Введение к работе
Актуальность проблемы. Определение параметров дисперсных сред методами светорассеяния - один из важнейших разделов физической оптики. При этом светорассеяние может применяться для решения этой проблемы в двух типах технологий, а именно, определение параметров дисперсной среды по данным светорассеяния от среды как целого и по данным светорассеяния от одиночных дисперсных элементов ср'еды. С точки зрения информативности второй метод обладает значительно большими возможностями, однако применение этого метода связано с значительными техническими трудностями.
В последнее время,' в связи с бурным развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных, в научных исследованиях и при технологическом контроле широкое распространение получили оптические анализаторы одиночных частиц. Наиболее перспективна для анализа одиночных частиц техника проточной цитометрии, возможности которой отражены в монографии авторского коллектива под редакцией M.R.Melamed, T.Lindmo, and M.L.Mendelsohn (Flow cytometry and sorting. Wiley-Liss, New York, 1990). В русскоязычной литературе техника проточной цитометрии отражена в обзоре Стейнкампа (Дж.Стейнкамп. "Цитометрия в потоке", Приборы для научных исследований, N 9, с. 3-35, 1984). Создание и применение проточных цитометрических систем для автоматического анализа и разделения частиц в гидрозолях открыло новые возможности для исследований в области биологии и медицины. В проточных цитометрических системах частицы анализируются со скоростью до 300 тысяч штук в минуту. Уникальность методики цитометрии в потоке состоит в том, что измерения выполняются на отдельных частицах с очень большой скоростью. Это обеспечивает высокую статистическую точность и позволяет надежно выявлять малые популяции. Между тем возможности метода предъявляют все более высокие требования к анализу измеряемых данных, поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров одиночных частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния).
Оптические схемы существующих проточных цитометров стандартной конфигурации не являются оптимальными с точки зрения определения параметров одиночных частиц по данным светорассеяния. Практически отсутствуют данные об ошибках вычислений параметров сферических частиц при измерении светорассеяния от одиночной частицы. Кроме этого, такой цитометр
требует проведения трудоемкой и неоднозначной калибровки частицами с известными значениями размера и показателя преломления. Не было метода, позволяющего проводить абсолютное (без предварительной калибровки) измерение параметров одиночной частицы в реальном времени.
Приведенные выше обстоятельства в значительной степени определили основные направления настоящей работы.
Диссертационная работа выполнена в рамках программы С-117-93/86 "Сканирующая проточная цитометрия" (программа "Университеты России"), при поддержке грантами: "Высокочувствительный многовариантный иммуноанализ" Шведского сельскохозяйственного университета, "Многопараметрический анализ" Академии наук Финляндии.
Цель работы. Целью работы является анализ и разработка методов определения параметров одиночных частиц при использовании данных светорассеяния на базе проточной цитометрии.
Для достижения цели исследования были сформулированы следующие основные задачи:
-
Анализ влияния углов сбора рассеянного одиночной частицей излучения на точность вычисления параметров частицы; оценка ошибки вычисления параметров частицы по данным, измеренным на проточном цитометре стандартной конфигурации.
-
Разработка метода, позволяющего определять абсолютные параметры частиц в реальном времени по данным светорассеяния на одиночной частице.
3. Разработка и создание экспериментальной установки
высокочувствительного проточного цитометра, позволяющего измерять
индикатрису светорассеяния одиночной частицы в широком диапазоне углов.
На зашиту выносятся следующие положения: 1. Оптимальными углами сбора рассеянного излучения, обеспечивающими наименьшую ошибку определения размера и показателя преломления частицы при использовании метода двумерного рассеяния Ми, являются телесные углы, образованные полярными углами в1=5-10 и 92=20-60 градусов. Рабочая область метода определяется диапазонами: 3 - 44 по параметру рассеяния а и до 1.12 по относительному показателю преломления п.
2. Использование третьего угла сбора рассеянного излучения расширяет рабочую область метода до а = ПО. Оптимальными углами сбора рассеянного
излучения при использовании метода тройного двумерного рассеяния Ми являются телесные углы, образованные полярными углами Gi=5-I0, 82=20-60 и 9з=120-170 градусов.
3. Метод пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы,
заключающийся в использовании параметров индикатрисы (расстояние между
минимумами и контраст индикатрисы), позволяет вычислять абсолютные
значения размера и показателя преломления частицы в реальном времени с
использованием оригинальных эмпирических уравнений. Рабочая область метода
определяется диапазонами: а = 7 - 88 и относительным показателем преломления
-до 1.125.
4. Оригинальная оптическая система сканирующего проточного цитометра
позволяет измерять индикатрису светорассеяния движущейся в потоке одиночной
частицы в углах от 5 до 125 градусов за характерное время 3 мсек.
Научная новизна. Проведен анализ влияния углов сбора излучения, рассеянного одиночной частицей, на точность вычисления размера и показателя преломления методом двумерного рассеяния Ми. Определены оптимальные с точки зрения решения обратной задачи светорассеяния углы сбора.
Предложен и проанализирован метод тройного двумерного рассеяния Ми, позволяющий определять характеристики одиночной частицы в диапазонах 3 -ПО по параметру рассеяния а и до 1.12 по относительному показателю преломления. Численно продемонстрированы возможности метода при определении средних характеристик дисперсных сред на примере частиц жира в молоке.
На созданном проточном цитометре стандартной конфигурации разработан метод анализа двухкомпонентнои дисперсной среды. Определена чувствительность метода при одновременном определении концентраций бактерий и соматических клеток в молоке.
При изучении процесса латексной агглютинации в присутствии полипептидов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на базе проточного цитометра стандартной конфигурации определены характерные времена образования комплексов в условиях реакции антиген-антитело, которые равнялись 2-5 мин.
Предложен и проанализирован метод пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы, позволяющий вычислять абсолютные значения размера и показателя преломления частицы по полученным эмпирическим уравнениям.
Разработан и создан сканирующий проточный цитометр, позволяющий измерять индикатрису одиночной частицы в углах от 5 до 125 градусов. Продемонстрирована способность метода пролетной индикатрисы светорассеяния определять абсолютные размер и показатель преломления латексных частиц.
Разработан и создан лазерный нефелометр с измерением индикатрисы дисперсной среды в углах от 5 до 85 и от 95 до 175 градусов. Проведены сравнительные исследования светорассеивающих характеристик суспензий различных видов бактерий.
Научная значимость результатов работы состоит в том, что проведенные теоретические и экспериментальные исследования существенно расширяют возможности техники проточной цитометрии, в части использования светорассеяния.
Практическая значимость. Результаты работы использованы при разработке экспресс-методов определения концентрации бактерий и содержания соматических клеток в молоке, определения массовой доли молочного жира, контроля процесса роста латексных частиц при их производстве. Кроме этого, метод пролетной индикатрисы светорассеяния, базирующийся на сканирующем проточном цитометре, может быть использован для диагностики природных водных дисперсных систем, . при многопараметрическом иммуноанализе, использующем латексные частицы в качестве носителя специфических антигенов.
Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации теоретические результаты и результаты расчетов получены лично автором. Автору принадлежит основная идея метода пролетной индикатрисы светорассеяния, а также оптической системы сканирующего проточного цитометра и лазерного нефелометра. Автором выполнена обработка и интерпретация экспериментальных результатов. Кроме этого, автор принимал непосредственное участие в постановке и проведении экспериментов. По приглашению редакции журнала "Известия Академии наук", автором опубликован обзор по теме диссертации.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на Международной конференции "Современные и лазерные технологии" (ALT92, Москва, 8-11 сентября 1992), Всероссийской конференции по лазерной химии
(Лазаревское, 30 сентября - 5 октября, 1992 г), Межреспубликанской конференции "Оптические методы исследования потоков" (Новосибирск; 2-3 июня 1993 г.), Международной конференции "Биомедицинская оптика" (Сан Хосе (США), 4-9 февраля 1995 г.), Межреспубликанском симпозиуме "Оптика атмосферы и океана" (Томск, 20-23 июня 1995 г.), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1992-1996 гг.), в Биомедицинском центре университета г. Упсала (Швеция, 1993 г.), на физическом отделении Стокгольмского университета (Швеция, 1994 г.), на отделении медицинской физики университета г. Турку (Финляндия, 1994-1996 гг.).
Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 9 публикациях, включенных в прилагаемый перечень.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, приложения и списка цитированной литературы.
Объем диссертации составляет 83 страниц, включая 1 таблицу, 16 рисунков. Список цитируемой литературы насчитывает 53 наименования.
