Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор "Растительные терпеноиды в качестве лекарственных препаратов: достижения и перспективы" 10
Введение 10
1.1. Лекарственные препараты на основе сесквитерпеноидов 11
1.1.1. Артемизинины 11
1.1.2. Арглабин 19
1.2. Лекарственные препараты на основе дитерпеноидов 23
1.2.1. Таксол и его производные 23
1.2.2. Форсколин 36
1.2.3. Сульфодегидроабиетиновая кислота (экабет) 44
1.3. Лекарственные препараты на основе тритерпеноидов 47
1.4. Фармакологические перспективы терпеноидов 55
1.4.1. Разработка препаратов на основе дитерпеноидов 55
1.4.2. Разработка препаратов на основе тритерпеноидов 58
Заключение 73
Глава 2. Обсуждение результатов 74
2.1. Синтетические трансформации тритерпеноидов олеананового и лупанового типа с сохранением нативного скелета 75
81 82
2.1.1. Синтез ацилатов 30- и 28-гидрокси-, 3-оксиминотритерпеноидов 75
2.1.2. Стереоселективный синтез тритерпеновых 2-дезокси-а-гликозидов гликальным методом
2.1.2.1. Синтез тритерпеновых 2-дезокси-а-гликозидов в присутствии йодсодержащих активаторов
2.1.2.2. Синтез тритерпеновых 2-дезокси-а-гликозидов в присутствии системы "катионит - LiBr" "3
2.1.3. Синтез амидов, уреидов, карбаматов и N-бензальгидразидов бетулоновой кислоты и ее производных Ю2
2.1.4. Синтез тритерпеновых аналогов стероидного антибиотика скваламина * *4
2.1.5. Селективное окисление бетулина и его производных 118
2.1.5.1. Стереоспецифичное эпоксидирование двойной связи и
хемоселективное окисление гидроксигрупп тритерпеноидов ряда 20(29)-
лупена диметилдиоксираном
2.1.5.2. Окисление бетулина и моноацетатов бетулина «активированным» диметилсульфоксидом 126
2.1.5.3. Хемоселективное окисление тритерпеновых спиртов гипохлоритом натрия
2.2. Синтетические трансформации тритерпеноидов олеананового и лупанового типа с изменением скелета 132
2.2.1. Трансформации в цикле А бетулина: синтез гетероциклических и С(2)-производных 132
2.2.2. Синтез производных мороновой кислоты из 28-оксо-аллобетулона 135
2.2.3. Синтез и превращения нор- и секотритерпеноидов 137
2.2.3.1. Синтез 23,24-динор-4-ен-3-он-производного 19(3,28-
эпоксиолеанана 137
2.2.3.2. Синтез и превращения А-триснортритерпеноидов 141
2.2.3.3. Синтез 4,5-секотритерпеноидов и стабильных озонидов на основе аллобетулина 144
2.2.3.4. Новое направление скелетной трансформации цикла Е лупановых тритерпеноидов 147
2.3. Синтетические трансформации производных левопимаровой кислоты 151
2.3.1. Синтез и строение хинопимаровой и хлорхинопимаровой кислот 154
2.3.2. Синтез дитерпеновых ацилатов 1(3-гидроксидигидрохинопимаровой кислоты 156
2.3.3. Модификация карбоксильной группы хинопимаровых кислот:
синтез амидов, конъюгатов с аминокислотами, уреидов 161
2.3.4. Синтез гетероциклических производных циклопентанонпимаровой кислоты 165
Глава 3. Результаты фармакологических испытаний производных бетулина, глицирретовой и хинопимаровой кислот 173
3.1. Противовирусная активность производных бетулина 173
3.2. Гепатопротекторная, противоязвенная, противовоспалительная активность, влияние на репаративную регенерацию кожи 188
3.3. Фармакологические испытания диникотината и бисгемифталата бетулина 193
3.4. Противовоспалительная и противоязвенная активность производных хинопимаровой кислоты 198
Глава 4. Экспериментальная часть 200
Таблица физико-химических свойств соединений 252
Таблица спектров ЯМР соединений 273
Выводы 315
Список литературы
- Лекарственные препараты на основе дитерпеноидов
- Синтез тритерпеновых 2-дезокси-а-гликозидов в присутствии йодсодержащих активаторов
- Гепатопротекторная, противоязвенная, противовоспалительная активность, влияние на репаративную регенерацию кожи
- Таблица спектров ЯМР соединений
Введение к работе
Проведение исследований, направленных на отыскание идей высококвалифицированного использования растительного сырья, для нашей страны особо актуально. Одним из экономически и социально важных направлений этих исследований является разработка биологически активных препаратов медицинского и сельскохозяйственного назначения на основе индивидуальных растительных метаболитов. Следует подчеркнуть, что в мировой практике неуклонно растет удельный вес и объем производства лекарственных препаратов, полученных путем синтетических трансформаций веществ, выделяемых из дикорастущих и культивируемых растений. Существенная часть от препаратов, введенных в медицинскую практику за последние три десятилетия, получена так называемым полусинтезом на основе терпеноидов. К ним следует отнести производные таксола, форсколина, артемизинина, глицирризиновой кислоты, арглабина и других метаболитов.
В нашей стране накоплен огромный опыт в области ресурсоведения и немалый научный задел по исследованию химии и фармакологии растительных веществ. Необходимо, опираясь на этот опыт и развивая его, не только выводить исследования в стране на фундаментальный мировой уровень, но и создавать предпосылки для ускоренной практической реализации результатов. Целая отрасль по получению ценных веществ может быть создана на основе лесопромышленного комплекса, переработки отходов лесосеки и культурных растений.
В настоящей работе предметом исследования служат ди- и тритерпеноиды, получаемые из широко представленных в Российской Федерации лесных древесных и ландшафтных травянистых растений.
При выборе природных объектов учитывались следующие критерии: -наличие исходной биологической активности у стартового вещества; - сырьевая обеспеченность; - наличие или возможность разработки технологичного метода выделения из природных объектов. Объектами исследования стали дитерпеноид левопимаровая кислота, тритерпеноиды глицирретовая кислота, уросоловая кислота и бетулин. Данные терпеноиды обладают стартовой биологической активностью и имеют практически неограниченную сырьевую базу, технологичные методы выделения из живицы сосны обыкновенной Pinus silvestris L., корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и уральской (Glycyrrhiza uralensis), отходов переработки клюквы Oxycoccus quadripetalus Gilib и коры берёзы вида Betula pendula.
Целью работы являлось исследование синтетических трансформаций пентациклических тритерпеноидов бетулина, глицирретовой и урсоловой кислот, дитерпеноида левопимаровои кислоты и получение на их основе новых групп соединений с ценными фармакологическими свойствами. Представленная работа преследовала решение следующих задач:
исследование реакционной способности высших терпеноидов в реакциях 0-гликозилирования и№и 0-ацилирования, селективного окисления с помощью диметилдиоксирана, озона и других реагентов;
реализация путей взаимных переходов пентациклических тритерпеноидов;
разработка методов гетероциклизации ди- и тритерпеноидов;
- синтез и отбор перспективных веществ для проведения углубленных
фармакологических исследований.
сн2он
"соон но1
левопимаровая кислота глицирретовая кислота
бстулин
урсоловая кислота
соон
Представляемый материал содержит итоги исследований за период 1992-2006 г.г. Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ по темам: "Разработка эффективных путей и методов полного синтеза природных соединений и их аналогов с практически важной биологической активностью" (номер государственной регистрации 01.9.00011565), "Синтез веществ, обладающих практически важной биологической активностью" (номер государственной регистрации 01.9.40009075), "Синтез биологически активных веществ на основе растительных терпеноидов" (номер государственной регистрации 01.99.0011836), "Химические трансформации и синтез аналогов биологически активных терпеноидов" (номер государственной регистрации 0120.0500681).
В результате проведенных исследований были разработаны стереоселективные методы синтеза 2-дезокси-а-гликозидов пентациклических тритерпеноидов с использованием реакций ацетатов D- и L-гликалей в присутствии йодсодержащих активаторов, а также прямой катализированной реакции. Проведена детальная характеристика гликозидов методом ЯМР-спектроскопии.
Осуществлены реакции ацилирования бетулина, его производных, 3-оксиминотритерпеноидов и найдены условия для селективной этерификации первичной гидроксильной группы бетулина хлорангидридами кислот. Синтезированы амиды бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты L-аминокислот, алифатических и гетероциклических аминов. Впервые предпринят синтез аналогов стероидного антибиотика скваламина на основе производных бетулина, содержащих метиленполиаминные фрагменты в положении С(28).
Проведена модификация цикла А с получением 2-арилиденовых, 2-метиленуреидо-(тиоуреидо-) производных бетулоновой кислоты, метилбетулоната
и лупенона. Синтезированы новые А-гетероциклические производные ряда лупана. Разработан препаративный метод синтеза тритерпеноидов олеананового типа (мороновой кислоты) из бетулина.
Синтезированы новые производные А-триснор-, Е-нор-, тетранор-, А-секолупана и А-динор-, А-триснор-, А-секоолеанана. В ходе исследования озонолитических реакций производных бетулина обнаружено нетривиальное направление превращения перекисных продуктов озонирования соединений 22(17-»28)дбео-17(28),20(29)-лупдиена, приводящее к тритерпеноидам с триоксановым фрагментом в цикле Е. Озонированием А-нео-ангидроаллобетулина получены озониды, обладающие высокой стабильностью.
Предложены хемоселективные методы окисления бетулина с использованием реагента Сверна и гипохлорита натрия. Показано, что диметилдиоксиран является стереоспецифичным реагентом эпоксидирования двойной связи производных ряда 20,29-лупена, позволяющим получать индивидуальные 2(Щ29)-эпоксиды.
Показано, что продукт перегруппировки типа Фаворского эпоксида хинопимаровой кислоты - "циклопентанонпимаровая кислота" является перспективным синтоном для получения гетероциклических производных дитерпеноидов. Синтезирована новая группа производных ряда абиетана, относящихся к типу С,В-цис-18-нор-4,4-диметил-8,12-эндоэтеноандростана и содержащих в цикле D фрагменты пиразола, изоксазола, тиофена, пирана, тиадиазола, пиримидина и индола. Получены амиды, уреиды и конъюгаты с аминокислотами хинопимаровой кислоты и ее дигидро- и хлорпроизводных.
Практическая значимость выполненной работы заключается в разработке стереоселективных и хорошо воспроизводимых методов получения 2-дезокси-а-гликозидов тритерпеноидов олеананового, лупанового и урсанового типов. Предложен практичный метод получения бетулоновой кислоты и ее оксима из бетулина-сырца. Разработан технологичный метод получения хинонаддуктов левопимаровой кислоты (хинопимаровой кислоты и ее производных) из сосновой живицы. На основе бетулина, глицирретовой, урсоловой и левопимаровой кислот синтезированы новые группы их производных, включающие более 300 соединений.
Впервые обнаружены противовирусные свойства тритерпеноидов в отношении вируса гриппа А и энтеровируса ЕСН06, найдены новые соединения с высокой активностью в отношении вируса герпеса, получены оригинальные ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Определены закономерности взаимосвязи "структура тритерпеноида-противовирусная активность". В качестве соединений, перспективных для углубленных фармакологических исследований, предложены диникотинат и бисгемифталат бетулина, бетулиновая, 3-оксиминобетулоновая и дигидрохинопимаровая кислоты.
Автор хотел бы выразить искреннюю благодарность всем, с кем было связано появление настоящей диссертации.
Прежде всего, автор глубоко благодарен научному консультанту академику Генриху Александровичу Толстикову - мудрому Учителю, выдающемуся Ученому, талантливому организатору науки, идеи которого и их конкретное воплощение по использованию отечественных растительных ресурсов в интересах медицинской химии нашли отражение и в представляемой работе.
Автор искренне благодарит всех, с кем довелось обсуждать основные результаты по мере их появления: академика Юнусова М. С, член-корреспондентов РАН М. Ю. Антипина, А. Г. Толстикова и А. В. Кучина, член-корреспондента НАН Беларуси Л. П. Титова, профессоров Л. А. Балтину, Ф. 3. Галина, О. С. Куковинец, Н. Н. Кабальнову, В. В. Поройкова, Э. Э. Шульц, В. В. Зорина, Ф. С. Зарудия, А. Г. Николенко, М. С. Мифтахова, В. Е. Катаева, Ф. 3. Макаева, В. Г. Карцева, Ю. В. Шкляева, В. Н. Одинокова, В. А. Бакулева, А. Г. Покровского, Е. И. Бореко и В. Н. Никандрова (НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Беларуси), Л. Запрутко (Университет Медицинских Наук, г. Познань).
Автор благодарит кандидатов наук Л. В. Спирихина, Е. В. Васильеву и И. П. Байкову за помощь в записи и интерпретации спектров ЯМР, Е. Г. Галкина за проведение масс-спектрометрических исследований; сотрудников лаборатории тонкого органического синтеза Г. Ф. Вафину и В. Г. Касрадзе за многолетнюю поддержку и ценные рекомендации при проведении экспериментов, а также своих учеников кандидатов химических наук Л. Н. Нигматуллину, Е. В. Третьякову, Н. И. Медведеву и О. Ю. Хисамутдинову, м.н.с. И. Е. Смирнову и асп. Гиниятуллину Г. В., чьими руками были проделаны многие эксперименты данной работы. Автор выражает признательность сотрудникам лаборатории новых лекарственных средств кандидатам биологических наук В. А. Давыдовой, Л. Т. Карачуриной и Н. Ж. Басченко, д.б.н. А. Ф. Исмагиловой за изучение фармакологической активности тритерпеновых производных.
Наконец, автор с благодарностью должен упомянуть о том, что выполненная работа была поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (№96-03-33240 "Трансформации глицирризиновой кислоты. Синтез новых тритерпеновых гликозидов", №00-03-81174Бел_а "Поиск новых высокоэффективных противовирусных соединений среди производных бетулиновой кислоты", №01-03-33131 "Новые направления трансформаций лупановых тритерпеноидов", №02-03-81007Бел_а "Дизайн, синтез и исследования производных бетулиновой кислоты с противовирусными свойствами", №04-03-97518р_офи "Разработка и создание опытных образцов новых противовирусных препаратов на основе тритерпеновых соединений", №05-03-32832"Разработка подходов к созданию противовирусных и противоопухолевых препаратов на
основе тритерпеноидов"), грантами президента РФ на поддержку молодых учёных и ведущих научных школ (НШ-1488.2003.3 "Целенаправленный синтез на основе доступных растительных веществ, получение аналогов биологически активных природных метаболитов" и МК-543.2003.03 "Дизайн и синтез новых биологически активных соединений на основе растительных терпеноидов"), Комплексной программой Президиума РАН "Направленный синтез веществ с заданными свойствами и создание функциональных материалов на их основе", грантом UNESCO IBSP/4-VN-01 "Сотрудничество Вьетнама, России и Беларуси в разработке противовирусных агентов в отношении вируса птичьего гриппа".
Автор благодарит Президиум РАН за предоставленную стипендию для молодых талантливых ученых России (1998-2002 г.г.), Европейскую Академию за Премию для молодых ученых России за работу "Дизайн и синтез высокоактивных соединений с противовирусной и гепатопротекторной активностью на основе тритерпеноидов ряда лупана" (2004 г.), Фонд содействия отечественной науке за фант для молодых кандидатов наук (2004-2006 г.г.).
Полученные результаты многократно представлялись на российских и международных научных конференциях и симпозиумах, опубликованы в ведущих российских и международных журналах, защищены патентами. Результаты исследований по синтетическим трансформациям и фармакологической активности тритерпеноидов внедрены в учебный процесс Кафедры Биоорганической химии Башкирского Государственного Университета, кафедры Биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского Государственного Нефтяного Университета и Кафедры фармакологии Башкирского Государственного Медицинского Университета.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ЦНС - центральная нервная система
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита
IC50 - концентрация вещества, ингибирующая рост 50% клеток
ЕС50 - концентрация вещества, ингибирующая репликацию 50% клеток
(среднеэффективная доза)
ТІ - величина, равная отношению 1С50/ ЕС5о (терапевтический индекс)
МПК - максимально переносимая концентрация
КХ - колоночная хроматография
ТГФ - тетрагидрофуран
ТСХ - тонкослойная хроматография
ХС - химический сдвиг
КССВ - константа спин-спинового взаимодействия
т-СРВА -л/-хлорпербензойная кислота
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
РСА - рентгеноструктурный анализ
ДМСО - диметилсульфоксид
DMAP - диметиламинопиридин
ДМФА - диметилформамид
CDDO - 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9(11)-диен-28-овая кислота
ГАГ - глюкозаминоглюкан
TMIS - триметилйодсилан
HMDS - гексаметилдисилазан
ТЭБАХ - триэтилбензиламмонийхлорид
НМРА - гексаметилфосфорамид
NMMO - М-метилформалин-И-оксид
Лекарственные препараты на основе дитерпеноидов
Перспективным направлением химической модификации молекул сесквитерпеновых лактонов является синтез их фосфоросодержащих производных. Взаимодействие арглабина 48 с диметил-, диэтил-, дипропил- и дибутилфосфитами при комнатной температуре селективно приводит к образованию соответствующих фосфонатов типа 63. Введение диалкилфосфонатной группы снижает биологическую активность. Однако при увеличении длины алкильных заместителей противоопухолевая активность незначительно повышается, что связано с увеличением липофильности производных арглабина.
Необычным примером регио- и стереоселективного гидроксилирования экзометиленовой двойной связи лактонного цикла арглабина 48 является его окисление с помощью КМпС 4 в присутствии катализатора межфазного переноса и дициклогексил-18-крауна-6, приводящее к единственному продукту - 11,13-дигидрокси-арглабину 64 с выходом 70%. 67 О
Бромирование арглабина 48 N-бромсукцинимидом в водном ацетоне идет по двум двойным связям с образованием дибром- и бромгидринпроизводных 65-67. Перспективным направлением модификации арглабина является реакция карбохлорирования. При взаимодействии 48 с дихлоркарбеном, полученным in situ из CHCl3/NaOH в присутствии катализатора межфазного переноса, образуется бисдихлорметиленовое производное 68, обладающее высокой противоопухолевой, фагоцитозстимулирующей, противотрихомонадной, противогрибковой и слабой антибактериальной активностями. При взаимодействии арглабина с дибромкарбеном, затем молекулярным бромом образуется производное 69, обладающее противогрибковой (Epidermophyton floccosum, Aspergillus flavus) и фагоцитозстимулирующей активностью.
В плане создания принципиально новых лекарственных форм (с контролируемым высвобождение действующего начала из полимерной матрицы), эмульсионной полимеризацией 1-винилэтинилциклогексанола-1, метилметакрилата и этилакрилата получены полимерные наночастицы с арглабином. Цитотоксическая активность полимерного комплекса полиметилметакрилата с включением арглабина в отношении линии опухолевых клеток X 63. Ag 8.653 превосходит как нативный арглабин 48, так и гидрохлорид диметиленаминоарглабина 49.
Практическим защищен патентами в 11 странах мира (Япония, Китай, США, Великобритания, Германия, Швейцариия, Франция, Австрия, Италия, Нидерланды и Швеция [56, 57]). Лекарственная форма препарата «Арглабин лиофилизированный порошок 0.04 г для инъекций во флаконах или в ампулах» зарегистрирована в Республиках Казахстан, Таджикистан и Кыргызстан. В ближайшее время будут проведены клинические испытания препарата «Арглабин» в лечении рака предстательной железы, мочевого пузыря, яичников, шейки и тела матки, легкого и пищевода при сочетании с химио- и лучевой терапией. Представляет интерес поиск новых производных арглабина, обладающих противогрибковой, антивирусной (в том числе анти-ВИЧ) и противовоспалительной активностью. 1.2. Лекарственные препараты на основе дитерпеноидов 1.2.1. Таксол и его производные
Открытие таксола является одним из наиболее значительных событий в области создания противораковых препаратов. Проблема онкологических заболеваний является одной из главных для современного общества. По прогнозам ВОЗ, заболеваемость и смертность онкологическими заболеваниями во всем мире возрастет в 2 раза за период с 1999 г. по 2020 г., в том числе с 10 до 20 млн. новых случаев и с 6 до 12 млн. регистрируемых смертей. В настоящее время накоплен большой материал по вопросам причин возникновения, заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей. Рак - злокачественная опухоль из клеток, трансформировавшихся из эпителия кожи, слизистых оболочек желудка, кишечника, дыхательных путей, различных желез и т.д. Отличия опухолевой клетки от нормальной установлены на молекулярно-генетическом уровне, что определяет современное направление создания новых препаратов, действующих на конкретную мишень. Если выделить ключевые этапы развития химиотерапии опухолей, то шестидесятые годы - время алкилирующих препаратов, семидесятые ознаменовались появлением антрациклинов, восьмидесятые прошли под знаком производных платины. Последнее десятилетие без сомнения является периодом таксанов - препаратов с оригинальным механизмом действия и широким спектром противоопухолевой активности.
История таксола началась в 1962-64 г.г. с изучения экстракта коры тихоокеанского тиссового дерева рода Taxus brevifolia (Taxaceae), ранее показавшего значительную антилейкемийную активность [58]. В исследовательском институте Северной Каролины в 1966 г. американские ученые Dr. М. Wall и Dr. М. Wani при проведении фракционирования экстракта коры тисса Т. brevifolia в качестве главного компонента выделили дитерпеноид таксол 70 [59], однако прошло еще несколько лет, прежде чем была однозначно установлена его структура. В настоящее время класс таксановых дитерпеноидов насчитывает более 300 производных, но в то время эта группа соединений была мало изучена и состояла из нескольких десятков соединений. Таксол также был получен и из других видов Taxus (Т. cuspidata, Т. baccata, Т. wallichiana). Из различных видов Taxus выделены свыше сотни соединений с таксановым скелетом.
Синтез тритерпеновых 2-дезокси-а-гликозидов в присутствии йодсодержащих активаторов
В настоящее время известно шесть вариантов полного синтеза таксола. В синтезах Холтона [77, 78], Вендера [79, 80] и Мукаияма [81] использован "линейный" подход, предполагающий последовательное формирование таксольного скелета. Три других синтеза (Николао [82], Данишевского [83] и Куваджима [84]) основаны на конвергентной стратегии, предполагающей предварительное получение основных молекулярных фрагментов и их последующую сшивку. Детальный анализ этих синтезов дан в недавнем обзоре [85]. Несмотря на эти и другие разработки, в том числе по получению отдельных фрагментов молекулы таксола и его аналогов, которые направлены на уменьшение количества стадий и использование доступных реагентов, выполнение каждой из полных схем требует огромных затрат времени при конечном выходе продукта 1-5%.
Перспективньїхм направлением получения таксола является его биопродуцирование в культуре клеток растений. Выходы составляют 0.012-0.05%, скорость 0.3 мг/г сырой клеточной массы в день в течение 40 дней [86, 87]. По-видимому, это направление станет основным при производстве таксола в ближайшие годы. Этому содействует соглашение между фирмами Bristol-Myers Squibb и Phyton Inc. по коммерциализации ферментативной технологии получения таксола.
Идет поиск других источников таксола. Выделение из окультуренного лесного ореха является первым случаем обнаружения таксола в растении, не относящегося к семейству Тахасеае.
Анализ взаимосвязи структура-активность для производных таксола позволил сделать следующие выводы [74]:
Для проявления выраженной активности важно наличие боковой цепи, поскольку цитотоксичность баккатина III 72 по отношению к KB клеткам (человеческая карцинома) в 1700 раз уступала таксолу. Производные баккатина III 72 значительно менее эффективны (в 38-680 раз) как ингибиторы объединения тубулина у млекопитающих, чем таксол. Наличие гидроксильной группы в положении С-2, также как и фенильной группы в положении С-3, важно для проявления максимальной активности. Введение в структуру сахарных остатков приводило к увеличению активности, на проявление которой оказывает влияние и стереохимия соединений. В то же время конформация боковой цепи не сильно влияет на таксановый скелет. Активность модифицированных по кольцу аналогов незначительно уменьшалась при ацилировании по положению С7. Удаление ацетильной группы при СЮ слегка уменьшало способность ингибировать объединение микротрубочек и цитотоксичность. В то же время большая активность Таксотера по сравнению с таксолом говорит о совместном влиянии боковой цепи и кольца на эффективность. При окислении по положению С7 с раскрытием оксетанового кольца активность и цитотоксичность значительно уменьшались.
На основе таксанов идет интенсивный поиск новых терапевтических препаратов [88]. Так, по данным на август 2003 г. из 2255 клинических испытаний противораковых агентов 310 ( 14%) приходилось на различные таксановые производные типа 91-98, 173 соединения имеют в составе таксол, 115 доцетаксель, 22 агента включают в себя индивидуальные таксаны или в комбинации с другими противоопухолевыми соединениями (http://clinicaltrials.gov/ct/screen/). Среди 116 новых агентов, препятствующих
Таким образом, на основе таксола и его производных созданы и развиваются высокоэффективные противораковые препараты, исполг зование которых спасает жизни сотням тысяч больных. История развития таксола оказала громадное влияние на изучение механизмов воздействия на раковые клетки, привела к новым идеям по развитию биоактивных соединений из природных источников. 1.2.2. Форсколин
Первое сообщение о лабдановом дитерпеноиде форсколине 99 (колеоноле) появилось в 1977 г. [96] в результате исследования соединений индийского медицинского растения Coleus forscohlii Briq. в научных центрах Индии (Бомбей [97], Лакноу [98]). Род Coleus семейства Labiatae (мяты) насчитывает около 200 видов трав и кустарников, которые широко встречаются в тропических и субтропических регионах Азии, Африки, Австралии и на Тихоокеанских островах. В народной медицине эти растения используются для лечения кашля, экземы, кожных инфекций, опухолей и ожогов.
В древней индийской литературе описывалось использование растений Pashanbedi, приравненных к семейству Coleus amboinicus, для лечения кардио-сосудистых заболеваний, болезней ЦНС, почек, бронхопульмонологической системы. В сухих корнях Coleus forscohlii содержание производных форсколина колеблется в пределах 0.01-0.44% [99], а в корнях искусственно размножаемых растений составляет 0.1%. Из метанольного экстракта сухих измельченных корней Coleus forscohlii, обладающего выраженной гипотензивной и антиспазмолитической активностями, колоночной хроматографией были выделены 112R=R =OH, R2=H
В начале 1980-х г. началось активное изучение биологических свойств форсколина. Было обнаружено, что дитерпеноид обладает кардиотоническими [100], антигипертензивными [101], препятствующими накоплению металлов (platelet aggregation inhibitory) [102], понижающими внутриглазное давление [103], бронхолитическим (bronchodilatory) [104], противовоспалительными и аденилатциклазоактивирующими свойствами [105], с токсичностью LD50 = 3100 мг/кг p.os и 105 мг/кг i.p. для мышей и 92 мг/кг і.р. для крыс. Вследствие того, что форсколин оказывает влияние на цАМФ, представляло интерес его развитие как средства лечения кардиомиопатии, глаукомы и астмы [106].
Способность активировать аденилатциклазу (АЦ) впервые выявлена в 1981 г. [107]. Форсколин быстро и обратимо стимулировал АЦ in vivo и in vitro в низких дозах (ЕС5о=5-15иМ), катализировал образование циклического 3 ,5 -аденозинмонофосфата (цАМФ) из АТФ. Форсколин активирует АЦ даже в отсутствие функционально стимулирующего протеинрегулирующего нуклеотида гуанин (Ns протеин) и становится потенциальным средством для изучения роли цАМФ в регулировании ионных каналов, метаболических путей, роста клеток, сокращения мышц, секреторных процессов, а также для изучения дефектов при выражении гормональных сигналов. Форсколин активирует АЦ беспозвоночных животных (насекомых, моллюсков), в тоже время не оказывая влияние на АЦ прокариотических организмов, таких как бактерии (Escherichia coli, Bordetella pertussis), грибы (Neurospora), протозоа (Leishmania), плесени (Dictostelium). Форсколин не оказывает прямого влияния на фосфодиэстеразы, гуанилатциклазу, цАМФ-протеинкиназу, Na+, К+-цАМФ и некоторые другие энзимы [108].
Путем стимулирования аденилатциклазы форсколин в виде 1% суспензии снижает внутриглазное давление [109]. В малых дозах форсколин проявляет сильную положительную инотропную активность на сердце животных, хотя при этом требуется повышенное содержание кальция, поскольку форсколин блокирует каналы кальция. Форсколин смягчает мышечное напряжение в легких и паренхимальной ткани [ПО], а при внутриперинатальном введении снижает отечность. Таким образом, форсколин увеличивает выработку цАМФ в большинстве тканей, что, однако, ограничивает его клиническую пригодность.
Гепатопротекторная, противоязвенная, противовоспалительная активность, влияние на репаративную регенерацию кожи
Согласно этой схеме, действие РС15 на аллобетулин 7 в смеси бензол - толуол при Т 0С привело к образованию описанного в литературе [485] 3-изопропилиден-Л-нео-5аН-19р,28-эпокси-18а-олеану 340, выход после перекристаллизации из смеси СНС13-МеОН составил 82%. Об образовании двойной связи в цикле А можно судить по появлению характерных сигналов атомов СЗ и С4 в спектре ЯМР 13С при 5 120.6 и 135.5 м.д. Олефин 340 озонировали в смеси СН2С12/МеОН (1:1) при - 60С, перекисные продукты восстанавливали: Zn/AcOH, или Me2S, или в нейтральных условиях -гидрированием над катализатором Линдлара. В спектре ЯМР 13С полученного 4,23,24-триснор-5рН-19(3,28-эпокси-18а-олеан-3-она 341 сигналы углеродных атомов СЗ и С5 наблюдались при 8 220.8 и 57.2 м.д., соответственно. Это
свидетельствует о 5(5Н-конфигурации и z/wc-сочленении колец А/В. Химические сдвиги сигналов атомов СЗ и С5 в спектре 5осН-норкетона олеаноловой кислоты составили 8 217.0 и 62.0 м.д. соответственно [481]. Наши опыты показывают, что изменение конфигурации протона Н5 с а- на р- и сочленения колец А/В с транс- в более стабильное z c-состояние происходит, скорее всего, в процессе обработки реакционной массы.
С использованием расчетов по аддитивным схемам и интерпретации спектров ЯМР 13С с модуляцией константы СН-взаимодействия и двумерной спектроскопии СН-корреляции (Приложение) нами проведено отнесение сигналов углеродных и протонных атомов в спектрах 5(Ш-норкетона 341. Из спектра СН CORR следует, что протоны циклопентанонового фрагмента и его ближайшего окружения (Hlb, Н2, Н5, Н6, принадлежащие атомам С1, С2, С5, С6 с химическими сдвигами 34.7, 36.1, 57.2, 17.2 м.д. соответственно), проявляются в области 5 1.85-2.30 м.д. в виде мультиплета.
Сигналы протонов, принадлежащие углеродным атомам СІ, С7, СН, С13, С18, проявляются в области 5 1.40-1.75 м.д., а сигналы протонов при углеродных атомах С9, С12, С15, С16, С21, С22 обнаружены в области 5 1.10-1.40 м.д. На основе 5рН-норкетона 341 получен ряд модифицированных производных с цис-сочленением колец А/В (см. раздел 2.2.3.2.).
Действие реагента Гриньяра MeMgl на норкетон 341 в смеси абсолютных ТГФ и Et20 при температуре 5-10С приводило к смеси За- и Зр-гидрокси-производных 342 (1:4), на что указывает наличие удвоенных сигналов в спектрах ЯМР. В спектре ЯМР С сигнал атома СЗ наблюдался при 5 83.2 м.д., сигнал С(1 )Нз - при 8 24.1 м.д., а в спектре ЯМР Н - в виде отчётливого синглета (8 1.29 м.д.). Сигнал С5 в спектре ЯМР С спирта 342 наблюдается при 5 53.9 м.д., что близко по значению аналогичному сигналу метил 3-гидрокси-3-метил-5рН-олеан-12-ен-28-оата (5 51.8 м.д. [481]) и подтверждают z/wc-сочленение циклов А/В.
Дегидратация полученной смеси спиртов 342 с использованием РОС13 в пиридине при комнатной температуре в течение 24 ч привела к З-метил-4,23,24-триснор-19р\28-эпокси-18а-олеан-3-ену 343 с выходом 80% после перекристаллизации из СНС13-МеОН. В спектре ЯМР 13С сигналы двойной связи С3(5) наблюдались при 8 126.1 и 141.6 м.д. В спектре ЯМР Н характерные сигналы протонов Н2 проявлялись в виде дублета при 8 1.92 м.д. и дублета дублетов при 8 2.31 м.д., а протонов Н6 - при 8 2.01 (дублет дублетов) и 8 2.22 м.д. (дублет триплетов). Отметим также, что образование соединения 343 термодинамически более выгодно, чем его 2(3)-ен изомера. Озонирование олефина 343 при -60С в смеси СН2С12/МеОН (1:1) с последующим восстановлением перекисных продуктов Zn/AcOH приводило к смеси 3-метил-3,5-секо-3,5-диоксо-производного 344 (35%) и озониду 345 (45%), разделенных колоночной
хроматографией. В спектре ЯМР С 3,5-секо-дикетона 344 сигналы оксо-групп СЗ и С5 наблюдались при 5 208.6 и 217.1 м.д., в спектре ЯМР !Н протоны С(Г)Нз резонировали при 6 2.12 м.д. в виде синглета, протоны Н2 - в виде мультиплета в области 8 2.36-2.45 м.д.
Устойчивость соединения 345 к действию восстановителя вполне объяснима: связь С3(5) соединения 342 находится в затруднённом стерическом положении в присутствии электронодонорной группы [486]. Образование озонида 345 (тип изомера не определяли) подтверждают сигналы атомов СЗ и С5, связанных с тремя атомами кислорода (5 108.4 и 112.3 м.д.) в спектре ЯМР С. Согласно масс-спектру, соединение 345 имеет состав С28Н44О4 и Мг 444.320 (А = -18.3) (теоретическая Мг 444.652).
3,5-Секо-производное 344 вводили в реакцию кротоновой конденсации в среде МеОН в присутствии 5% КОН/МеОН с образованием 23,24-динор-19р,28-эпокси-18а-олеан-4-ен-3-она 346 с выходом 90%. В спектре ЯМР 13С характерные сигналы атомов СЗ, С4 и С5 наблюдались при 8 199.5, 123.9 и 171.9 м.д., в спектре ЯМР Н виден характерный синглет протона Н4 при 8 5.75 м.д.
Преимуществом реализованной схемы является использование озонолиза как наиболее простого и доступного метода окисления двойных связей. Таким образом, нами впервые осуществлён синтез 23,24-динор-19р,28-эпокси-18сс-олеан-4-ен-З-она из бетулина с общим выходом 16%. 2.2.3.2. Синтез и превращения А-триснортритерпеноидов 4,23,24-Триснор-5рН-19р,28-эпокси-18ос-олеан-3-он 341, синтез которого приведен в разделе 2.2.3.1., является удобным соединением для получения модифицированных нор-тритерпеноидов с z/иосочленением циклов А/В. Нами проведено окисление А-нор-кетона 341 jw-хлорнадбензойной кислотой по реакции Байера-Виллигера с получением лактона 347, причем для полной конверсии исходного соединения потребовалось 7 дней (схема 47). Значения химических сдвигов сигналов HI, Н2 и Н5 (8 2.30-2.50 и 4.00 м.д.) в спектре ЯМР Н и сигналов 1 Ч С5 и СЗ в спектре ЯМР С (5 82.4 и 173.8 м.д.) однозначно свидетельствуют в пользу образования 3,23,24-триснор-5рН-А-гомо-4-окса-19р,28-эпокси-18а-олеан-3-она 347. Синтез структурного 5осН-аналога обсуждаемого лактона был описан в работах [487,488].
При взаимодействии норкетона 341 с гидрохлоридом гидроксиламина в пиридине получен оксим 348, бекмановская перегруппировка которого под действием SOCb в абсолютном диоксане протекала с количественным образованием лактама 349. Структура лактама определена спектральными методами. В ИК спектре имеется интенсивная полоса, характерная для амидного карбонила (1670-1640 см"1), и частоты 1610 и 3240-3230 см 1, отвечающие деформационным и валентным колебаниям N-H. Сигналы атомов группы -CONH в спектрах ЯМР проявляются при 8 172.8 м.д. (ЯМР 13С) и 8 6.30 м.д. (ЯМР Н). Образование 4,23,24-триснор-5 (5Н-А-гомо-4-аза-19р\28-эпокси-18о олеан-3-она 349 подтверждали химические сдвиги и вид сигналов Н2 (дд, 8 2.25 м.д.) и Н5 (уш. с, 3.22 м.д.) в спектре ЯМР Н. В соединениях 347, 349 z/ис-сочленение колец А/В не изменяется, что подтверждается сохранением вида сигнала Н5 в виде уширенного синглета с малыми КССВ.
Перегруппировка Бекмана второго рода оксима 348 под действием яsCl в среде безводного пиридина привела к 4,23,24-триснор-3-циано-3,5-секо-190,28-эпокси-18а-олеан-5(6)-ену 350. В спектре ЯМР С сигнал нитрильной группы обнаружен при 8 117.5, сигналы двойной связи С5(6) - при S 133.9 и 123.5 м.д., соответственно. Характерный мультиплет Н2 отмечен в области 2.20-2.40 м.д. Протоны Н5 и Н6 проявлялись при 8 5.70-5.80 и 5.13-5.23 м.д. в виде мультиплетов. Наличие в ИК спектре частоты при 720 см"1 говорит о реконфигурации протонов Н5, Н6 [489].
Таблица спектров ЯМР соединений
Строение полученных соединений подтверждено данными элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектрами. ИК-спектры всех амидов характеризуются полосами поглощения NH-rpynn (3065-2840 см"1) и CONH-rpynn (1525-1510 см-1). В спектрах ЯМР 13С полученных амидов наблюдается сильнопольный сдвиг сигнала углеродного атома С20 на 7-9 м.д. в результате образования CONH-связи. Карбонильные атомы углеродов С1 и С4 обнаруживаются в слабом поле (5 199-197 м.д.), как и в спектрах исходных кислот. Сигналы СН2-группы в остатках алифатических амидов 397, 398 проявляются в области 5 22-39 м.д. В спектрах ЯМР !Н протон амидной связи -CONH- обнаруживается в виде уширенного синглета при 5 5.17-5.72 м.д. В спектрах ЯМР амидов 403, 404 сигнал углерода амидной связи обнаруживается при 5 179.0 и 179.5 м.д, а протоны СОЩг-группы -при 8 5.60 и 5.65 м.д. в виде уширенных синглетов.
В результате взаимодействия хлорангидрида ДХГЖ 396 с метиловыми эфирами -аланина, 3-аланина, Х-валина, Z-лейцина, Z-метионина и Z-фенил-р-аланина при кипячении в хлороформе в присутствии триэтиламина получены конъюгаты 405-410 с выходами 68-92% (схема 59). Деблокирование метоксильной группы в аминокислотном фрагменте 20% NaOH в метаноле привела к соответствующим производным 405а-410а с выходом 87-93%.
С введением аминокислотных фрагментов в молекулы дитерпеновых кислот связано появление сигналов карбонильных атомов углерода сложноэфирных групп в области 5 172-173 м.д. в спектрах ЯМР 13С соединений 384-386. Сигналы сложноэфирных СНз-групп С Г обнаруживаются в области 5 51-52 м.д. Отмечено также смещение сигнала протона Н14 в сильное поле до 5 5.15 и 5.31 м.д. по сравнению с сигналом исходных кислот (6 5.47 и 5.68 м.д. соответственно). В спектрах ЯМР 13С соединений 405а-410а сигналы свободной карбоксильной группы в аминокислотном фрагменте отмечены при 5 178.0 м.д.
Осуществлен синтез производных дигидрохинопимаровой кислоты, содержащих аминокислотный и гемисукцинильный фрагменты одновременно (схема 60). Восстановление конъюгатов ДХПК с р-аланином 406 и Z-метионином 409 NaBH4 в метаноле аналогично получению ф-гидроксидигидрохинопимаровой кислоты привело к соответствующим аланиновому и метиониновому конъюгатам 13-гидроксидигидрохинопимаровой кислоты 411 и 412 с выходом 86 и 84 %. В спектрах ЯМР данных соединений сигнал атома С1 наблюдался при 5 68.1 м.д., сигнал атома НІ - в виде дублета триплетов при 6 3.89 м.д. Ацилирование соединений 411 и 412 янтарным ангидридом при кипячении в пиридине в присутствии DMAP дало соответствующие аланиновый и метиониновый конъюгаты 1р-гемисукцинилдигидрохинопимаровой кислоты 413 и 414 с выходом 77 и 75%. Спектры ЯМР характеризовались наличием сигналов, соответствующих аминокислотному и гемисукцинильному фрагментам. В спектре ЯМР С соединения 413 присутствуют сигналы амидной CONH-связи при 8 178.5 м.д., сигнал атома С1 отмечался при 8 71.3 м.д., сигналы сложноэфирных связей обнаруживались при 5 173.1 м.д. (СГ) и 179.0 м.д. (С1"), сигнал атома С4" гемисукцинильного фрагмента - при 5 170.6 м.д., соответственно. В спектре ЯМР !Н соединения 413 отмечаются сигналы протона амидной связи -CONH- при 8 6.45 м.д., метоксильной группы СООСНз - при 8 3.67 м.д., протонов -С#гС#2-группы сукцинильного фрагмента-в виде мультиплета при 8 2.42-2.6 м.д., соответственно. Аналогичные спектральные характеристики получены и для конъюгата 414, за исключением ХС атомов, соответствующих фрагменту метионина. 406,411,413 R = (CH2)2COOCH3 Условия: a. NaBHi/MeOH; b. янтарный ангидрид, пиридин, DMAP, 115 С
В качестве исходных соединений в синтезе дитерпеновых уреидов использовали изоцианаты хинопимаровой и 3-хлорхинопимаровой кислот 415, 416, которые получали из хлорангидридов 394, 395 по реакции Курциуса под действием активированного NaN3 в ацетоне без выделения промежуточных азидопроизводных (выход 90 и 94%). При взаимодействии изоцианатов 415, 416 с дециламином или метиловым эфиром L-метионина при кипячении в среде бензола или хлороформа в течение 2 ч образовывались уреиды 417-420 с выходами 78-84% (схема 61).
