Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. 9
1 1 Спектральный состав света как фактор, влияющий на жизнеспособность растений in vitro . 9
1 2 Источники углеродного питания в питательной среде. 17
1 3 Влияние элиситоров на устойчивость растений к болезням и вредителям. 22
1.4. «Искусственные семена» 30
2. Цель и задачи исследований. 45
3 Материалы, объект и методика проведения исследований. 47
4. Результаты экспериментов и обсуждение. 51
4 1 Влияние различных концентраций сахарозы на генеративную и вегетативную продуктивность растений земляники в полевых условиях. 51
4 2 Влияние света различного спектрального состава на развитие эксплантов земляники в культуре in vitro на этапе пролиферации 52
4.3 Влияние различных факторов культивирования in vitro на эксплантов земляники на этапах укоренения и адаптации к нестерильным условиям. 56
4.3.1. Влияние света различного спектрального состава на развитие эксплантов земляники на этапе укоренения in vitro. 56
4 3 2 Влияние элиситоров на жизнеспособность эксплантов земляники при клональном микроразмножении in vitro. 62
4 4 Влияние света различного спектрального состава и элиситоров на генеративную и вегетативную продуктивность растений земляники в полевых условиях 66
4.5. Создание «искусственных семян» земляники . 86
5. Экономическая эффективность. 99
6. Выводы.
7 Рекомендации для практического использования. 104
8. Список использованной литературы. 106
Приложения. 132
- Спектральный состав света как фактор, влияющий на жизнеспособность растений in vitro
- «Искусственные семена»
- Влияние света различного спектрального состава на развитие эксплантов земляники в культуре in vitro на этапе пролиферации
- Создание «искусственных семян» земляники
Введение к работе
Актуальность темы. Земляника садовая является наиболее рентабельной ягодной культурой, однако в настоящее время остро стоит вопрос закладки промышленных насаждений сертифицированным высокопродуктивным материалом в достаточном количестве. Как известно, важная роль в оздоровлении и тиражировании растительного материала в промышленных масштабах принадлежит биотехнологическим методам, благодаря которым поддерживается современный сортимент земляники садовой.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что среди факторов культивирования наибольшее значение имеют: спектральный состава света, состав питательной среды (тип и концентрация углеводов, регуляторов роста и элиситоров), температура, которые оказывают влияние на рост и развитие растений в условиях in vitro и в период адаптации к нестерильным условиям.
Вместе с тем последействие этих факторов на поведение растений в полевых условиях изучено недостаточно, имеющиеся в литературе единичные сведения по этому вопросу не раскрывают взаимосвязи между факторами культивирования in vitro и дальнейшей продуктивностью растений в условиях in vivo.
Все вышесказанное обуславливает необходимость изучения влияния света различного спектрального состава, углеводов и элиситоров, применяемых in vitro, на рост и развитие растений земляники in vitro и их генеративную и вегетативную продуктивность в полевых условиях.
Перспективным направлением в области биотехнологии является создание «искусственных семян» и разработка оптимального состава оболочки, которая обеспечивала бы длительное хранение инкапсулированных эксплан-тов земляники в жизнеспособном состоянии.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучение влияния различных факторов культивирования in vitro (спектрального состава света, элиситоров, различных концентраций сахарозы в питательной среде) на веге-
тативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях; а также изучение возможности создания, хранения и высадки в нестерильные условия «искусственных семян» земляники.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
выявить влияние спектрального состава света и элиситоров (эмистима, арахидоновой кислоты и Экоста 1/3) на жизнеспособность растений земляники на этапах пролиферации, укоренения и адаптации к нестерильным условиям;
изучить последействие спектрального состава света, элиситоров (эмистима, арахидоновой кислоты и Экоста 1/3) и сахарозы на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях;
установить оптимальные параметры изучаемых факторов культивирования (спектрального состава света, элиситоров и концентрации сахарозы) для адаптации к нестерильным условиям и последующего роста и развития растений земляники в полевых условиях;
разработать методику инкапсулирования развившихся in vitro почек земляники, микропобегов и их фрагментов для создания «искусственных семян» и оценки их жизнеспособности.
Научная новизна результатов исследований. Впервые показано, что различные факторы культивирования in vitro (сахароза, спектральный состав света и элиситоры) оказывают существенное влияние на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях.
Определены оптимальные параметры культивирования in vitro для ускорения выхода полноценных растений земляники различных сортов.
Впервые показана возможность инкапсулирования почек и микропобегов земляники в «искусственную оболочку», хранения полученных «искусственных семян» в условиях пониженных температур в течение месяца и высадки в нестерильные условия.
Основные положения, выносимые на защиту:
влияние факторов культивирования in vitro (спектрального состава света, элиситоров, сахарозы) на жизнеспособность растений земляники in vitro и их продуктивность в полевых условиях;
влияние взаимодействия факторов культивирования in vitro на продуктивность растений земляники в полевых условиях;
экономическая оценка эффективности применения экспериментальных источников освещения эксплантов земляники in vitro на показатели вегетативной продуктивности растений в полевых условиях;
4) возможность создания «искусственных семян» земляники.
Практическая значимость результатов исследований. Освещение
эксплантов земляники на этапах культивирования in vitro лампами с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра позволяет управлять процессами роста и развития, сократить продолжительность этапа ризогенеза и увеличить выход растений.
Использование элиситоров эмистима, арахидоновой кислоты и Экоста 1/3 повышает процент укоренения растений и сокращает длительность этапа ризогенеза.
Обогащение питательной среды повышенной концентрацией сахарозы (6%) способствует увеличению вегетативной продуктивности растений земляники в полевых условиях.
Разработанная модель создания «искусственных семян» земляники может являться основой для дальнейших исследований в данной области с целью увеличения периода хранения инкапсулированных почек и миропобе-гов и усовершенствования состава оболочки для непосредственного высева в полевых условиях.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на X и XI Молодежных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 7 апреля 2010 г. и 6 апреля 2011 г.), III Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 11-13 но-
ября 2009 г.); представлены на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (г. Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.); II Всероссийской научно-практической конференции «Биология как инструмент биоразнообразия растительного мира» (г. Волгоград, 19-21 августа 2008 г.); на научно-практической конференции «Интенсификация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений» (г. Орел, 6-8 октября 2009 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы размножения садовых культур и пути их решения» (ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина, Мичуринск-Наукоград, 2010 г.), XIX Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниоло-гия. Экология и здоровье» (г. Алушта, 12-19 сентября 2010 г.), Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (г. Москва, 21-25 марта 2011 г.); на Международной научно-практической конференции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве» (г. Москва, 22-23 июня 2011 г.); на Международной научной конференции «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (г. Нижний Новгород , 4-10 июля 2011г., ННГУ им. Н.И. Лобачевского,); на VII Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (г. Минск, 26-28 октября 2011г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и содержание работы: Диссертация изложена на 148 страницах и состоит из введения, обзора литературы по изучаемому вопросу, выводов и рекомендаций по практическому использованию, списка литературы из 231 наименования, в том числе 133 - зарубежных авторов, содержит 19 таблиц, 26 рисунков и 13 приложений.
Спектральный состав света как фактор, влияющий на жизнеспособность растений in vitro
Известно, что в среднем листья растений поглощают 80% энергии фотосинтетически активных лучей солнечного спектра (400-700 нм) и 25% энергии инфракрасных лучей, что составляет около 55% от энергии общей радиации. На фотосинтез расходуется 1,5-2% поглощенной энергии (В.В. Полевой, 1989). Обширные исследования влияния света разного спектрального состава на растения были проведены Н.П. Воскресенской. Полученные ею результаты указывают на то, что спектральный состав света может являться мощным регулятором обмена веществ и продуктивности высших растений, а также, создавая преимущественные условия для образования определенных метаболитов, влиять на морфогенез растений (Н.П. Воскресенская и др., 1965, 1975).
Следует отметить, что влияние спектрального состава света на показатели жизнеспособности растений в культуре in vitro, а также после высадки в нестерильные условия недостаточно изучено, а имеющиеся в литературе данные порой носят противоречивый характер. F. Loreti объяснял различие в морфогенетической реакции растений в культуре тканей на облучение определенным участком спектра в первую очередь степенью дифференциации тканей и органов (F. Loreti, 1991). Так, освещение синим светом вызывало образование побегов у каллуса табака (М. Seibert, 1975), а образование корней у топинамбура происходило интенсивнее при освещении красным светом (R. Letouze, 1969). Красный свет стимулировал образование корней у эксплантов табака при наличии ПУК в питательной среде (Т.Н. Константинова, 1987). Под влиянием синего света лучше всего развивалась надземная масса и корневая система вишни и голубики (В. Barkiwska, 1994). В опытах, проведенных на винограде, было показано, что при освещении растений красным светом можно достигнуть высокого процента укоренения микропобегов (R. Chee, 1989).
Н.Н. Протасова изучала влияние облучения люминесцентными лампами с преобладанием излучения в области красного, синего и зеленого участков спектра на морфофизиологические параметры растений салата (Lactuca saliva L.), редиса {Raphanus sativus L.), перца сладкого {Capsicum annuum L.), подсолнечника {Helianthus annum L.) и левзеи сафлоровидной {Rliaponlicum cariliamoides Wild.) в условиях фитотрона. Ею было показано, что облучение красным светом с максимумом излучения в области 640-670 нм способствовал интенсивному росту листьев и осевых органов у всех испытываемых растений. Синий свет сдерживал рост стебля и площадь листьев что приводило к формированию растений с низкой продуктивностью. При облучении зеленым светом (максимум излучения 520-550 нм) формировались тонкие листья с меньшим числом клеток, хлоропластов, продуктивность растений была низкой. На основании полученных результатов автор рекомендовала следующее соотношение спектрального состава света в люминесцентных лампах: 25-30% - в синей области (380-490 нм), 20% - в зеленой (490-590 нм) и 50% - в красной области спектра (600-700 нм) (Н.Н. Протасова, 1987).
Исследования Л.В. Алексеенко, В.А. Высоцкого (2000), посвященные влиянию спектрального состава света на ризогенез эксплантов земляники нейтральнодневных и ремонтантных сортов показали, что реакция на облучение светом различного спектрального состава носит сортоспецифический характер. Так, у сорта Тристар количество корней у эксплантов на синем свету было больше, чем на красном, зеленом и белом, для сорта Трибьют предпочтительнее оказался красный свет, микропобеги сорта Редгонтлет образовывали наибольшее количество корней на синем зеленом свету. Было выявлено, что культивирование побегов при облучении красным и синим светом позволило существенно ускорить образование корневой системы у сортов Тристар, Трибьют, Профьюжен и Редгонтлет. Авторы рекомендуют культивировать экспланты земляники на этапе укоренения на синем и красном свету для более быстрого перевода их в нестерильные условия.
Опыты по изучению влияния красного люминесцентного излучения низкой интенсивности позволили сделать вывод о его регуляторном действии на состояние гормонального баланса растений. В свою очередь, изменения в соотношении гормонов, стимуляторов и ингибиторов роста, приводили к различиям в скорости ростовых реакций и продуктивности растений (А.С. Минин и др., 2006).
Р.П. Евсеева, Л.В. Осипова (1998) изучали влияние состава питательной среды и когерентного излучения лазера на развитие эксплантов земляники in vitro и выявили, что лазерное излучение при экспозиции 15 и 240 секунд увеличивает облиственность эксплантов земляники на среде Уайта-Хеллера. На среде Уг Мурасиге-Скуга при экспозиции 15 секунд увеличивалась длина корней. Экспозиция 240 секунд способствовала дополнительной закладке корней на среде Уайта-Хеллера. При этом лазерное облучение не оказывало заметного влияния на среднюю длину побега.
В ходе многочисленных исследований установлено, что свет различного спектрального состава влияет на гормональный баланс листа растения. Сложная система светового контроля за процессами роста листа и растения в целом основана на ее взаимодействии с различными группами фитогормонов. При этом в работу вовлекается ряд фоторецепторов. Показано, например, что в сегментах листьев ячменя, облученных красным светом фитохром способствует повышению активности гиббереллинов. Действие красного света вызывало одновременно раскрывание листьев. Обнаружено аналогичное влияние этого участка спектра на листья пшеницы. Р.А. Карначук с соавторами (1990) исследовали влияние спектрального состава света на этиолированные проростки овса, при этом учитывался баланс гормонов в тканях листьев. Результаты показали, что свет отдельных участков спектра по-разному воздействует на содержание гиббереллинов, (3-индолилуксусной кислоты (ИУК), рибозида зеатина и абсцизовой кислоты (АБЮ в тканях первого листа овса при его деэтиоляции. Красный свет, в отличие от синего и зеленого, снижал как активность, так и содержание ИУК, увеличивая уровень активности гибберелловых кислот.
Как уже отмечалось, при клональном микроразмножении большое влияние на микрорастения оказывает интенсивность освещения. На первых этапах микроразмножения in vitro оптимальная интенсивность освещения для большинства растений составляет 1000-3000 лк. Оптимальная продолжительность освещения обычно составляет 14-16 ч в сутки, для 16 ч, однако она может меняться в зависимости от вида "ЛЯ РТРТЇТТЯ Применяют также чередование коротких периодов темноты с последующим продолжительным освещением (ВТ. Трушечкин и др., 1972; СЕ. Щелкунова, 1973; Н.И. Туровская и др., 1990). Как было показано в опытах С.А. Хаповой (1997), реакция эксплантов земляники на условия светового режима при культивировании in vitro зависела от сортовых особенностей.
При подготовке микрорастений к адаптации к нестерильным условиям интенсивность освещения, как правило, увеличивают до 10000 лк. Высокая интенсивность света может задерживать рост растений и вызывать на небольшие хлорозы, тем не менее, эти растения в почве чувствуют себя значительно лучше и растут более энергично, чем растения, не перенесшие предварительной адаптации к высокой интенсивности света (Т. Murashige, 1977).
«Искусственные семена»
Проблема длительного хранения генетического материала растений занимала ученых с давних пор. Ее решением может стать сохранение меристемы при помощи криоконсервации, и определенные шаги в этом направлении уже сделаны зарубежными учеными на некоторых культурах, в том числе на примере земляники садовой. Например, проведены опыты по хранению инкапсулированных в альгинате натрия меристем земляники (Fragaria х ananassa Duch.) в жидком азоте при -196С. Меристемы были извлечены из растений, хранившихся в течение 2-х недель при 4С в темноте, инкапсулированы в альгинат натрия, содержащий 2 М глицерина и 0,4 М сахарозы, обезвожены в сильно концентрированном витрификационном растворе в течение 2-х часов при 0С и помещены в жидкий азот с температурой -196С. Меристемы оставались зелеными и приблизительно 90% из них успешно развились в побеги в течение одной недели после посадки на питательную среду. Было отмечено, что инкапсулированные верифицированные меристемы, охлажденные азотом до -196С, обладали более высокой побегообразовательной способностью по сравнению с инкапсулированными высушенными меристемами и вторичный рост у них наступал раньше последних (D. Hirai et al., 1998).
На современном этапе развития науки технология производства «искусственных», или «синтетических семян», рассматривается как новый перспективный метод размножения и хранения различных коммерчески ценных видов и сортов растений. Работа в этом направлении ведется зарубежными учеными с 80-х гг. XX в., интерес к данной технологии постоянно растет (S.L. Kitto, 1980; К. Redenbaugh et al., 1984; 1986; 1987; 1990; D.A. Stuart et al., 1987; Z.S. Wochok, 1987; D.J. Gray et al., 1987, 1991; F. Liu et al., 1991; B.D. Me Kersie et al, 1989, 1990, 1993; G. Zhongehen et al, 1993; B. Ghosh et al, 1994; J.V. Norgaard, 1994; G. V. Padmaja et al, 1995; A. Bapat et al, 1988, 1990, 1992; и другие) и к настоящему моменту достигнуты определенные успехи, хотя ряд проблем остается нерешенным.
Существует несколько способов создания «искусственных семян»: с помощью биореакторов (8. Mehrotra et al., 2007), используя соматический эмбриогенез, инкапсуляция верхушек меристематических зон корней и корневищ, инкапсуляция апексов побегов. Чаще всего для производства «искусственных семян» используют соматические эмбрионы, обладающие, подобно природным семенам, зародышевым корешком и почкой с зародышевыми листьями, которые могут развить корень и побег (К. Redenbaugh, 1993 Ь).
Соматические зародыши представляют собой биполярные структуры с апикальной и базальной меристематическими областями, которые способны к формированию побега и корня соответственно. Структурно они похожи на зиготические зародыши, обладают многими их полезными качествами (способны к длительному хранению, переносят высушивание, пригодны для высева в почву сеялками), и могут развиваться в полноценные растения. Соматические зародыши возникают из соматических клеток без образования зиготы как продукта слияния мужских и женских половых гамет, то есть они представляют собой копию одного генотипа, что может быть использовано в генной инженерии (внедрение определенных генных последовательностей в соматическую клетку) (Ю.В. Чесноков, 2006).
Широкому применению соматического эмбриогенеза для получения «искусственных семян» в промышленных масштабах препятствует ряд трудностей:
1) ограниченное производство жизнеспособных эксплантов, пригодных для создания «искусственных семян»;
2) аномальное и асинхронное развитие соматических эмбрионов;
3) неправильное созревание соматических эмбрионов, в результате чего они не способны прорастать и превращаться в нормальные растения;
4) отсутствие периода покоя и устойчивости к стрессовым факторам препятствует хранению «искусственных семян» в течение длительного промежутка времени в жизнеспособном состоянии;
5) даже внешне нормально созревшие соматические эмбрионы плохо прорастают в нормальные растения, что существенно снижает их ценность.
Технология создания «искусственных семян» требует надлежащего контроля над процессом соматического эмбриогенеза от экспланта до возникновения эмбриона, а также за последующим развитием и созреванием эмбриона. Зрелые соматические эмбрионы должны прорастать из капсулы и формировать нормальные жизнеспособные растения. Ряд исследователей занимается изучением условий для оптимального развития соматических эмбрионов (Z. Cheng et al.,1992; Y.E. Choi et al., 1997, 2002; C.-M. Liu et al., 1993; M. Adriani et al., 2000). Они указывают на то, что причиной аномального развития эмбрионов могут стать клеточные деления в меристематических областях апексов побегов и семядолей до дифференциации клеток, вызываемые действием антиауксинов на полярный транспорт ауксинов. Незрелые зиготические эмбрионы, извлеченные из природного семени и помещенные в асептические условия на питательную среду, также могут пойти по пути аномального развития (К. Norstog, 1965).
Вопросу улучшения качества искусственной оболочки «синтетических семян» посвящено достаточно большое количество работ в основном зарубежных авторов.Ряд исследователей пытались улучшить качество (S. М. Attree et al., 1991, 1993, 1995; Н. Y. Wetzstein, 1993) и количество (Н. Ага et al., 1998; W.A. Parrott et al, 1988; C. H. Michler et al., 1991) соматических эмбрионов путем модификации условий культивирования (состав питательной среды, тип и концентрация регуляторов роста, физическое состояние среды, температура, свет и т.п.). S.L. Kitto c соавторами (1980) использовали водорастворимую полиэтиленовую смолу - полиокс (polyox WSR-N750) - в качестве материала для оболочки соматических зародышей моркови, апельсинов, сельдерея.
В 1984 г. К. Redenbaugh с коллегами развили и представили технологию инкапсуляции соматических эмбрионов люцерны в индивидуальную гидрогелевую капсулу, а затем опробовали много субстанций для изготовления «искусственных семян», таких как агар-агар, агароза джерлит, альгинат, желатин и пектин. Они первые предложили использовать раствор альгината кальция в результате ионообменной реакции для получения оболочек «искусственных семян». При этом было установлено что альгинат нетоксичен для зародышей и не препятствует водному и минеральному обмену между «искусственными семенами» и окружающей средой. Люцерна и сельдерей были первыми видами растений, «искусственные семена» (то есть покрытые альгинатом зародыши) которых прорастали в нестерильных условиях с частотой соответственно 7 и 10%; в стерильных условиях частота прорастания «искусственных семян» люцерны достигала 86%. Низкая температура и высушивание могут ингибировать прорастание «искусственных семян» моркови и сохранять их способность к выживанию. Для предотвращения потери воды К. Redenbaugh протестировал несколько материалов, формирующих гидрофобный слой на поверхности «искусственных семян». Сегодня наилучшим материалом для этих целей считается этиленвинилацетаткислотныи терполимер (Elvax 4260, DuPont Co.) (К. Redenbaugh et ah, 1984; 1986; 1987).
G.V.S. Saiprasad (2001) протестировал насколько гелей (агар-агар, альгинат натрия, полико 2133 (Bordon Со.), карбоксиметилцеллюлоза, carrageenan, gelrite (Kelko. Со.), гуаргум, пектат натрия, tragacanth gum) и установил, что наиболее удобным и практичным в использовании был альгинат натрия. При этом автор отмечал, что агар-агар уступал альгинату натрия по способности капсул выдерживать длительное хранение. Альгинат натрия способствовал лучшему формированию капель и обеспечивал защиту инкапсулированных соматических эмбрионов. Принцип инкапсулирования заключен в том, что капли альгината натрия, содержащие в себе соматические эмбрионы, погружают в раствор дигидрохлорида кальция и между реагентами происходит ионный обмен. Прочность капсулы зависит от количества ионов Na+, обмененных с ионами Са2+. В опытах G.V.S. Saiprasad реакция между 3%-ным альгинатом натрия и 75 мМ СаСІ2 2H20 в течение 30 мин обеспечивала оптимальную прочность капсулы.
Влияние света различного спектрального состава на развитие эксплантов земляники в культуре in vitro на этапе пролиферации
Из литературных данных известно, что свет различного спектрального состава влияет на жизнеспособность растений в культуре in vitro (R.H. Zimmerman, 1984; F.A. Hammerschlag et al., 1987; P.A. Карначук и др., 1990; E.K. Спринчану, 1990; G. Bertazza et al., 1995; B.A. Высоцкий, 1998; Л.B. Алексеенко и др, 2000; М.Т. Упадышев, 1992, 2000; А.Л. Немойкина, 2003; D.T. Nhut et al., 2003; А.А. Соболев, 2004; И.Б. Минин, 2005; А.С. Минин и др., 2006, А. Kurilcik et al., 2008; Н.-С. Hsu et al., 2010). Было замечено также, что даже различные сорта одного и того же вида растения специфически отзываются на факторы культивирования, поэтому сорт можно выделить как отдельный фактор при анализе полученных данных. Очевидно, это объясняется различием в экспрессии генов, отвечающих за параметры жизнеспособности эксплантов в искусственных условиях. Нами было отмечено, что действие различных участков спектра наиболее отчетливо проявлялось на ранних этапах культивирования, а при длительном нахождении на искусственной питательной среде растения с разных вариантов света становились идентичными.
Результаты экспериментов представлены в таблицах 1-8. Наименьшая существенная разность (НСР) была рассчитана для каждой отдельной пары вариантов, поскольку количество повторностей в каждом варианте было различным. В графе «Существенность различий» в скобках указано, для какой пары вариантов рассчитано значение НСР.
Согласно данным таблицы 1, микропобеги земляники сорта Амулет в варианте с синим светом были существенно короче, чем в других вариантах. Этот эффект наблюдали через 20 дней культивирования. Мы отметили, что освещение эксплантов красным светом способствовало существенному увеличению у них числа листьев по сравнению с другими вариантами освещения. Число листьев у эксплантов земляники сорта Пурпуровая, облученных лампами с преобладанием излучения в красной области спектра, было существенно больше, чем в контроле, что проявилось через 10 дней культивирования. Через 20 дней эти различия нивелировались.
Экспланты земляники сорта Профьюжен, освещенные синим светом, были существенно выше контрольных. Облучение красным светом споеобствовало существенному увеличению числа листьев у микропобегов по сравнению с остальными вариантами.
Эксперимент по влиянию спектрального состава света на биометрические показатели эксплантов земляники сорта Редгонтлет на этапе пролиферации был продублирован спустя 2 месяца культивирования. Это позволило представить рост и развитие эксплантов в динамике (таблица 2).
Существенные отличия (на 1%-м уровне значимости) между вариантами по высоте экспланта отмечены в первом субкультивировании. По числу листьев варианты не отличались. После перенесения растений на свежую питательную среду отличия по высоте между растениями, выращенными с использованием различных режимов освещения, нивелировались. Показано, что на красном свету рост растений сорта Редгонтлет сдерживался, а влияние синего света на размер эксплантов было идентично белому.
На этапе пролиферации мы наблюдали спонтанное укоренение растений (данные представлены в приложении 3).
Варианты: 1- белый свет, 2-красный свет, 3-синий свет. Неоднозначное влияние спектрального состава света на ростовые процессы у разных видов растений были отмечены другими исследователями (Н.А. Кузьмина и др., 2001). Облучение различными участками спектра проростков пшеницы и каллусной ткани показало, что красный и синий участки спектра были благоприятны для ростовых процессов проростков, однако при формировании массы каллусной ткани синий свет производил ингибирующий эффект. Для накопления хлорофилла благоприятной оказалась красная часть спектра, но ее было недостаточно для процессов биосинтеза, так как интегральный свет улучшал их почти в 2 раза. Ученые предполагают, что при гетеротрофном питании растительных клеток (культивирование in vitro) закономерности ростовых процессов при варьировании световых условий могут меняться по сравнению с интактными растениями в связи с тем, что для растения свет - источник углерода, образуемого в процессе фотосинтеза, а каллусные клетки используют уже готовый органический углерод. В своих экспериментах мы использовали экспланты, у которых был смешанный тип питания: часть углеводов они синтезировали сами за счет образующихся листьев, а часть готового органического углерода поступала из питательной среды.
Создание «искусственных семян» земляники
Технология создания «искусственных», или «синтетических семян» имеет ряд преимуществ перед остальными методами размножения растений: значительно упрощает процесс хранения и передачи растительного материала; позволяет подвергнуть пропагулы в «искусственной» оболочке криоконсервации; дает возможность механизированного посева «искусственных семян» растений в почву.
Как показывает анализ литературных данных, в настоящий момент исследователи работают над изучением возможности хранения «искусственных семян» в обезвоженном состоянии, испытывают различные компоненты питательных сред, способные повлиять на длительное хранение капсул. Комплекс разработанных приемов и методов создания «искусственных семян» позволит упростить этап адаптации к нестерильным условиям, хранение и транспортировку, а также сократить затраты на 15-20%, и снизить себестоимость размноженных растений.
В качестве исходного материала исследователи чаще всего используют соматические эмбрионы. Для некоторых трудно размножаемых культур соматический эмбриогенез становится единственным способом размножения, однако при его использовании возникает ряд проблем: во-первых, низкий процент выхода полноценных жизнеспособных эмбрионов, во-вторых, низкая степень выживания «искусственных семян» после их получения и хранения. Все это затрудняет получение «искусственных семян» и удорожает их производство.
Объектом для инкапсуляции могут служить микропобеги, почки, протокорм-подобные тела, которые имеют ряд преимуществ: их относительно проще получить, и они обладают большей генетической стабильностью по сравнению с соматическими эмбрионами, полученными из каллусных клеток. Поэтому использование микропобегов, почек и других органов в качестве «искусственного зародыша» предпочтительнее для тех культур, у которых их получение не вызывает затруднений.
Практически технология создания «синтетических семян» из микропобегов и почек выглядит следующим образом:
1) размножение in vitro растений, полученных из апексов побегов, что обеспечивает сортовую чистоту растительного материала;
2) подготовка растительного материала к изолированию апексов, которые впоследствии будут использованы для формирования «искусственных семян»;
3) разработка состава оболочек «искусственных семян»;
4) разработка методов хранения и транспортировки «искусственных семян»;
5) приемы высева в почвенные субстраты;
6) маркетинг и сбыт.
Разработка технологии получения «искусственных семян» земляники.
Исходный материал. Объектом наших исследований являлась земляника садовая {Fragaria х ananassa Duch.) сортов Роксана, Покахонтас и Дивная. Поскольку в культуре тканей у земляники не возникает проблем с размножением, мы использовали микропобеги в качестве исходного материала для инкапсулирования.
Экспланты земляники сорта Роксана в рекогносцировочном опыте подготавливали на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга с пониженным содержанием цитокининов (БАП - 0,2 мг/л) и повышенной концентрацией сахарозы (6%) (рисунок 17). Перед инкапсулированием микрорастения выдерживали при температуре 6С в течение 14 дней. В этих условиях растения находились в стадии вынужденного покоя, рост замедлялся, это способствовало накоплению растительными тканями питательных веществ и лучшей подготовке к инкапсуляции.
Приготавливали два рабочих раствора для инкапсулирования.
Первый раствор содержал 0,1 М 20%-ного хлорида кальция, растворенного в бидистиллированной воде. Состав второго раствора: соли по Мурасиге-Скугу: макросоли - 50 мг/л, микросоли - 5 мг/л, хелат железа - 10 мг/л, витамины (тиамин - 0,5 мг/л, пиридоксин - 0,5 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота - 1 мг/л, глицин - 2 мг/л), БАП - 0,25 мг/л, ИМК - 0,0025 мг/л, рН=5,5-5,6; альгинат натрия - 30 г/л.
Предметом исследования являлась сахароза, добавленная во второй раствор в концентрации 3% (30 г/л, контроль) и 6% (60 г/л, опыт).
Приготовление питательной среды. В качестве субстрата для проращивания «искусственных семян» земляники использовали питательную среду Мурасиге-Скуга для размножения следующего состава: макросоли - 50 мг/л, микросоли - 5 мг/л, хелат железа - 10 мг/л, витамины (тиамин - 0,5 мг/л, пиридоксин - 0,5 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота - 1 мг/л, глицин - 2 мг/л), БАП - 1 мг/л, ИМК - 0,01 мг/л, рН=5,5-5,6; агар-агар - 9 г/л.
Сахарозу не добавляли, поскольку она входила в состав капсул.
Техника инкапсулирования.
Вычленение апексов микропобегов происходит в условиях стерильного бокса под бинокуляром. Выделенные пропагулы погружали в стаканчик с раствором альгината натрия. Затем альгинатную каплю переносили при помощи микропипетки с диаметром наконечника, подобранного под размер капсулы, в раствор 20%-ного хлорида кальция, время экспозиции в котором составляло 10-15 минут, раствор периодически перемещивали (рисунки 18, 19). Между альгинатом натрия и хлоридом кальция происходила ионообменная реакция, в результате которой альгинатные капли с помещенными внутрь эксплантами покрывались плотной оболочкой, служащей искусственным аналогом природному эндосперму семени. Далее готовые капсулы извлекали из раствора пинцетом и помещали в чашки Петри с питательной средой Мурасиге-Скуга для размножения. Изучали приживаемость «искусственных семян» на питательной среде в зависимости от концентрации сахарозы, входящей в состав капсулы. Результаты учета, проведенного через 7 дней после посадки, представлены в таблице 14 и на рисунках 20 а, б,21,22.
Таким образом, в результате работы из «искусственных семян» земляники сорта Роксана мы получили растения, готовые к адаптации к нестерильным условиям.
Далее на основании разработанной методики мы изучали возможность хранения «искусственных семян» при пониженной температуре и проращивания их в почвенном субстрате. В опыте были использованы сорта земляники Покахонтас и Дивная. Часть растительного материала была предоставлена О.Н. Высоцкой (Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева) и отличалась тем, что растения культивировались на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей паклобутразол (ПК) в концентрации 1мг/л. Паклобутразол - системный ретардант, обладающий также фунгицидными свойствами. Как ретардант активен на ряде плодовых древесных, зерновых и декоративных культур. Выпускается в виде препарата «Культар» (альтернативные названия - клиппер, парлей). Являясь ингибитором синтеза гиббереллина, паклобутразол укорачивает побеги, уменьшает или устраняет потребность в обрезке, увеличивает образование плодовых почек, улучшает качество плодов, уменьшает полегание зерновых. В некоторых случаях повышает морозостойкость растений. В культуре тканей паклобутразол используют для подготовки микрорастеыий к холодовому стрессу (http://www.cnshb.ru/AKDiL/0034/base). Мы испытывали его влияние на сроки хранения «искусственных семян» при пониженной температуре.
Часть растений сорта Покахонтас из коллекции Л.В. Алексеенко (отдел биотехнологии) была подготовлена на специальной среде Мурасиге-Скуга, обогащенной сахарозой в концентрации 60 г/л и БАЛ в концентрации 0,2 мг/л (МС + сахароза +БАП). В данном эксперименте предметом исследования являлись: состав питательной среды для подготовки эксплантов земляники к инкапсуляции (МС + сахароза + БАП - 1-й вариант, МС + паклобутразол - 2-й вариант) и холодовая обработка «искусственных семян».
Раствор альгината натрия, в который погружали экспланты, содержал сахарозу в концентрации 3% (30 г/л), так как по результатам первого опыта мы сделали вывод, что увеличение концентрации сахарозы в растворе альгината натрия существенно не повлияло на повышение приживаемости «искусственных семян». Время экспозиции альгинатных капель в растворе хлорида кальция было увеличено до 20 мин.
«Искусственные семена» земляники сортов Покахонтас и Дивная поместили в закрытых чашках Петри в холодильник при температуре +2...+4С на 30 дней (рисунок 23). По истечении этого срока их извлекли из холодильника и адаптировали к нестерильным условиям теплицы по стандартной методике (В.Г. Трушечкии и др., 1987). Изучали влияние состава питательной среды, на которой микрорастения готовились к инкапсуляции, на приживаемость, сроки хранения и прорастание «искусственных семян» земляники в почве. Результаты эксперимента представлены в таблицах 15, 16 и на рисунках 24, 25.
Похожие диссертации на Факторы культивирования in vitro и их влияние на рост и развитие растений земляники in vitro и in vivo
