в случае выраженного вторичного перераспределения лабильных фосфатов (например, минерализация соединений растительного происхождения и физическая стабилизация продуктов микробного синтеза) появляется возможность определения их преимущественных источников.
Разные виды антропогенного воздействия на почвы, такие как применение органических удобрений, вырубка леса и использование территории под пастбище, изменяют состояние органических фосфатов в дерново-подзолистой и бурой лесной почвах, соответственно. Удобрения приводят к повышенной минерализации лабильных фосфорных диэфиров и уменьшению их содержания в составе фосфорсодержащих органических соединений почвы. Изменение состава фитоценоза и выпас также способствуют минерализации Р0Рг, наиболее интенсивной в составе крупных гранулометрических фракций, и изменению качественного состава фосфорных диэфиров.
Практическое значение
Из результатов работы следует, что метод 31Р ЯМР спектроскопии позволяет количественно определять Р структур типа ДНК и Р суммы структур типа фосфо-липидов и фосфополисахаридов, не прибегая к сложным биохимическим анали зам, принципиально занижающим содержание Р подобных компонентов в составе органического вещества почв.
Показано, что определение лабильных органических фосфатов, как близкого резерва фосфорного питания растений, на основе их "мягкой" экстракции бикарбонатом натрия или другими растворителями является неэффективным, поскольку на долю таких соединений приходится лишь небольшая часть лабильных фосфорных диэфиров почвы. Определение суммарного содержания Р диэфиров в щелочном экстракте из почв методом 31Р ЯМР спектроскопии дает более полное представление о содержании в почве легкогидролизуемых органических фосфатов.
Содержание в почве потенциально легкоминерализуемых фосфорных диэфиров и соотношение Р моноэфиров и диэфиров, заметно варьирующие в зависимости от экологических условий, могут служить интегральными характеристиками активности минерализации фосфорсодержащих органических соединений почвы и продуктов биологического синтеза растений и микроорганизмов.
Результаты исследований включены в учебное пособие "Трансформация органического вещества почв" (М.: МГУ, 1990) и используются при чтении курса лекций по биогеохимии на факультете почвоведения МГУ.
Благодарности
Работа посвящается памяти профессора Л.А. Гришиной, первого учителя и наставника в почвоведении, привившей автору интерес к исследованию органического вещества почв, и показавшей перспективность применения в таких исследованиях новых инструментальных методов. Глубокая благодарность выражается коллегам по кафедре общего почвоведения Т.И. Малышевой, P.M. Окуневой, Н.П. Недбаеву и ученикам СВ. Петровой, И.В. Булатниковой и Е.Г. Смирновой за помощь при проведении экспериментальных исследований. Признателен также всему коллективу кафедры общего почвоведения во главе с заведующим, профессором А.С. Владыченским за доброжелательное отношение при выполнении работы. Особенно благодарен профессору W. Zech за предоставленную возможность проведения исследований методом 31Р ЯМР спектроскопии в Институте почвоведения и географии почв Байройтского университета (Германия), а также доктору L. Haumaier за полезные советы и ценные консультации.
Отдельные разделы работы выполнены при поддержке проектов РФФИ №№ 96-04-48477, 98-04-49350, 02-04-49225; Европейской организации по изучению окружающей среды (EERO): 1993; Немецкой службы академических обменов (DAAD): 1994; Фонда Александра фон Гумбольдта: 1999-2000; Немецкого научно-технического общества (DFG): 2001.
Содержание фосфора органических соединений в почвах
Поскольку почвообразующая порода является важнейшим первичным источником Р для живых организмов, то содержание элемента в породе и трансформация фосфорсодержащих минералов в процессе выветривания, при прочих равных условиях, являются важными факторами, регулирующими аккумуляцию органических фосфатов в почве (Walker, Adams, 1958; 1959). Эволюция состояния Р в почвах хорошо иллюстрируется схемой, предложенной на основе многочисленных исследований хронологических рядов почв, сформированных на разных породах в Новой Зеландии (Walker, Adams, 1959; Syers, Walker, 1969; Williams, Walker, 1969; Syers et al., 1970; Adams, Walker, 1975; Walker, Syers, 1976). Фосфор, высвобождающийся при выветривании первичных минералов, частично выщелачивается из почвы, приводя к постепенному снижению его общего содержания. Другая часть Р утилизируется живыми организмами, образуя, в конечном счете, фракцию органических фосфатов почвы. Третья -трансформируется во вторичные неорганические фосфаты, которые постепенно переходят в окклюдированные фосфаты AI и Fe. На первых этапах почвообразования происходит повышение содержания органических, вторичных и окклюдированных форм Р за счет выветривания первичных фосфорсодержащих минералов. Когда резерв первичных фосфатов снижается в результате выветривания, а вторичных - в результате перехода в окклюдированные формы, происходит уменьшение количества органических фосфатов. Исследование двух хронологических рядов почв в Новой Зеландии показало чрезвычайно быструю аккумуляцию Р0рг на первых стадиях почвообразования, когда в течение 50-100 лет ежегодный прирост содержания Рорг в метровой толще составлял 1,56-4,13 кг га"1. К возрасту 5-10 тыс. лет скорость аккумуляции уменьшалась до 0,01-0,03 кг га"1, после чего количество Рорг в почве начинало снижаться (Baker, 1976). Процесс снижения содержания Р0рг в почве начинается тогда, когда скорость выветривания Р из первичных минералов становится ниже суммарной скорости его выщелачивания из почвы и перехода в окклюдированные формы. Общая закономерность, полученная в работах новозеландских ученых, показана в исследованиях и других хронологических рядов почв. В частности, изучение разновозрастных черноземов Сибири показало, что почвы большего возраста харастеризуются меньшим абсолютным и относительным содержанием Рорг и концентрацией Р в органическом веществе почвы (Богданов, 1954). Большое разнообразие почвообразующих пород и факторов, контролирующих скорость выветривания фосфорсодержащих минералов, с одной стороны, и соотношение синтеза и минерализации органических фосфатов - с другой, определяют широкое варьирование содержания Рорг в почвах, разное относительное количество Рорг в составе фосфорсодержащих соединений почвы и разную насыщенность фосфором органического вещества почв. Для определения Р0Рг в почвах широко используются два альтернативных метода: экстракция или сжигание.
Оба они являются косвенными методами, в которых КОЛИЧеСТВО Р0рг Определяется ПО раЗНОСТИ Между Содержанием Р0бщ и Рмин. Для экстракции органических фосфатов предлагались различные процедуры, но модификации метода Mehta et al. (1954) стали наиболее признанными. Для сжигания органических фосфатов наиболее часто используют модификации метода Saunders и Williams (1955). Обычно использование этих методов для определения Р0Рг в одних и тех же некарбонатных почвах дает близкие результаты, при общей тенденции несколько больших значений, получаемых методом сжигания (MacLean, 1965; Williams et al., 1970; Oniani et al., 1973). Для карбонатных почв метод экстракции дает заметно более низкие значения (Williams et al., 1960). Возможные различия связаны с недостатками, имеющимися как у одного, так и у другого методов. Метод сжигания может повышать растворимость неорганических фосфатов и, тем самым, завышать концентрацию Рорг. В то же время, экстрагирование может не полностью извлекать из почвы органические фосфаты, а также вызывать частичный щелочной гидролиз экстрагируемых соединений. Данных о содержании Рорг в различных почвах накоплено много. Достаточно подробная сводка по пахотным почвам СССР приведена в монографии К.Е. Гинзбург (1981). В самом общем виде, почвы с большим содержанием органического вещества характеризуются большей аккумуляцией Рорг. В пахотном горизонте дерново-подзолистых почв содержится от 190 до 770 мг Р2О5 кг"1, а в серых лесных почвах - от 410 до 920 мг Р205 кг"1. В черноземах количество Р205 повышается до 530-1390 мг кг"1, снижаясь в южных черноземах до 350-1100 мг Р205 кг 1, а в каштановых почвах составляет всего 250-600 мг Р2Об кг"1. Некоторые из данных, опубликованных за рубежом, дают следующее представление о содержании Рорг в почвах. В гумусовых горизонтах каштановых почв Канады содержится 172-247 мг Рорг кг"1, в черноземах его концентрация значительно выше - 479-625 мг кг"1, а в серых лесных - 415-500 мг кг"1 (Dormaar, Webster, 1963). Меньшие показатели характерны для карбонатных почв Колорадо, содержащих от 60 до 330 мг Р0Рг кг"1 (в среднем 150) (Greb, Olsen, 1967). Содержание Рорг в верхнем минеральном горизонте лесных подзолов, буроземов и опод-золенных буроземов Великобритании составляет в среднем около 600 мг кг"1 (Harrison, 1979). Очень высокие концентрации отмечены для некоторых луговых почв Новой Зеландии, где содержание Рорг варьирует от 280 до 2220 мг кг"1 (Walker, Adams, 1958) и вулканических почв Чили, содержащих 650-2000 мг Рорг кг"1 (Borie, Zunino, 1983; Borie et al., 1989). Сильное варьирование содержания Рорг в почвах одного типа позволило сделать вывод, что оно не является характерным показателем для почвенного типа (John et al., 1965). Относительное содержание Рорг в составе фосфатов почвы также сильно варьирует. Минимальные значения (от менее 10 до 20-30%) характерны для сероземов (Хейфец, 1948; Корнева, Ким, 1970; Артамонова, 1978; Елешев, Иванов, 1983; Попович, 1992), лугово-сероземных почв (Корнева, Ким, 1970; Чиркова, Козыбае-ва, 1978), солонцов лесостепи Украины и Курской области (Адерихин и др., 1964; Власюк и др., 1974), различных карбонатных почв США (Greb, Olsen, 1967; Turner et al., 2003a), где быстрая минерализация органических остатков приводит к интенсивной минерализации Рорг. Почвы тропических лесов Таиланда также содержат мало Рорг (около 70 мг кг"1), который составляет только 19% от Р0бщ, что связано с высокой скоростью минерализации органического вещества в сравнении с лесными почвами умеренного климата (Uwasawa et al., 1988). Почвы лесной зоны умеренного климата характеризуются большим участием органических фосфатов в составе фосфорсодержащих соединений.
Обычно доля Рорг колеблется от 30-40% до 50% и несколько выше. Подзолы Кольского полуострова в верхнем минеральном горизонте содержат 44-46% Р в органической форме (Переверзев, Кошлева, 19906; Переверзев, Кошлева, 1997), но при окультуривании этих почв доля Рорг в Апах снижается до 20-40% в результате ускоренной минерализации органических фосфатов (см. раздел 5.1) и перемешивания поверхностного горизонта с нижележащими (Елсаков, 1979; Переверзев, Кошлева, 1990а). Фосфор органических соединений составляет 38-56% от РобЦ( в дерново- подзолистых почвах подтайги Средней Сибири (Холопова, 1980), 31-52% в серых лесных почвах Курской области (Адерихин и др., 1964) и 38-42% в серых лесных почвах Канады (Dormaar, Webster, 1963). Около 30% Р0бЩ приходится на долю Рорг в гумусовом горизонте бурой лесной почвы Кавказа (Белоусов, 1967). Подобно подзолам, относительное содержание Рорг снижается до 21-34% в окультуренных дерново-подзолистых и серых лесных почвах (Гаврилова и др., 1973; 1975; Марковский, 1976). От 33 до 66% Р0бщ представлено органическими соединениями в мерзлотных почвах Бурятии (Пигарева, 1966), и от 32 до 64% - в аллювиальных почвах бассейна реки Селенги (Убугунов и др., 1998). Большие значения (около 70% от Р0бщ) были получены для верхних минеральных горизонтов лесных подзолов, буроземов и оподзоленных буроземов Великобритании (Harrison, 1979). Также большое, а чаще более высокое, относительное содержание Рорг характерно для степных почв, прежде всего для черноземов, где этот показатель в среднем составляет более 50%. Так, в черноземах Курской области на долю Рорг приходится 30-63% от Робщ (Адерихин и др., 1964). В черноземах Куйбышевской области Р0Рг составляет от 38-40% до 68-70% Р0бЩ почвы (в среднем 56%) (Марковский, 1976). Близкие значения получены для оподзоленных и выщелоченных черноземов Сибири - 37-81% (чаще 47-75%) (Богданов, 1954). Около 50% Р0бщ представлено органическими соединениями в черноземах лесостепи Украины (Быстрый, Попович, 1992), в пахотном горизонте карбонатного чернозема Молдавии (Бессонова и др., 1978), и в черноземных почвах Канады (Dormaar, Webster, 1963; Tiessen et al., 1983). Близкие значения получены для вулканических почв Чили (Borie, Zunino, 1983; Borie et al., 1989). Часто для черноземов характерно и значительно более высокое относительное содержание Рорг- Например, в черноземах Кузнецкой лесостепи на долю Рорг приходится 60-76% Робщ (Хохлова, 1966), а в черноземах Башкирии этот показатель достигает 80% (Гильмутдинов и др., 1981; Гильмутдинов, 1982; Габбасова и др., 1993). 70-85% Р представлено органическими соединениями в выщелоченном и типичном черноземах Белгородской и Курской областей (Пивоварова, 1989). Иногда среди черноземов встречаются почвы с содержанием Р0рГ, достигающим 90% от Робщ (Попович, 1992).
Содержание фосфора во фракциях органического вещества почв
Вопрос о характере связи фосфора с компонентами органического вещества почв исследован слабо. С одной стороны, стабилизация Рорг в почве традиционно рассматривается как результат включения его в состав специфических высокомолекулярных гумусовых соединений (Borie et al., 1989). Однако, форма связи Р со специфическими гумусовыми веществами почвы практически не исследована. Подавляющее большинство работ, в которых Рорг интерпретируется как компонент специфических гумусовых соединений, представляют собой исследования по фракционированию гумуса на гуминовые кислоты, фульвокислоты и гумин с последующим определением содержания Р в отдельных фракциях. В то же время, известно, что Р0рг экстрагируется из почвы легче в сравнении с С, и, следовательно, легко экстрагируемое органическое вещество относительно обогащено фосфором. Например, почвы разных систем землепользования в Баварии и Дании характеризовались отношением С:Р в диапазоне 44-150, тогда как в NaOH экстракте оно составляло 41-57, а в органическом веществе, экстрагируемом анионообменной смолой в бикарбонатной форме, не превышало 9-20 (Guggenberger et al., 1996а). Именно относительно легкая экстрагируемость Рорг из почвы в условиях менее жесткого химического воздействия, способствовала появлению другого крайнего суждения, согласно которому почти все органические фосфаты относятся к неспецифическим соединениям органического вещества почвы (Паников и др., 1984). И действительно, в ряде работ, опубликованных до начала 70-х годов XX века, Рорг, определяемый в разных фракциях почвенного гумуса, относился к разным индивидуальным органическим фосфатам, что давало совершенно искаженное представление об их содержании в почвах. Очевидно, что относительно легкая экстракция Рорг из почвы еще не свидетельствует о свободном состоянии неспецифических фосфорсодержащих соединений, а лишь об ассоциации Рорг с более лабильными фракциями органического вещества почв. Относительно легкая гидролизуемость Рорг (в сравнении с гидролизуемостью С и N) также отражает лишь специфику химической связи Р в органических соединениях. Более того, большинство методов химического анализа индивидуальных органических фосфорсодержащих соединений в почве предусматривает химическое воздействие на органическое вещество, способное разрушить химические связи в высокомолекулярных органических комплексах и привести к появлению "свободных" форм органических фосфатов (см. Главу 3). Одновременно, если анализ индивидуальных соединений допускает возможность гидролиза более сложных молекул гумусовых кислот, то и стандартные методы разделения фракций гумусовых кислот, а также получения и очистки их препаратов, допускают попадание в состав "гумусовых кислот" неспецифических фосфорорганических соединений. ДНК и Fe-инозитфосфаты осаждаются при под-кислении щелочного экстракта и оказываются в составе фракции ГК. Диализ фракции при получении препаратов ГК не приводит к удалению высокомолекулярных соединений, в частности ДНК.
Низкомолекулярные кислоторастворимые компоненты (сахарофосфаты, Са-инозитфосфаты), напротив, попадают в состав фракции ФК и остаются в препарате, поскольку его получение не предусматривает диализ. Поэтому присутствие Рорг во фракциях ФК и ГК не может свидетельствовать о его полной ассоциации со сложными органическими молекулами гумусовых кислот. Результаты изучения распределения Рорг между фракциями органического вещества почв чрезвычайно противоречивы. Анализ опубликованных данных показывает, что результат фракционирования Рорг сильно зависит от методических подходов, использованных в процессе фракционирования органического вещества. Так, на долю неспецифических соединений почвенного гумуса, экстрагируемых разбавленной кислотой, приходится лишь небольшая часть (обычно менее 5%) общего экстрагируемого Рорг (Соколов, 1948; Кудзин, Губенко, 1970; Thomas, Bowman, 1966). Усиление кислотной обработки почвы от 0,5 до 4,0 М HCI повышает переход Р0Рг в кислотную вытяжку в 3-5 раз. В 4,0 М HCI растворялось 24-37% от общего количества экстрагируемого Рорг подзолистой, серой лесной почв, чернозема и краснозема, а в каштановой почве и сероземе этот показатель достигал 57-66% (Хейфец, 1948). Использование жесткой кислотной экстракции (смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (5:5:1) при 45-50 С в течение 24 ч) для выделения неспецифических органических соединений Р показало, что на их долю в серых лесных почвах и опод-золенных черноземах приходится 29-43% общего экстрагируемого Рорг, а из типичных черноземов при кислотной обработке извлекалось 40-55% экстрагируемого Р0Рг (Кривоносова, 1972; Левенец, Кривоносова, 1974; Кривоносова, 1977). Еще больше экстрагируемого Рорг (56-75%) было извлечено этим методом из дерново-подзолистых почв (Вильдфлуш 1975). Не трудно предположить, что в столь жестких условиях кислотной экстракции мог частично (или существенно) гидролизо-ваться Рорг высокомолекулярных гумусовых соединений. Правда авторы ссылаются на очень слабое извлечение Р смесью кислот из препаратов ГК и Fe-фульватов. Распределение Рорг между группами гумусовых кислот также не показывает стабильных результатов, хотя преобладают данные о большем содержании Р в ФК вне зависимости от интенсивности предварительной кислотной обработки почвы. Например, в подзоле из щелочного экстракта кислотой осаждалось только 25% Рорг (Соколов, 1948). В составе NaOH экстракта из серых лесных почв и черноземов на долю ФК также приходилось в 2-3 раза больше Р, чем было связано с ГК. Отношение С:Р в ГК составляло 218-375, тогда как в ФК не превышало 14-21 (Кривоносова, 1972; Левенец, Кривоносова, 1974; Кривоносова, 1977). Относительная обогащенность фосфором фракции ФК была в 3-10 раз выше и при фракционировании гумусовых кислот из дерново-подзолистых почв (Вильдфлуш, 1975). Аналогичные данные получены для почв Башкирии, где в серых лесных почвах содержание Р ФК превышало Р ГК в 5-25 раз, в дерново-карбонатных - в 2-2,5 раза, в черноземах - в 5-10 раз. В черноземах, например, 25-33% экстрагируемого Р0рг было связано с ФК и лишь 4-5% с ГК (Габбасова и др., 1992; Габба-сова и др., 1993). Фракционирование органических фосфатов лугово-черноземной почвы также показало, что преобладающая часть экстрагируемого Рорг (67-70%) связана с фракцией ФК, а остальное количество распределено приблизительно поровну между кислоторастворимыми соединениями и ГК (Лисовал, Левченко, 1968). Преобладание Р фракции ФК показано и в зарубежных работах. В почвах Англии и Нигерии абсолютно преобладающая часть экстрагируемого Рорг (82-88%) была ассоциирована с фракцией ФК (Omotoso, Wild, 1970а).
В черноземах Канады только 24-32% Рорг, растворимого в NaOH, осаждалось с фракцией ГК (Dormaar, 1967). Подобная закономерность показана и при анализе других почв Канады. Так, в подзолистых почвах, черноземах и глейсолях на долю ФК приходилось 65-75% экстрагируемого Рорг. В почвенном профиле этот показатель возрастал с глубиной до 85-90% в горизонте В и до 95% в горизонте С. Концентрация Р в ФК во всех почвах была значительно большей в сравнении с ГК (отношение С:Р в ФК гумусовых горизонтов составляло 13-28, тогда как в ГК - 53-118). С глубиной повышалась обогащенность фосфором как ФК, так и ГК (Schoenau, Bettany, 1987). Фосфор фракции ФК преобладал и в почвах США (карбонатных и некарбонатных), где на его долю приходилось около 70% экстрагируемого Рорг, хотя в отдельных случаях этот показатель достигал 96-97% или, напротив, снижался до 53-58% (Bowman, Cole, 1978а; Sharpley, Smith, 1985). Вместе с тем, результаты других исследований свидетельствуют о более равномерном распределении растворимого в щелочи Рорг между группами гумусовых кислот. Например, в ряде работ показано, что в черноземах с фракцией ГК ассоциировано 52-66% экстрагируемого Рорг (Соколов 1948; Кудзин, Губенко, 1970; Dormaar, 1968). Немногим более половины Рорг связано с осаждаемой кислотой фракцией щелочного экстракта в двух почвах США (Adams et al., 1954). В серой лесной почве на долю ГК приходилось 304 мг Р кг"1, а с ФК было связано 267 мг Р кг"1 (Кудеярова, 1986). В луговых почвах Новой Зеландии распределение Рорг щелочного экстракта между ГК и ФК также было равномерным, но с учетом предварительной экстракции лимонной кислотой, на долю ГК приходилось около 30% экстрагируемого Popr (Baker, 1976). В гистосолях Флориды отношение Р ГК к Р ФК варьировало от 0,6 до 1,5 (Ivanoff et al., 1998). Более широкое варьирование отмечено в 9 почвах Индии, где отношение Р ГК к Р ФК изменялось от 0,4 до 2,7 (5,8 в одном случае).
Количественный анализ фосфатов методом 31Р ЯМР спектроскопии
Интегрирование пиков на 31Р ЯМР спектрах позволяет определить относительные интенсивности резонанса атомов Р, имеющих разные типы связей в молекуле. Переход от интенсивности резонанса к оценке количества резонирующих атомов может быть лимитирован разной интенсивностью резонанса атомов Р, находящихся в разных взаимодействиях с другими атомами органической молекулы, а также отсутствием резонанса некоторых атомов, например, связанных с парамагнитными катионами (Hawkes et al., 1984). Однако уже на первом этапе использования метода 31Р ЯМР спектроскопии в почвоведении было показано, что он вполне может быть использован для количественного определения Р отдельных групп органических соединений в щелочном экстракте из почв при наличии данных об общей концентрации Р в растворе. Добавление известного количества пи-рофосфата Na в щелочной экстракт давало стандартный сигнал, который использовался для количественной оценки содержания пирофосфата в экстракте методом 31Р ЯМР. Удовлетворительное соответствие реальной концентрации Р пиро- фосфата и его концентрации, определенной по относительной интенсивности резонанса, свидетельствовало о практически полной идентификации Р в NaOH экстракте методом 31Р ЯМР спектроскопии и об отсутствии существенного количества элемента, не анализируемого вследствие мешающего эффекта Fe или Мп (Tate, Newman, 1982). Заключение о возможности использования 31Р ЯМР спектроскопии для количественного определения Р отдельных групп органических и неорганических соединений было сделано также на основе хорошего соответствия относительных количеств свободного ортофосфата в щелочном экстракте, определенных химически и по результату интегрирования интенсивности резонанса от Р-Р043" на ЯМР спектрах (Hawkes et al., 1984; Condron et al., 1985). Наиболее серьезное исследование факторов, влияющих на точность количественной интерпретации 31Р ЯМР спектров щелочных экстрактов из почв, выполнено совсем недавно в Калифорнийском университете. Было изучено влияние разных экстрагентов на концентрацию парамагнитных элементов в растворе и связанное с ней время релаксации, необходимое для полного отражения на спектре резонанса всех атомов Р, т.е. для соответствия интенсивности резонанса количеству резонирующих атомов. Показано, что необходимое время релаксации при получении спектра может заметно варьировать в зависимости от анализируемого образца (разное содержание Fe и Мп) и использующегося экстрагента (разная интенсивность растворения Fe и Мп) (Cade-Menun et al., 2002). 4.3. Состав органических фосфатов почв В первых исследованиях фосфорорганических соединений почв с использованием метода 31Р ЯМР спектроскопии было показано, что в луговых почвах Новой Зеландии преобладают фосфорные моноэфиры (Newman, Tate, 1980; Tate, Newman, 1982).
Наличие фосфорных диэфиров, пирофосфатов и полифосфатов отмечалось не во всех исследованных почвах, а фосфонаты были характерны только для почв холодных и влажных альпийских лугов, что связывалось с подавлением в них активности бактерий, ответственных за разрушение связи С-Р. Зависимость состояния фосфорорганических соединений почв от условий почвообразования также хорошо демонстрировалась соотношением Р моноэфиров и диэфиров. При повышении кислотности почвы и влажности климата и снижении среднегодовой температуры, т.е. при ухудшении условий минерализации органических остатков, происходила относительная аккумуляция фосфорных диэфиров (Tate, Newman, 1982). В дальнейшем, анализ соотношения между Р моноэфиров и диэфиров, складывающегося в результате влияния различных естественных и антропогенных факторов, стал основным предметом обсуждения в работах, использующих метод 31Р ЯМР спектроскопии для характеристики фосфорсодержащих компонентов почв. Такие работы выполнены для луговых почв Ротамстедской опытной станции (Hawkes et al., 1984), лесных и пахотных почв Мексики (Zech et al., 1985), альпийских и субальпийских почв Баварских Альп (Zech et al., 1987), разных типов почв Испании (Trasar-Cepeda et al., 1989; Gil-Sotres et al., 1990) и многих других почв. В них были подтверждены преобладание в почвах фосфорных моноэфиров и зависимость содержания фосфорных диэфиров от климатических показателей, контролирующих скорость минерализации органических остатков. На основе этой закономерности была предложена оценка относительной интенсивности минерализации Рорг в почве по соотношению Р моно- и диэфиров (Trasar-Cepeda et al., 1989; Gil-Sotres et al., 1990). В частности, в луговых почвах Ротамстедской опытной станции на долю Р моноэфиров приходилось 45-74% от экстрагируемого Р0Рг, тогда как Р диэфиров представлял 7-39%, а Р фосфонатов всего 3-4%. Фосфонаты, пирофосфаты и полифосфаты были обнаружены только в кислых почвах с рН 4,6, тогда как в менее кислых (рН 5,3-6,1) они отсутствовали. От 6 до13% Р приходилось на долю соединений, идентифицируемых резонансом около 2 ррт (тейхоевые кислоты по Condron et al. (1990)) (Hawkes et al., 1984). Фосфор моноэфиров доминировал среди фосфорорганических соединений и в других почвах: 76-85% в 0,5 М NaOH экстракте из лесных и пахотных почв Мексики (Zech et al., 1985), 41-79% в альпийских и субальпийских почвах Баварских Альп (Zech et al., 1987), 32-51% в почвах тропических лесов Либерии (Forster, Zech, 1993). Наибольшее содержание Р диэфиров (36%) характерно для гидро-морфных альпийских почв, а Р фосфонатов (6%) - для наиболее кислых субальпийских почв. В почвах Либерии на долю диэфиров приходилось 8-15% Р, а фосфонаты в них отсутствовали. Особенно низкое содержание Р диэфиров (0,7-2,6% от экстрагируемого Р) отмечено в карбонатных почвах США (Turner et al., 2003а). На примере почв Галиции (Северо-западная Испания) проведено первое детальное сравнительное исследование состояния фосфорорганических соединений в сильно различающихся генетических типах почв (Gil-Sotres et al., 1990). Исследование ранкеров, камбисолей, подзолов, глейсоли и рендзины показало наличие связи между генезисом почвы и составом фосфорорганических соединений. 31Р ЯМР спектры щелочных экстрактов из почв, характеризующихся наибольшей степенью гумификации органического вещества (камбисоли), были наиболее просты, с четкими пиками Р моно- и диэфиров, а отношение Р диэфиров и моноэфиров было минимальным и не превышало 0,16.
Спектры экстрактов из ранкеров, подзолов и глейсоли, микробиологическая активность в которых по разным причинам относительно невысока, имели в областях резонанса Р моно- и диэфиров ряд пиков, что свидетельствовало о наличии продуктов частичного гидролиза органических фосфатов. Эти почвы характеризовались повышенным относительным содержанием фосфорных диэфиров: отношение Р диэфиров и моноэфиров достигало 0,25-0,46, свидетельствуя об аккумуляции относительно неустойчивых фосфорорганических соединений. Для рендзины отношение Р диэфиров и моноэфиров превышало единицу, однако этот результат не может быть использован для сравнительной характеристики состояния Рорг, так как без предварительной кислотной обработки из этой почвы экстрагировалось не более 8% Р, который был ассоциирован исключительно с лабильным органическим веществом (Gil-Sotres et al., 1990). Изучение состава органических фосфатов камбисоли под разной растительностью на юге Баварии показало, что в почве под хвойным лесом содержится больше фосфонатов в сравнении с почвами лиственного леса или лугового сообщества. Почва же под лугом характеризовалась наибольшим содержанием фосфорных диэфиров, в частности тейхоевых кислот. Присутствие минерального ортофосфа-та в диализованном щелочном экстракте, по мнению авторов, свидетельствовало о наличии хемосорбированного Р, который не может быть удален из раствора в процессе диализа (Guggenberger et al., 1996а). Недавние исследования показали, что установленная зависимость содержания фосфорных диэфиров в почвах от климатических показателей не является универсальной. Изучение черноземов и каштановых почв естественных травяных экосистем Великих равнин Северной Америки выявило обратную зависимость соотношения Р моно- и диэфиров от градиентов температуры и атмосферных осадков: большее содержание фосфорных диэфиров было характерно для почв с наиболее благоприятными условиями для микробной активности (высокие температуры и достаточное увлажнение) (Sumann et al., 1998). Авторы высказали предположение, что в почвах с высокой биологической активностью могут накапливаться значительные количества фосфорных диэфиров микробного происхождения. Этот вывод подтверждается результатами исследования почв пастбищ в Великобритании, для которых характерна тесная корреляция между содержанием Р ДНК и микробной биомассой (Turner et al., 2003с). Одновременно, изучение черноземов и каштановых почв Русской равнины не выявило зависимости между составом фосфорорганических соединений и климатическими параметрами (Amelung et al., 2001). Исследование профильного распределения отдельных групп органических фосфатов методом 31Р ЯМР спектроскопии впервые выполнено на глубокогуму-сированных камбисолях Галиции, содержащих около 4% С на глубине 60-100 см (Trasar-Cepeda et al., 1989).
Использование 31Р ЯМР спектроскопии для идентификации источников органических фосфатов почвы
Сложности интерпретации результатов 31Р ЯМР спектроскопии, обсужденные в предыдущем разделе, не исключают возможности индикации повышенной микробиологической активности в почвах на основе этого метода. Например, в эксперименте с длительной инкубацией буковой подстилки, повышение содержания фосфорных диэфиров, очевидно, было связано с аккумуляцией микробной биомассы и продуктов микробного метаболизма (Miltner et al., 1998). В другом эксперименте с инкубацией лесной подстилки, был показан переход большей части Рмин в состав органических фосфатов, и отмечена аккумуляция фосфолипидов, кислотораство-римых и щелочерастворимых органических фосфатов (включая инозитфосфаты) микробного происхождения (Mueller-Harvey, Wild, 1986). Микробный синтез Рорг наблюдался также в процессе инкубации почвы, обогащенной РМИн и легкодоступным С (Chauhan et al., 1981). В то же время, неизвестно соотношение в почвенных экстрактах фосфорсодержащих компонентов микробной биомассы и внеклеточных соединений (в частности фосфорных диэфиров), стабилизированных в составе органического вещества почв. Если неизвестно, какая часть диэфиров поступает в экстракт в результате лизиса микробных клеток, а какая из состава почвенного гумуса, то практически невозможно предсказать, какие качественные и количественные изменения в составе органических фосфатов и, следовательно, в характере 31Р ЯМР спектров произойдут в биологически активных почвах. Для оценки перспектив использования 31Р ЯМР спектроскопии для индикации биологической активности почв мы провели серию краткосрочных (3 суток) инкубационных экспериментов (см. раздел 6.2). Изменение содержания РпрЯ и Риин при инкубации почвы Результат инкубирования гумусового горизонта бурой лесной почвы показал, что рост микроорганизмов не был ограничен доступностью Р. После 72 ч инкубации Смикр составлял 1230 мкг г 1 в образцах, инкубировавшихся с добавлением Р и 1280 мкг г"1 - без добавления (различие не достоверно при Р 0,05). Однако концентрация Рмикр при добавлении Р была выше (34 мкг г"1, против 26 мкг г"1 при инкубировании без Р, различие достоверно при Р 0,01). Экстрагируемость Рмин из инкубированных образцов после их обработки СНСЬ была выше при использовании 0,05 М H2SO4 в сравнении с 0,5 М Nal-ЮОз (рН 8.5). Повышение растворимости составило 22 мкг г"1, однако данные по коэффициенту Кр для 0,05 М H2SO4 отсутствуют, поэтому мы не использовали этот результат в расчетах. В принципе, использование кислотной экстракции могло бы упростить процедуру химического анализа Р, поскольку не требует нейтрализации избыточной щелочности.
Однако экспериментальные попытки использования кислоты в качестве экстрагента для определения Рмикр показали нестабильные результаты. По одним данным (McLaughlin et al., 1986), 0,05 М H2SO4 является неудовлетворительным растворителем, а согласно другим (van Veen et al., 1987) 0,1 M H2SO4 экстрагировала более 90% РМИкр, экстрагируемого 0,5 М Nal-ЮОз. Концентрация Р в микробной биомассе составила 1,4% и 1,0% для почвы, инкубированной с добавлением Р и без него, а соответствующие отношения С.Р равнялись 36 и 49. Полученный результат полностью соответствует данным об уменьшении отношения С:Р в микробной биомассе при внесении в почву неорганического ортофосфата (Chauhan et al., 1981; Srivastava, Lai, 1994). В то же время, концентрация Р в микробной биомассе была ниже, отмеченной для почв Великобритании (отношение С:Р 11-36, в среднем 14, Brookes et al., 1984), Индии (С:Р 9-23, Srivastava, Singh, 1988), Германии (С:Р 6-26, в среднем 14, Joergensen et al., 1995), Японии (С:Р 7-16, Kouno et al., 1999). Причиной относительно низкого содержания Р в микробной биомассе в инкубационном эксперименте может быть высокая доступность С вследствие добавления глюкозы. Выраженное влияние доступности С на отношение С:Р в микробной биомассе показано как в лабораторном (Anderson, Domsch, 1980), так и в полевом (Sparling, Williams, 1986) экспериментах. Другая причина может заключаться в преимущественном росте грибной биомассы, отличающейся относительно меньшим содержанием Р. Бурая лесная почва, использовавшаяся в инкубационном эксперименте, исходно содержала 9,9 мг кг"1 Рмин и 27,5 мг кг"1 Рорг, экстрагируемых Nal-ІСОз. Соответствующие концентрации для Р, экстрагируемого H2S04, составили 11,3 мг кг"1 и 12,9 мг кг"1. В NaOH растворялось значительно больше Р (15,4 Рмин и 140,2 мг кг"1 Рорг) (Табл. 13). Кислотная обработка почвы еще более повысила последующее растворение Рмин и Рорг в NaOH (27,5 и 272,1 мг кг 1). Около половины Рорг кислотного экстракта было потеряно в ходе диализа при подготовке образца для 31Р ЯМР спектроскопии. Потеря составила 22% из МаНСОз и всего 7% из NaOH экстрактов, однако экстракт NaOH, полученный после кислотной обработки почвы, потерял 19% Рорг. Концентрация Рмин во всех экстрактах из почвы, инкубированной с добавлением Р, повысилась, однако прирост составил только 40% от добавленного количества Р при экстракции NaHC03+NaOH и 32% при экстракции H2S04+NaOH. После обработки почвы СНС13 экстрагируемость Рмин повысилась, однако 20-30% добавленного Р, так и не было извлечено. Инкубирование почвы без добавления Р понизило концентрацию Рмин в экстракте NaHC03, что свидетельствовало о микробной иммобилизации части лабильного Рмин почвы. Несмотря на значительное количество Р, добавленного в инкубированную почву (60 мг кг"1), микробный рост не привел к заметному повышению содержания Рорг- Более того, содержание Р0Рг, растворимого в NaHC03 и H2SO4, после инкубации снизилось на 2,8-3,6 мг кг"1 (Табл. 13). Поскольку 0,5 М NaHC03 и 0,05 М H2SO4 извлекают лишь небольшую часть Рмикр (см. раздел 7.1), то снижение концентрации Р0Рг в ходе инкубации можно объяснить его микробной иммобилизацией.
Однако после лизиса микробных клеток при обработке почвы CHCI3, количество Рорг повысилось незначительно. Изменения в содержании Рорг во всех экстрактах (включая NaOH), происходящие в результате инкубации и последующей обработки почвы хлороформом, составляли всего около 10% от содержания в почве Рмикр, определенного общепринятым методом. Это может свидетельствовать о значительном потреблении микроорганизмами Рорг почвы (несмотря на высокую доступность Рмин), поскольку столь низкая доля Р0рг в составе РМикр маловероятна. Снижение количества экстрагируемого Рорг на 10% наблюдалось также в процессе длительного (9 месяцев) инкубирования чернозема без добавления С, N и Р; в случае же добавления целлюлозы и N происходило небольшое повышение содержания Рорг, а добавление Р увеличивало его на 15% (Hedley et al., 1982). Очевидно, что в процессе инкубирования почвенных образцов происходит перераспределение лабильного Рорг между почвенным пулом и микробной биомассой в процессах минерализации и иммобилизации. Такое перераспределение может затруднить индикацию компонентов микробного происхождения методом 31Р ЯМР спектроскопии, если качественный состав лабильных фосфатов почвы и микробной биомассы отличается незначительно. Изменение состава Р„ря в результате инкубации 31Р ЯМР спектроскопия (Рис. 12 и 13, Табл. 14 и 15) показала существенные различия качественного состава органических фосфатов, переходящих в разные вытяжки. Лабильные фосфаты, растворимые в МаНСОз, отличаются повышенным содержанием фосфорных диэфиров (Р моноэфиров и диэфиров составляет 34 и 36%, тогда как в экстракте NaOH на долю Р этих соединений приходится 51% и 26%, а в H2SO4 - 56% и 25%), что соответствует результатам, полученным Zhang с соавторами (1999). Разные экстракты различаются также по соотношению Р разных фосфорных диэфиров: в Nal-ІСОз растворяется близкое количество Р ДНК и суммы фосфолипидов и тейхоевых кислот, а в NaOH и, особенно, в H2S04 преобладает Р второй группы соединений. Фосфонаты присутствуют только в NaOH экстракте. Несмотря на высокое относительное содержание Р диэфиров в экстракте NaHC03, на его долю проходится всего немногим более 20% от количества, экстрагируемого NaOH. Следовательно, содержание в почве лабильных органических фосфатов, к которым, безусловно, относятся фосфорные диэфиры, существенно недооценивается при общепринятом их определении по концентрации Р, растворимого в 0,5 М NaHC03. Инкубирование почвы заметно изменило характер спектров №НСОз и H2SO4 экстрактов.
