Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Коллекции растительных объектов in vitro 9
1.1.1. Пересадочные коллекции 9
1.1.2. Депонированные коллекции 10
1.1.3. Использование методов криоконсервации для сохранения генетических ресурсов 13
1.1.3.1. Использование низкотемпературных криобанков для дли тельного хранения генетической информации 1 б
1.1.4. Нерешенные проблемы, связанные с хранением растительных объектов в условиях in vitro 18
1.2. Генетическая стабильность растений при использовании культуры in vitro 22
1.2.1. Сомаклональная изменчивость в культуре клеток, возможные причины ее возникновения 24
1.2.1.1. Генные мутации 25
1.2.1.2. Хромосомные аберрации 26
1.2.1.3. Изменения числа хромосом 36
1.2.1.4. Нарушение коррелятивных связей при изолировании тканей от растения 28
1.2.1.5. Особенности исходного материала 29
1.2.1.6. Условия культивирования 30
1.2.1.7. Длительность субкультивирования 32
1.2.2. Использование сомаклональной изменчивости в селекции 33
1.2.3. Появление уклоняющихся форм в процессе микроклонального размножения земляники 35
1.3. Цель и задачи исследований 42
2. Объекты исследования 44
3. Материалы, методика и условия проведения экспериментов 47
3.1. Состав и приготовление питательных сред 47
3.2. Соблюдение стерильных условий при операциях посадок и пересадок 48
3.3. Условия культивирования 48
3.4. Перевод микроразмноженных растений в нестерильные условия... 48
3.5. Изучение фертильности пыльцы растений земляники 49
3.6. Учеты и наблюдения 49
3.7. Обработка результатов 50
4. Результаты исследований и обсуждение 51
4.1. Влияние длительного хранения in vitro на пролиферирующую способность растений земляники 51
4.2. Поведение эксплантов земляники, прошедших этап длительного депонирования in vitro, на этапе укоренения 61
4.3. Влияние длительного хранения in vitro на приживаемость и частоту появления аномалий у растении-регенерантов земляники на этапе адаптации 66
4.4. Поведение растений земляники различных сортов после длительного культивирования in vitro в полевых условиях
4.4.1. Вегетативная продуктивность растений в первый год высадки... 72
4.4.2. Поведение растений во второй сезон вегетации 80
4.4.2.1. Учет генеративной продуктивности, определение сроков
цветения и созревания плодов 80
4.4.2.2. Изучение фертильности пыльцы 85
4.4.2.3. Изучение урожайности 86
4.4.2.4. Изучение вегетативной продуктивности 91
4.4.2.5. Уклоняющиеся формы у растений земляники в полевых условиях, пестролистность и поражаемость грибными болезнями юі
5. Экономическая эффективность содержания коллекций земляники in vitrо по
Рекомендации производству 113
Выводы 114
Список использованых источников
- Использование низкотемпературных криобанков для дли тельного хранения генетической информации
- Появление уклоняющихся форм в процессе микроклонального размножения земляники
- Соблюдение стерильных условий при операциях посадок и пересадок
- Поведение эксплантов земляники, прошедших этап длительного депонирования in vitro, на этапе укоренения
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время биотехнология - важнейший
инструмент внедрения научных достижений в производство. Исследование процессов жизнедеятельности на клеточном и молекулярном уровнях позволили создать необходимые предпосылки возникновения и быстрого развития современной биотехнологии и ее важнейших направлений -генетической и клеточной инженерии (B.C. Шевелуха, 2000).
Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, отраслей и задач, объединенных в несколько крупнейших блоков. В частности, в растениеводстве можно выделить следующие направления: 1) микроклональ-ное размножение и освобождение от вирусов (P. Boxus et al., 1984; R.A. Drew et al., 1986; B. Borkowska, 2001; Е.Д. Бондаренко, Н.И. Киссель, 2002); 2) создание новых форм растений с помощью методов генной инженерии (G.S. Warren, 1992; А.В. Поляков, 2002); 3) клеточная селекция с использованием сома-клональной изменчивости в культуре in vitro (В.М. Тюленев, 2000; Л.Л. Бун-цевич, В.В. Захарченко, 2002; Е.А. Гладков и др., 2003); 4) сохранение генетических ресурсов культурных и дикорастущих видов и форм растений (К.К. Kartha, 1984; L.A. Withers, 1995).
Использование методов клеточной и генной инженерии открывает большие возможности для генетической реконструкции организмов в желаемых для исследователей направлениях (А. Атанасов, 1993). Но гены, необходимые для таких инженерных манипуляций должны быть надёжно сохранены в виде банка генов. В связи с этим в практической селекции особое значение имеет сохранение генетически ценных образцов.
С другой стороны, для широкой селекционной работы по выведению новых сортов необходимо сохранение разнообразия видов, подвидов, рас и сортов культурных растений и их ближайших диких сородичей, которые могли быть использованы в качестве доноров ценных признаков (морозоустойчивости, зимостойкости, повышенной устойчивости к патогенам и другим неблагоприятным факторам).
Однако в результате хозяйственной деятельности человека происходит постоянное сокращение естественных ареалов дикорастущих форм и видов растений, что приводит к их гибели. Из-за чего человечество рискует не только потерей ценного генофонда растений, но и нарушением экологического равновесия в целом на планете. По данным, опубликованным в научной литературе (Н.Д. Тарасенко, 2000), в результате иррациональной деятельности человека, ежегодно мировое сообщество теряет 400 - 450 видов растений.
Для сохранения разнообразия растительного мира существуют заповедники, ботанические сады и постоянно возобновляемые коллекции живых растений (Н.М. Иркаева и др., 1993; А.Т. Мокроносов и др., 1994; Э.В. Трускинов, Е.В. Рогозина, 1997; Е.И. Назарова, 2002; Т.Г. Яненко, 2002) и семян (банки семян). К сожалению, заповедники, в которых поддерживаются типичные биогеоценозы, не дают полной гарантии сохранения всех видов растений, произрастающих на их территории. В ботанических садах обычно сохраняются только узкие группы растений или отдельные представители (В.Д. Мануильский, А.Д. Шалин, 1992). Кроме того, для создания таких коллекций требуются значительные земельные ресурсы, а также в полевых условиях возрастает риск самоопыления в популяциях и гибридизации с родственными видами, что может привести к генной эрозии или даже к утере специфичности генотипа (И.Р. Рахимбаев, Ю.И. Ковальчук, 1999).
Дальнейшие возможности открывает банк семян (S.D. Stoyanova, 2001). Однако, для вегетативно размножаемых растений, к которым относится подавляющее большинство плодовых и ягодных растений, банки семян неприемлемы.
Ещё большие трудности возникают при необходимости иметь коллекции оздоровленных экземпляров (репозитории), в которых необходимо предусмотреть меры защиты от возможного повторного заражения (В. А. Высоцкий, 2000).
В последнее время для создания и хранения коллекций все шире привлекаются методы биотехнологии (L.A. Withers, 1995; L. Guarino et al., 2001; P.K. Байбурина и др., 2002; CD. Le et al., 2002; G. Casazza et al., 2002). В основу этих методов положена возможность поддержания жизнеспособности пробирочных растений или их отдельных органов в течение длительного времени. Преимущество данного способа состоит в том, что позволяет значительно снизить затраты на оздоровление вегетативно размножаемых растений, обеспечить сохранность их ценных форм, сортов и видов, для создания коллекции не нужно большого количества посадочного материала, площади, она не подвержена действию биотических и абиотических факторов.
Для некоторых видов культура ткани является единственно возможным способом сохранения генетического разнообразия. Однако, здесь также имеются некоторые трудности. Во-первых, время хранения таких растений ограничено, и поэтому правильнее рассматривать коллекции in vitro как дополнение к полевым насаждениям. Кроме того, существует риск потери исходных генотипов из-за генетической нестабильности материала в культуре ткани, возникающей в результате сомаклональных вариаций.
Для решения первой проблемы в настоящее время активно ведется разработка методов длительного хранения пробирочных растений. Большое внимание уделяется поиску оптимального состава питательных сред, температурного режима, освещенности, что позволяет добиться удлинения срока хранения материала. Помимо этого, быстрое развитие в области криоконсервации даёт возможность сохранять растительный материал в течение неограниченно длительного периода, несмотря на сложность этого процесса. Тогда как вопрос о влиянии хранения в условиях in vitro на генетическую стабильность сохраняемых образцов растений остается практически незатронутым.
В связи с этим актуальной задачей является наиболее полное изучение влияния хранения in vitro на стабильность проявляемых признаков, как у
пробирочных растений, так и у полученных из них растений-регенерантов в полевых условиях.
Научная новизна исследований. Впервые было изучено последействие длительного хранения (более 12 лет) растений земляники в условиях in vitro при низких положительных температурах. Изучена пролиферирующая способность на этапе размножения пробирочных растений. Определены способность к образованию корней и параметры развития корневой системы при перемещении эксплантов на среду укоренения. Установлены процент выживаемости при пересадке растений в нестерильные условия, а также основные типы и частота отклонений, возникающих на этапе адаптации.
Изучено поведение растений-регенерантов в полевых условиях. Проведена оценка их вегетативной и генеративной продуктивности. Установлено влияние длительного хранения in vitro на сроки прохождения фенологических фаз (цветения и созревания плодов). Определены качество пыльцы, величина плодов и биологическая урожайность растений. Выявлены основные типы отклонений, а также степень поражения различными болезнями.
Практическая значимость результатов исследований. Наблюдения за растениями, прошедшими этап длительного хранения в условиях пониженных температур, показали относительно высокую стабильность признаков, присущих исходным растениям. Не было обнаружено серьезных нарушений в процессах пролиферации, ризогенеза, адаптации растений к нестерильным условиям, а также значительных отличий между растениями после хранения и недавно введенными в культуру ткани при изучении их поведения в полевых условиях. Замеченные отклонения встречались как в опыте, так и в контроле и примерно с той же частотой. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности включения процесса длительного депонирования in vitro в систему хранения ценных форм, методика регистрации и оценки стабильности проявления признаков может быть рекомендована для аналогичных исследований.
Полученным в результате работы материалом заложены маточные насаждения земляники на лабораторном участке ВСТИСП отделения «Измайлово», а также в СХПК «Племзавод Майский» (Вологодская область).
Результаты работы были доложены на VIII международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (9-13 сентября, 2003, Саратов), на Всероссийской научно-практической конференции «Повышение эффективности садоводства в современных условиях» (22 - 24 декабря 2003, Мичуринск), на международной научно-практической конференции «Ягодоводство на современном этапе» (13 - 15 июля 2004 г., Институт плодоводства Национальной академии наук Беларуси), на международной научно-практической конференции «Мобилизация адаптационного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды» (24 - 26 августа 2004 г., ВСТИСП, Москва), заседаниях учёного совета ВСТИСП, секции ягодных культур учёного совета ВСТИСП. По результатам исследования опубликовано 5 печатных работ.
Использование низкотемпературных криобанков для дли тельного хранения генетической информации
Впервые идея использования низкотемпературной консервации половых и соматических клеток редких и исчезающих видов животных и растений была выдвинута Б.Н. Вепринцевым в 1975 году (B.N. Veprintsev and N.N. Rott, 1979) и доложена на XIV Конгрессе Международного Союза Охраны природы (IUCN) в Ашхабаде в 1978 году.
Он предлагал создать систему генетических криобанков, которая могла бы выполнить роль "Ноева ковчега" для пронесения генетических ресурсов биосферы через экологический кризис. Хотя принципиальной новизны в этом предложении не было (криобиология к этому времени сформировалась как самостоятельное направление исследований) (СИ. Розанов, 1994), предложение Б.Н. Вепринцева не встретило безусловной поддержки. Ее автора упрекали в попытке подменить охрану Живой Природы во всем ее ярком многообразии консервацией генетических ресурсов при температуре жидкого азота в мрачных подземельях криобанков (В.Н. Карнаухов, 1994).
Тем не менее, нашлось достаточное число энтузиастов, сплотившихся вокруг него в неформальный коллектив, ежегодно собиравшийся на рабочие совещания в Пущине. Работами участников этого неформального коллектива, одна за другой решались экспериментальные задачи, связанные с подбором условий криоконсервации. Эти работы дали результаты, подтвердившие реальность практически всех предложенных Б.Н. Вепринцевым приемов . (B.N. Veprintsev, N.N. Rott, 1979; Н.Н. Ротт, Б.Н. Вепринцев, 1981), которые позволяют рассчитывать на восстановление полноценных животных и растений. Достижения в этой области, позволившие ставить вопрос о создании системы генетических криобанков, сведены в докладе Научному Совету США "Создание банков генетических ресурсов исчезающих видов", представленном Д. Уилдтом, У. Ролом и У. Силом в 1990 г.
Несмотря на понятные и известные трудности, за период 1991-1994 гг., коллективу Института биофизики клетки РАН удалось достаточно убедительно показать возможность практической реализации идей, сформулированных Б.Н. Вепринцевым в 1975 году, создать действующий Генетический криобанк редких и исчезающих видов животных и растений. Сейчас в генетическом криобанке создается коллекция редких видов растений (С.Г. Яшина и др., 2003). В коллекции культур тканей растений in vitro представлены 4 вида растений сем. Лилейных: рябчик русский (Fritillaria ruthenica), включенный в Красную книгу РСФСР (1988 г.); рябчик шахматный (F. meleagris), тюльпан Биберштейна (Tiilipa biebersteiniana); лилия саранка (Lilium martagon), вид, одичавший на месте старинных парков.
В настоящее время долговременное хранение растений налажено в 162 ботанических садах мира: там хранится 25683 образца. Наиболее крупный банк находится в Королевском ботаническом саду Кью, там собраны и сохраняются семена 4900 видов растений (12400 образца).
В России долговременное хранение налажено в Главном Ботаническом саду РАН, а также во ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. В ГБС с 1982 года при +5С хранятся семена 490 видов (1390 образцов в герметичных контейнерах). Начиная с 1986 года осуществляется постоянное криосохранение семян в жидком азоте - 230 видов, собранных со всей России от Южных Курил до Балтики. В том числе и родичи культурных растений (15 родов), среди них: плодовые (гранат, облепиха), кормовые (астрагал, эспарцет, чина, клевер и другие), овощные (луки - 8 видов, ревень, хрен, кориандр, тмин и другие) (А.С. Попов, В.Л. Тихонова, 2001).
Таким образом, банк зародышевой плазмы в жидком азоте обеспечивает длительное (десятки лет, а по расчетам некоторых исследователей даже тысячи лет) сохранение генофонда.
Подводя итог обзору известных методов поддержания коллекций in vitro, необходимо отметить предъявляемые им требования, это: - минимальный уход за культурами во время хранения; - возможность регенерации и получения растений-регенерантов; - возможность международного обмена; - экономическая приемлемость хранения; - поддержание удовлетворительного уровня генетической стабильности (Н.П. Дорошенко, Н.А. Хохлова, 1993). Однако при использовании культуры in vitro для сохранения генетических ресурсов возникает ряд сложностей, связанных именно со спецификой самого метода изолированных тканей и органов (J. Keller, 1994). Каждый из упомянутых выше методов содержания растительных образцов в стерильных условиях имеет определенные недостатки.
Появление уклоняющихся форм в процессе микроклонального размножения земляники
В процессе клонального микроразмножения также отмечается появление форм, отличающихся от исходных растений. Однако, в этом случае появление уклоняющихся форм крайне нежелательно. Проведённые наблюдения позволяют выделить три основные категории изменений: генетические, затрагивающие плоидность, а также хромосомные и генные мутации; фенотипические, которые касаются различных морфологических или анатомических характеристик; онтогенетические, возникающие в результате дезорганизации слоев ткани в химерных растениях или спонтанного смешения клеток или групп клеток в ходе инициации адвентивных побегов из различных слоев ткани (В. А. Высоцкий, 1995). Частота появления изменения может существенно колебаться в зависимости от их типа и вида растения (табл. 1.).
Из ягодных культур наиболее полно последействие микроразмножения изучено на землянике. Первые опыты по изучению этой проблемы были проведены в 1974 - 76 годах в Бельгии. Тогда было показано, что растения полученные методом культуры тканей, практически ничем не отличались от оздоровленных растений того же сорта и клона, полученных традиционными методами (P. Boxus, 1981). В Швейцарии, P. Bochud и др. (1981) сравнивали продуктивность растений сортов Горелла и Редгонтлит 1 и 2 поколений растений, полученных в культуре in vitro. Растения сорта Горелла ничем не отличались от традиционных растений, в то время как микроразмноженные растения Редгонтлит давали меньшие плоды и более низкий урожай, чем обычные растения. С. Damiano с соавторами (1983) в своих опытах также использовали растения 1 и 2 поколений растений земляники, полученной из культуры тканей. Сравнивали 4 сорта: Алисо, Белруби, Горелла и Покахонтес, в каждом случае в качестве контроля служили традиционно размноженные растения. Было установлено, что для всех испытанных сортов число усов и побегов на растении значительно больше у вегетативного потомства, полученного из культуры тканей. Микроразмноженные растения сорта Покахонтес и по урожаю, и по величине ягод превосходили контроль. Тогда как потомство растений сорта Горелла давало больший урожай, однако характеризовались меньшим размером ягод и растянутым периодом плодоношения.
О том, что растения, полученные из культуры in vitro превосходят традиционно размноженные по вегетативной продуктивности (на 62-100 %), свидетельствуют и другие авторы (H.J. Swartz et al., 1981; М. Marcotrigiano et al., 1984; J.S. Cameron, J.F. Hancock, 1986). Кроме того, экспериментально установлено, что в условиях длинного (14 часового дня) первые усы появляются у микроразмноженных растений уже через три недели после пересадки в почву. Очевидно, это связано с явлением ювенилизации растений, полученных из культуры тканей.
Однако, в результате исследований, проведенных в 1995-96 годах, появились сведения о том, что растения, полученные в процессе микроразмножения, по вегетативной массе не отличались от контроля (традиционно размноженные растения). В опыте использовались сорта земляники Зенга-Зенгана, Кама и Эльсанта. По числу розеток между контролем и опытом у растений сортов Эльсанта и Зенга-Зенгана не было обнаружено различий в оба года наблюдений. Тогда как у сорта Кама микроразмноженные растения давали розеток на 24 % больше, чем контроль в сроки первой выкопки 10 августа 1995 года, но в поздние сроки выкопки 5 октября 1995 года различий уже не было (Е.К. Lis, D. Chlebowska, 2000).
Таким образом, были получены противоречивые сведения о влиянии микроразмножения на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники. Однако, сейчас известно, что эти показатели можно контролировать, изменяя физические факторы культивирования. Например, условия, при которых обычно происходит микроразмножение земляники (длиннодневный (16 часовой) световой период и температура около 20 С), способствуют выходу растений, обладающих большей способностью к усообразованию и мелкими ягодами. Эти изменения, однако, нестойки и исчезают уже у первого вегетативного потомства таких растений. Поэтому микроразмноженные растения рекомендуют использовать для закладки маточных насаждений. Если же последние стадии микроразмножения проводить при температуре не выше 18 С и 12-часовом дне, то полученные растения формируют плоды гораздо большего размера и в первый год обладают большей урожайностью, чем контрольные (W.D. Naumann, В. Sy-nowski, 1981).
В отношении генетических изменений было отмечено (G.W. Schaeffer et al., 1980), что растения земляники обладают высокой стабильностью генетического статуса. До настоящего времени среди миллионов растений земляники, полученных методами in vitro, было обнаружено только насколько типов мутаций. Это, по-видимому, отчасти объясняется высокой плоидностыо промышленно культивируемых сортов. К числу таких мутаций в первую очередь относится желто-зеленая мозаичность листьев, которая, к примеру, в Бельгии и во Франции регистрируется с частотой приблизительно 1 на 10000 микроразмноженных растений независимо от сорта. Этот вид изменения наблюдается также и при использовании традиционных способов размножения растений земляники и, возможно, с той же частотой.
Соблюдение стерильных условий при операциях посадок и пересадок
В качестве питательной среды для размножения использовали рецепт минеральных солей Мурасиге-Скуга (Т. Murashige, F. Skoog, 1962), дополнительно вводя аскорбиновую кислоту (1,0 мг/л), тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту (по 0,5 мг/л), сахарозу 30 г/л, и агар-агар 7 г/л. В качестве регулятора роста на этом этапе использовали 6-бензинаминопурин (БАП) в концентрации 0,75 мг/л. Уровень рН среды доводили до 5,5 - 5,7. Для введения в культуру использовали ту же питательную среду, снижая концентрацию БАП до 0,3 мл/л, и добавляя р-индолилмасляную кислоту (ИМК) - 0,05 мг/л.
Для укоренения побегов применяли разбавленную в 2 раза по минеральной части среду Мурасиге-Скуга с добавками сахарозы 20 г/л; витаминов в половинных концентрациях и агар-агара 7 г/л. Для индукции кор-необразования питательную среду обогащали ИМК в концентрации 1 мг/л.
Готовую питательную среду в горячем виде разливали по культуральным сосудам (пробиркам, колбам и т.д.). Затем сосуды закрывали алюминиевой фольгой, заворачивали в пергаментную бумагу и автокла-вировали при давлении 1 атм. в течение 18 мин. Простерилизованную среду хранили в операционной комнате не более 10 суток.
Соблюдение стерильных условий при операциях посадок и пересадок Все операции по пересадке материала проводили в специальном помещении с использованием ламинар-бокса в условиях строгой асептики.
Для обеспечения асептических условий работы использовали ультрафиолетовое облучение лампами типа ДБ-30 не менее чем за час до начала работы. Рабочий объём ламинар-бокса стерилизовали также с помощью ультрафиолетовой лампы БУВ-15 в течение 15-30 мин. Необходимые для работы инструменты (скальпели, пинцеты, стаканчики для спирта и другие) стерилизовали в сухожаровом шкафу при 200С в течение 1 часа.
Внутреннюю поверхность ламинар-бокса обрабатывали 96% этиловым спиртом. Инструмент во время работы держали в стаканчике с 96% спиртом и стерилизовали, обжигая в пламени спиртовки.
Воду, фильтры, вату, хирургический халат стерилизовали в автоклаве при давлении 2,0 атм. в течение 1 часа. Стеклянную посуду (пробирки, банки) стерилизовали в сушильном шкафу при температуре 120-140С в течение 5 часов.
Культивирование эксплантов проводили при температуре 23-25С, освещённости 2500-3000 лк и 16 часовом дне. Пересадку на свежие питательные среды проводили, как правило, каждые 6-8 недель.
Перевод микроразмноженных растений в нестерильные условия После этапа укоренения пробирочные растения пересаживали в нестерильные условия. Перед высадкой в грунт растения извлекали из пробирок, отмывали корни от остатков питательной среды водопроводной водой и наносили небольшое количество порошкообразного препарата экост 1/3.
Высадку проводили в пластмассовые горшочки, заполненные торфо-песчаной смесью (3:1), предварительно простерилизованной в сушильном шкафу в течение 4-х часов, при температуре 115С. Растения после посадки сразу же накрывали стеклянными баночками. Этот прием позволял создать оптимальные условия влажности, близкие к условиям культивирования in vitro. Примерно через неделю баночки приоткрывали, затем снимали совсем. Когда растения достигали высоты 10-15 см, разворачивали 3 настоящих листа и формировали хорошо развитую корневую систему, их переводили в условия открытого грунта. Перевод в нестерильные условия осуществляли с марта по июнь.
Закладку маточников земляники проводили по схеме 20x90 см на лабораторном участке ВСТИСП отделения «Измайлово».
3.5.Изучение фертильности пыльцы растений земляники Пыльцу с учетных растений земляники брали в период их массового цветения. Пыльцевые зерна с каждого растения помещали в отдельные целлофановые пакетики. В лаборатории пакетики с пыльцой подсушивали в эксикаторе с силикогелем. Фертильность пыльцы определяли с помощью метода окраски в ацетокармине (В.Н. Юрцев, 1961). Для этого пыльцу помещали на предметное стекло с предварительно нанесенной каплей ацетокармина. Затем просматривали препарат с пыльцой под микроскопом. Фертильная пыльца хорошо окрашивалась ацетокармином, пыльцевые зерна имели правильную форму. Стерильные зерна не окрашивались, они выделялись меньшими размерами и неправильной формой.
Подсчитывали процент пыльцевых зерен, окрашенных в ацетокармине, от общего числа пыльцевых зерен, наблюдаемых в трех полях зрения микроскопа, и принимали его за процент фертильной пыльцы.
Поведение эксплантов земляники, прошедших этап длительного депонирования in vitro, на этапе укоренения
Подобные нарушения отмечали и другие исследователи, так у растений земляники, размноженной методом in vitro, в условиях теплицы, белая штриховатость также была наиболее часто встречаемым отклонением (у сорта Кама -30,8 %, у сорта Зенга-Зенгана - 4,7 %). У сорта Реал 100 % микроразмноженных растений показали признаки белой штриховатости и карликовости (Е.К. Lis, 1997).
Таким образом, полученные данные позволили сделать определенные выводы. Экспланты после длительного депонирования не уступали вновь введенным в культуру тканей в проценте укоренения. Видимо условия хранения не влияли на этот показатель, и по количеству укоренившихся экземпляров разница между вариантами с хранением и контролем была несущественной (за исключением сорта Дукат), тогда как значительными были межсортовые различия, что подтвердила и математическая обработка данных. Однако, дальнейшие исследования показали, что экспланты не подверженные хранению характеризовались более развитой корневой системой о чем можно было судить по таким параметрам как длина и количество корней на эксплант. Аналогичная ситуация была отмечена и в отношении силы роста пробирочных растений. Большим размером побегов характеризовались растения контрольных вариантов по сравнению с теми, которые были подвержены длительному депонированию (за исключением сортов Холидей и Кокинская поздняя). В ходе дальнейших экспериментов выяснилось, что отставание в развитии корневой системы побегов, прошедших этап длительного хранения in vitro, повлекло за собой худшую приживаемость растений из этих вариантов, что также подтвердили математические расчеты.
Подобное поведение эксплантов изученных сортов земляники, подверженных длительному депонированию, можно объяснить следующим образом.
Как известно, условия, в которых находятся растения, при помещении их в среду in vitro специфичны и отличаются от обычных условий существования. Исходя из этого, сами растения претерпевают определенные изменения, которые касаются в первую очередь их анатомического строения и фотосиитетического аппарата. Недостаток света и углекислоты в закрытых сосудах приводит к тому, что фотосинтетическая фиксация ССЬ листьями эксплантов земляники, культивируемых на питательных средах с сахарозой, недостаточна для обеспечения полностью автотрофного питания. В связи с этим скорость фотосинтеза у них снижена в четыре раза, по сравнению с обычными растениями и поэтому преобладает гетеротрофный тип питания. Кроме того, при длительном пассировании в культуре in vitro преимущественное развитие получают растения способные к активной пролиферации.
Таким образом, при длительном культивировании в среде in vitro происходят автоселекционные процессы, направленные в сторону отбора растений с лучшими ростовыми свойствами при заданных условиях, то есть при гетеротрофном питании. Иными словами, растения, помещенные в условия in vitro, подобным образом приспосабливаются к окружающей их среде. При этом вмешательство в этот процесс оператора, отбраковывающего недостаточно выросшие растения, значительно ускоряет отбор растений с хорошими гетеротрофными свойствами. Поскольку фототрофный и гетеротрофный типы питания находятся в конкурентных отношениях, можно предположить, что такой отбор приведет к ухудшению фотосинтетической активности прироста растений и, как следствие, к ухудшению параметров развития при переводе их в условия автотрофного питания. То есть растения, наилучшим образом приспособленные к среде in vitro, проявляют меньшую способность к адаптации в меняющихся условиях окружающей среды, или в конкретном случае, при переводе их в нестерильные условия. Возможно, схожие процессы происходят и у растений, длительно находящихся в условиях in vitro при низких положительных температурах. Несмотря на то, что все усилия направлены на замедление ростовых процессов. Что мы и наблюдали в наших экспериментах.
Учет аномалий на этапе адаптации растений-регенерантов земляники показал, что наиболее часто встречаемыми отклонениями являются белая штриховатость и аномальная морфология листьев, которые были отмечены практически у всех изученных сортов.
Схожие результаты были получены и в других исследованиях (Е. Lis, 1997). У растений земляники, размноженной методом in vitro, в условиях теплицы белая штриховатость также была наиболее часто встречаемым изменением. Степень проявления этой аномалии была различной в зависимости от сорта, и с течением времени происходило ее элиминирование.
В наших экспериментах также было замечено, что проявление белой штриховатости и аномальных листьев нестойко и через определенный промежуток времени исчезает. Таким образом, наблюдаемые нами аномалии были более свойственны растениям на ранних этапах периода адаптации и. некоторые, возможно, такие как, например, однолопастные листья, являлись признаками ювенильности. Подтверждением этому факту служило и то, что после высадки растений в полевые условия мы не наблюдали этих типов отклонений, отмеченных в теплице.
Что касается остальных типов отклонений, то здесь их проявление зависело в большей степени от сортовых особенностей. Например, многоверхушечность была отмечена только у сортов Найдена добрая и Редгонтлит (в варианте с растениями после хранения), пестролистность - у сортов Холидей и Дукат (в варианте после хранения), и частичные хлорозы листьев - у сортов Холидей и Зенит (в обоих вариантах).
Похожие диссертации на Стабильность растений земляники садовой (Fragaria ananassa Duch. ) после длительного хранения in vitro
