Введение к работе
Актуальность исследований. Y-вирус картофеля (YВК) широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих культуру картофеля. Инфицирование YВК приводит к снижению урожайности на 30-90% [Struik, Wiersema, 1999]. К причинам широкого распространения патогена относят нарушение агротехнических приемов возделывания, использование зараженного семенного материала, а также несовершенство методов обнаружения вируса [Иванюк и др., 2005].
Область диагностики и идентификации вирусов является важным элементом в сфере защиты растений от болезней. Современные системы ведения семеноводства картофеля на оздоровленной безвирусной основе предусматривают применение диагностического контроля вирусного поражения на различных этапах семеноводческого процесса с целью своевременного удаления инфицированных партий посадочного материала из агропромышленного производства [Замалиева, 2009]. Также методы лабораторной диагностики применяются в ходе селекционного процесса при создании сортов картофеля устойчивых к YВК [Салихова и др., 2012].
В последние годы в России разработаны тест-системы для обнаружения вирусов картофеля, основанные на иммунобиологических и молекулярно-генетических методах исследования [Бобкова и др., 2003; Drygin et al., 2007; Бызова и др., 2009; Рязанцев, Завриев, 2009; Комаров и др., 2013]. При этом остаются не достаточно изученными аспекты, связанные преаналитической подготовкой биоматериала, условиями его обработки и хранения. Также, практически не уделяется внимание вопросам, связанным с биометрической интерпретацией данных. Эти аспекты могут оказывать влияние на достоверность результатов фитосанитарного мониторинга.
В настоящее время большую значимость приобретает фитосанитарный мониторинг, предусматривающий оценку видового и штаммового состава вирусов растений. Известно, что YВК обладает сложной популяционной структурой, включающей несколько штаммов, приводящих к образованию различных симптомов на растениях картофеля [Smith, Dennis, 1940; De Bokx, Huttinga, 1981; Beczner et al., 1984; Chrzanowska, 1987; Le Romancer et al., 1994; Blanco-Urgoiti et al., 1998; Chikh Ali et al., 2008; Chikh Ali et al., 2010]. Наибольшую угрозу для агропромышленного производства представляют штаммы, индуцирующие некротическое поражение клубней картофеля, приводящие к значительному снижению их товарного вида и пищевой ценности [Вайдеманн и др., 1999; Иванюк и др., 2005]. Также серьезную опасность несут рекомбинантные формы YВК, характеризующиеся высокой эффективностью переноса с помощью насекомых [Verbeek et al., 2010]. В результате быстрого распространения рекомбинантных штаммов YВК, способных к индукции некрозообразования, многие сорта картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Basky, 2002].
В Средневолжском регионе России сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. Кроме того, здесь функционирует ряд крупных селекционных и семеноводческих учреждений. В связи с этим, исследование аспектов связанных с лабораторной диагностикой и фитосанитарным мониторингом популяционного состава YВК на территории данного региона является актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление особенностей диагностического выявления YВК и штаммового состава патогена в Среднем Поволжье.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Усовершенствовать процесс подготовки растительного материала для диагностического обнаружения YВК.
-
Изучить уровень распространения YВК и других вирусных патогенов в растениях картофеля открытого грунта, а также в меристемных линиях in vitro.
-
Осуществить биометрический анализ данных ИФА, полученных при диагностике YВК.
-
Исследовать штаммовый состав вируса на территории Среднего Поволжья.
Научная новизна. Впервые установлен эффект повышения достоверности результатов лабораторной диагностики при использовании комплекса преаналитических факторов: однократного цикла замораживания-оттаивания разрушенной листовой ткани растений, а также внесения в состав листовых и клубневых проб картофеля мертиолята натрия и тиосалициловой кислоты. С помощью биометрического анализа выявлено существование взаимосвязи между результатами ИФА и процессом распространения патогена в вегетативных поколениях картофеля. Впервые на территории Среднего Поволжья обнаружена циркуляция штаммов YВКNTN и YВКN-Wi, индуцирующих развитие симптомов кольцевого некроза клубней картофеля. На территории европейской части России показано распространение изолятов YВК, обладающих рекомбинантной формой генома.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть применены в испытательных лабораториях системы Россельхознадзора и Россельхозцентра, а также в учреждениях, связанных с семеноводством и селекцией картофеля. Разработанный алгоритм преаналитической подготовки исследуемого материала используется в ГНУ ТатНИИСХ при диагностическом выявлении вирусов в системе семеноводства картофеля на оздоровленной основе. Охарактеризованные изоляты YВК могут быть использованы в селекционных исследованиях при создании форм растений устойчивых к патогену, а также могут быть применены при создании диагностикумов и контрольной панели образцов, предназначенной для оценки качества работы диагностических тест-систем.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа проводилась в соответствие с темами 04.15.01 и 04.15.02 Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на период 2006-2010 и 2011-2015 гг. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора (2005-2013 гг).
Положения выносимые на защиту.
-
Алгоритм пробоподготовки растительного материала, повышающий эффективность диагностических исследований методом ИФА.
-
Зависимость данных ИФА от продолжительности распространения YВК в ряду вегетативных поколений картофеля.
-
Структура патогена на территории Среднего Поволжья, представленная изолятами, проявляющими свойства штаммов YВКО, YВКN, YВКNTN, YВКN-Wi и обладающими рекомбинантной формой генома.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XI Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro» (Зеленоград, 2008), научно-практической конференции «Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные разработки молодых ученых – АПК России» (Казань, 2010), Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству» (Алматы, 2011), III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса России» (Казань, 2012), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» (Астрахань, 2013)
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 20 научных работ, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых изданиях, 9 – в материалах всероссийских и международных конференций.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация содержит 21 таблицу, 23 рисунка и 1 приложение. Список литературы включает 189 литературных источников, в том числе 122 на иностранном языке.
