Введение к работе
Актуальность проблемы. Одна из фундаментальных проблем паразитологии - проблема взаимоотношений паразита и его хозяина. Питание - основа симбиоза и паразитизма, а знание механизмов, с помощью которых паразиты абсорбируют и частично утилизируют нутриенты, имеет фундаментальное значение для понимания сущности паразитизма и отношений паразит - хозяин (Crompton, Hall, 1981). Цестоды - высокоспециализированные организмы, в биологии и морфологии которых проявляются многие важные черты адаптации к паразитическому образу жизни (Куперман, 1988; Halton, 1997; Dalton et al., 2004). В силу ярко выраженного морфологического сходства пищеварительно-транспортных поверхностей цестод и кишечника их хозяев, а также благодаря значительно большей, по сравнению с другими гельминтами, биомассе и площади поверхности, принимающей участие в процессах пищеварения, цестоды оказывают существенное влияние на пищеварительную систему хозяина.
На примере ряда позвоночных животных установлена важная роль симби-онтного пищеварения в процессах экзогенного питания (Уголев, 1985; Шивоке-не, 1989; Уголев, Кузьмина, 1993). К настоящему времени доказано, что существование высших организмов невозможно без постоянного взаимодействия с микроорганизмами, причем многие физиологические процессы у человека, животных и растений неразрывно связаны с соответствующими процессами у населяющих их бактерий (Уголев, 1985; Tannock, 1999; Пименов и др., 2004). Животное-хозяин и его кишечная микрофлора функционируют как комплексная экологическая система, в которой кишечная микрофлора оказывает значительное влияние на организм хозяина, а компоненты микрофлоры - друг на друга (Rolfe, 1984). Микроорганизмы, заселяющие кишечник, обладают набором специфических ферментов, позволяющих гидролизовать субстраты, недоступные ферментам макроорганизма. В результате жизнедеятельности симбионтной микрофлоры образуются пищевые вещества, не нуждающиеся в дальнейшем гидролизе, - аминокислоты, глюкоза, жирные кислоты и другие (Уголев, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993). Микрофлора кишечника синтезирует многие витамины, необходимые для жизнедеятельности не только хозяина, но и паразита (Шишо-ва-Касаточкина, Леутская, 1979). Согласно современным представлениям, макроорганизм следует рассматривать как единую систему более высокого иерархического уровня, чем отдельный индивидуум, выполняющий по отношению к микроорганизмам функцию доминанта и регулятора всей системы в целом (Уголев, 1985; Кузьмина, 2005). Бактерии- не только неотъемлемый, но и жизненно необходимый компонент пищеварительного тракта различных животных, в том числе рыб (Шивокене, 1989; Cahill, 1990; Кузьмина, 1996; Clements, 1997; Кузьмина, Скворцова, 2002; Кузьмина, 2005). Существует обширная литература, посвященная количественному и качественному составу энтеральной микрофлоры рыб (Шивокене, Трепшене, 1985; Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Cahill, 1990; Syvokiene, 1991; Баздеркина, 1992; Ringo et al., 1995; Clements, 1997; Grisez et al., 1997; Ring*», Gatesoupe, 1998; Syvokiene et al., 1999; Austin, 2002). Нормальная микрофлора пищеварительного тракта играет важную роль в жиз-
недеятельности макроорганизма, в частности в формировании иммунитета хозяина, синтезе ряда ферментов и витаминов, утилизации пищевых субстратов с выделением незаменимых аминокислот (Шивокене, Лубянскене, 1980; Шивоке-не, 1989; Sugita et al., 1991). Особое значение имеет резидентная микрофлора, т.е. микрофлора стенки кишечника, которая формирует природный экологический барьер, представляющий собой один из факторов устойчивости организма (Ringe et al., 1995), и оказывает ингибирующее воздействие на патогенные микроорганизмы (Westerdahl et al., 1991). Существенный аспект изучения кишечной микрофлоры - оценка ее роли в питании макроорганизма, которое осуществляется за счет выделения бактериями внеклеточных ферментов, способных участвовать в гидролизе биополимеров. Познание взаимоотношений между рыбами и бактериями, населяющими кишечник, - важный вклад в сравнительную физиологию пищеварения животных. Хозяин, паразит и симбионтная микрофлора представляют собой микробиоценоз со сложившимися за время совместной эволюции тесными взаимоотношениями, исследование которых важно для понимания происходящих в нем процессов (Чахава, Горская, 1982). Работ, касающихся взаимоотношений между микрофлорой кишечника и населяющими его гельминтами, крайне мало. Изучение микрофлоры, ассоциированной с пишеварительно-транспортными поверхностями цестод, обитающих в кишечнике рыб, ограничивается серией исследований, проведенных в рамках совместного гранта РФФИ с коллегами из лаборатории экологической паразитологии ИБВВ РАН (к.б.н. Ж.В. Корневой и к.б.н. Л.Г. Поддубной).
В то же время, для анализа основных закономерностей трофических взаимоотношений между хозяином и паразитом и выяснения роли в них симбионтиого пищеварения необходимы сведения о наличии бактерий в пищеварительном тракте рыб и степени их ассоциации с пищеварительно-транспортными поверхностями, а также о способности этих бактерий выделять различные гидролитические ферменты. Кроме того, требуются данные об активности ферментов, функционирующих на структурах щеточной каймы энтероцитов и тегументе цестод, о соотношении активности одноименных ферментов как в зоне мембранного пищеварения у рыб и гельминтов, так и в полости кишечника хозяина, и, наконец, об активности одноименных ферментов бактерий.
Исследования трофических взаимоотношений между хозяином и паразитом, с учетом существования симбионтной микрофлоры, позволяют пересмотреть некоторые базовые принципы отношений паразита и хозяина и выявить неизвестные ранее механизмы пищевых адаптации цестод.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение трофических отношений, складывающихся между хозяином, паразитом и симбионтной микрофлорой в кишечнике пресноводных рыб.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Разработать методические подходы к исследованию микрофлоры, с различной степенью прочности ассоциированной со слизистой оболочкой кишечника рыб и тегументом цестод.
2. Установить существование симбионтной микрофлоры, колонизирующей пищеварительно-транспортные поверхности кишечника рыб и цестод, и иссле- « довать способность микрофлоры продуцировать ферменты, гидролизующие основные пищевые субстраты - белки и углеводы.
3.Оценить активность протеаз и амилаз, продуцируемых бактериями, с различной степенью прочности связанными с исследованными поверхностями, а также выяснить общие закономерности функционирования этих ферментов.
4. Сравнить уровни активности исследованных ферментов бактерий с характеристиками ферментов, десорбируемых с пищеварительно-транспортных поверхностей рыб и цестод.
5.Определить локализацию процессов симбионтного пищеварения на пищеварительно-транспортных структурах рыб и цестод.
6. Выявить основные пищевые адаптации цестод - паразитов рыб.
Положения, выносимые на защиту.
Бактерии, ассоциированные с пищеварительно-транспортными поверхностями кишечника рыб и цестод, вносят существенный вклад в процессы пищеварения хозяина и паразита.
Питание у цестод осуществляется в соответствии с трехзвенной схемой пищеварения, включающей мембранное и симбионтное пищеварение, а также всасывание, или транспорт мономеров.
Трофические отношения в системе «хозяин - паразит - симбионтная микрофлора» представлены преимущественно взаимовыгодными связями, устанавливающимися за время совместного существования.
Научная новизна. Впервые в идентичных методических условиях исследована симбионтная микрофлора, ассоциированная с пищеварительно-транспортными поверхностями паразита и хозяина, что позволило оценить прочность фиксации бактерий на этих поверхностях. Впервые изучена способность симбионтной микрофлоры, локализованной на пищеварительно-транспортных поверхностях паразита и хозяина, гидролизовать белковые и угле: водные компоненты пищи. Впервые существование симбионтной микрофлоры установлено не только для паразитов кишечника, но и для гельминта, паразитирующего в полости тела рыб. Впервые предпринята попытка выявить возможность участия и роль симбионтной микрофлоры в процессах гидролиза основных питательных веществ (белков и углеводов) у цестод и сравнить их с аналогичными процессами, протекающими в кишечнике хозяина. Впервые исследована способность симбионтной микрофлоры, ассоциированной с пищеварительно-транспортными поверхностями рыб и паразитирующих в них цестод, гидролизовать углеводы различной степени сложности (поли- и дисахариды); сопоставлена амилолитическая активность ферментов, адсорбированных на слизистой кишечника и тегументе цестод, с активностью аналогичных ферментов бактерий. На примере низших цестод и их хозяев - рыб впервые установлены основные закономерности трофических взаимоотношений и функционирования системы
«паразит-хозяин» с учетом роли симбионтной микрофлоры, что существенно дополняет представления об отношениях между паразитом и хозяином. Впервые исследованы заключительные стадии углеводного обмена у цестод Triaenopho-rus nodulosus и Eubothrium rugosum, что позволило выявить адаптивные изменения значений рН в окружении червей.
Теоретическая и практическая значимость. Работа выполнена в рамках плановых тем лаборатории экологической паразитологии ИБВВ РАН и грантов РФФИ (96-04-49080; 00-04-48289; 03-04-48271).
Результаты исследований существенно дополняют и расширяют представления об отношениях между хозяином и паразитом на примере рыб и низших цестод; способствуют систематизации сведений по пищевым адаптациям цестод, а также доказывают важную роль симбионтной микрофлоры в питании не только хозяина, но и паразита.
Сведения, приведенные в работе, могут быть использованы в вузах при чтении лекций в курсах паразитологии, экологии и физиологии пищеварения рыб.
Систематизированные представления по симбионтной микрофлоре кишечника рыб могут найти применение при разработке кормов и использовании про-биотиков в прудовых хозяйствах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих научных мероприятиях: VI Всероссийский симпозиум по популяцион-ной биологии паразитов (Борок, 1996); «Экологический мониторинг паразитов» (С-Петербург, 1997); «Роль российской гельминтологической школы в развитии паразитологии» (Москва, 1997); «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, 1998); 50th Anniversary of Foundation and 18th Congress of Polish Parasitological Society Wiadomosci parazytologiczne, (Варшава, 1998); Совещание, посвященное 90-летию со дня рождения академика Б.Е. Быховского (С-Петербург, 1998); «История развития и современные проблемы гельминтологии в России» (Москва, 1999); «Механизмы функционирования висцеральных систем» (С-Петербург, 2001; 2003; 2005); «Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке» (Новосибирск, 2002; 2005); «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Сыктывкар, 2003; Вологда, 2005); «Паразиты рыб: современные аспекты изучения» (Борок, 2003); «Трофические связи в водных сообществах и экосистемах» (Борок, 2003); «Основные достижения и перспективы развития паразитологии» (Москва, 2004); Сибирская зоологическая конференция (Новосибирск, 2004); «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004); XIII международное совещание по эволюционной физиологии (С-Петербург, 2006).
Публикации. Материалы диссертации отражены более чем в 50 работах, в том числе в 32 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах и сборниках.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 342 стр. машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 371 источник, из них 214 на английском языке. Работа проиллюстрирована 22 таблицами и 51 рисунком.
