Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Мгзо-замещенные водорастворимые порфирины 8
1.2.1. Водорастворимые производные порфиринов как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака 21
1.2.2. Водорастворимые производные порфиринов, содержащие разнообразные ионизированные группы 23
1.2.3. Водорастворимые производные порфиринов, содержащие ковалентно связанные остатки аминокислот 26
1.2.4. Водорастворимые производные порфиринов, содержащие ковалентно связанные остатки Сахаров 28
1.2.5. Водорастворимые порфирин-нуклеозиды 29
1.2.6. Водорастворимые конъюгаты порфиринов с прочими биомолекулами 30
1.2.7. Водорастворимые производные хлоринов и бактериохлоринов 32
1.2.8. Производные хлоринов и бактериохлоринов, содержащие ионизированные группы 33
1.2.9. Производные хлоринов и бактериохлоринов, содержащие ковалентно связанные остатки аминокислот 38
1.2.10. Производные хлоринов и бактериохлоринов, содержащие ковалентно связанные остатки Сахаров 40
1.2.11. Нуклеозидные производные хлоринов и бактериохлоринов 41
1.2.12. Конъюгаты хлоринов и бактериохлоринов с прочими биомолекулами 41
1.3. Получение амидных производных 42
1.4. Иммобилизация порфиринов на полимеры с целью получения водорастворимых соединений 46
1.4.1. Некоторые характеристики использованных полимеров носителей 51
Глава 2. Обсуждение результатов 55
2.1. Получение производных хлорофилла 55
2.1.1. Получение карбокси-форбинов 55
2.1.2. Синтез амидов хлорина е6 57
2.1.2.1. Синтез ІЗ-И-метиламид- и 13->Н2-гидроксиэтил)-амид -15,17-диметиловых эфиров хлорина Єб 57
2.1.2.2. Синтез 13-Ы,Н-ди-(2-гидроксиэтил)-амид)-15,17-диметилового эфира хлорина е6 57
2.1.3. Синтез и реакции цинкового комплекса метилфеофорбида (а) 62
2.2. Получение и гидрофилизация карбоксихлоринов 71
2.2.1. Гидролиз сложноэфирных групп 13-амидов хлорина Єб 71
2.2.2. Гидрофилизация карбоксихлоринов с использованием ТРИСа 75
2.3. Синтез водорастворимых производных гемина 78
2.3.1. Оптимизация условий синтеза 78
2.3.2. Изучение строения гидрофилизированных производных гемина 83
2.3.3. Синтез, изучение структуры и свойств полимерных производных гемина 86
2.3.3.1. Получение полимерных комплексов водорастворимых производных гемина 86
2.3.3.2. Изучение системы гемин - полимер методом диализа 88
2.3.3.3. Определение молекулярной массы полимерных комплексов гемина 91
2.3.3.4. Исследование полимерных комплексов гемина 92
2.4. Обсуждение результатов оценки первичной биологической и радиозащитной активности водорастворимых соединений гемина и полимерных комплексов на их основе 94
Глава 3. Экспериментальная часть 97
3.1. Приборы и реактивы 97
3.2. Хроматографическое исследование синтезированных соединений 100
3.3. Эталонные соединения 101
3.4. Получение метилфеофорбида (а) 102
3.5. Выделение 13(2)-гидроксиметилфеофорбида (а) 103
3.6. Синтез карбоксихлоринов 103
3.7. Синтез амидов хлорина е6 105
3.8. Синтез и реакции цинкового комплекса метилфеофорбида (а) 107
3.9. Гидролиз амидов хлорина е6 113
3.10. Синтез 13-Ы-метиламид-,13-Тч[-(2-гидроксиэтиламид)- 15-метиловых эфиров хлорина е6 114
3.11. Гидрофилизация карбоксихлоринов с использованием ТРИСа 115
3.12. Получение водорастворимых соединений гемина 127
3.12.1. Синтез водорастворимых полимерныхкомплексов гемина 127
3.13. Изучение строения гидрофилизированных производных гемина 128
3.13.1.У становление мольного соотношения компонентов в водорастворимых соединениях гемина 128
3.13.2. Изучение растворимости производных гемина 128
3.13.3. Определение вязкости полимерных комплексов 129
3.13.4. Исследование поликомплексов методом ультрацентрифугирования 129
3.13.5. Изучение иммобилизатов методом диализа 130
Выводы 132
Список использованной литературы 134
Приложения 147
- Водорастворимые производные порфиринов, содержащие разнообразные ионизированные группы
- Иммобилизация порфиринов на полимеры с целью получения водорастворимых соединений
- Синтез водорастворимых производных гемина
- Гидрофилизация карбоксихлоринов с использованием ТРИСа
Введение к работе
Хлорофиллы и порфирины крови относятся к числу важнейших природных соединений. В то время, как синтетические порфирины применяются во многих областях техники, практическое использование природных порфиринов ограничивается, в основном, медициной. Основные направления применения производных хлорофилла и гемина в медицине -онкология. В онкологии порфириновые соединения и, в частности, производные хлорофилла, исследуются, а в некоторых случаях и используются, в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний. Перспективными ФС считаются различные амидные производные хлорофилла. Использование амидной связи для присоединения фармакофорных фрагментов связано с тем, что амидная связь, с одной стороны, относительно устойчива в организме и фрагменты, присоединенные такой связью, остаются присоединенными к молекуле ФС при его действии, с другой стороны, в организме имеются фрагменты, катализирующие гидролиз амидной связи, что способствует ыводу ФС из организма.
Кроме того, в настоящее время, ведутся работы по синтезу хлоринов, содержащих фрагменты с большим количеством атомов бора (такие, как карборановые фрагменты) - эти вещества перспективны с точки зрения разработки на их основе препаратов для бор-нейтронзахватной терапии (БНЗТ) онкологических заболеваний. Помимо использования хлоринов и их металлокомплексов в качестве ФС и препаратов для БНЗТ, некоторые из аналогичных соединений сами по себе (без внешних воздействий) являются противоопухолевыми препаратами. Относительно недавно была обнаружена темновая токсичность некоторых цинковых и никелевых комплексов природных хлоринов по отношению к клеткам.
Помимо выше сказанного, в последнее время соединения из класса порфиринов и хлоринов, такие как протопорфирин, хлорофиллин натрия, комплексы хлорофиллина с амнокислотами и другие активно исследуются как потенциальные радиопротекторы и соединения, обладающие пострадиационным воздействием. Установлено так же лечебное действие различных порфиринов и их металлокомплексов при лучевом поражении организма. При этом показано, что эффективность радиозащитного и пострадиационного воздействия порфиринов существенно зависит от наличия в молекуле того или иного металла.
Однако, большинство порфириновых соединений и их металлокомплексы не растворимы в воде, что практически не дает возможности реализовать их в качестве перспективных фармпрепаратов. В связи с этим, представляется актуальной задача разработки методов получения гидрофильных производных порфиринов. Решение этой проблемы открывает новые пути создания разнообразных лекарственных средств, используемых в качестве ФС, радиозащитных, противовоспалительных, диагностических и других средств.
Таким образом, целью настоящей работы являлся синтез водорастворимых производных природных порфиринов, получение их полимерных иммобилизатов, а также первичная оценка биологической активности некоторых полученных соединений.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: получение производных хлорофилла со свободной карбоксильной группой; изучение взаимодействия полученных карбокси-хлоринов и гемина с аминами; изучение процесса иммобилизации водорастворимых производных природных порфиринов на полимерных носителях: синтетическом -поливинилпирролидоне (ПВП), и природных полисахаридах - зостеране, пуллулане с целью получения препаратов пролонгированного действия, обладающих необходимыми для практического использования характеристиками (водорастворимостью, низкой токсичностью, высокой эффективностью); первичное исследование биологической активности полученных соединений.
Водорастворимые производные порфиринов, содержащие разнообразные ионизированные группы
Водорастворимые тетрапиррольные соединения с ионизированными группами могут быть условно разделены на катионные, анионные и амфифильные [39]. Катионные и анионные порфирины содержат более двух зарядов на молекулу, амфифильные - два и менее, характеризуясь при этом тем, что полярные и неполярные группы сосредоточены в противоположных частях молекулы. Наиболее типичными представителями амфифильных порфиринов являются 0,0-алкилированные производные 53, полученные и детально исследованные Моаном и сотр. [40, 42]. Обобщение большого экспериментального материала позволило сделать вывод о том, что наибольшую туморотропность проявляют амфифильные ФС [39, 41]. Это свойство амфифильных ФС связывают с легкостью встраивания в плазматическую мембрану. Мишенью анионных ФС являются лизосомы [38]. Имеются указания на то, что сродство анионных ФС к опухолевым клеткам зависит от их гидрофобности [41]. Они, как правило, локализуются в мембранах. Предшественником порфиринов анионного типа обычно являются: а) сульфо- и сульфо-алкокси-производные тетрафенилпорфина с различными комбинациями заместителей; б) тетра-л езо-(карбоксифенил)порфирины и в) другие порфирины, содержащие карбоксигруппы, например, производные дейтеропорфирина IX или копропорфирина-Ш. Порфирины с катионными боковыми заместителями локализуются преимущественно в митохондриях (в 1000 раз больше, чем в других органеллах) [38]. Их предшественниками обычно являются : тетра-мезо-(пиридил)порфирин, тетра-л езо-(аминофенил)порфирин и порфирины с комбинацией из указанных заместителей. Катионные формы этих порфринов, как правило, получают путем взаимодействия с алкилгалогенидами [42]. Тем не менее, существуют и другие подходы, например, исходя из хлорметильного производного 54 получили [32] порфирины 55 и 56, первый из которых склонен к агрегации в воде и метаноле за счёт л-стопочного взаимодействия. Амфифилъные порфирины. По аналогии с известным порфирином 53 (R=SHCH2(NH)2COOH), синтезирован набор тиопроизводных порфирина 53 [43].
Сущность способа заключается в образовании дибромида (R=Br) при растворении гидрохлорида порфирина 6 в смеси HBr-АсОН с плотностью 1,45 г/мл, на который далее действуют соответствующим тиоспиртом. Ранее этот метод использовали в работе [23]. Исходя из тетраметилового эфира порфирина 53, получен ряд водорастворимых амфифильных ФС со ступенчато изменяющейся липофильностью [44]. Найдено, что отщепление двух ацетильных групп, приводящее к незначительному возрастанию липофильности, в тесте in vitro на культуре клеток карциномы яичника линии CaOv приводит к более чем трёхкратному росту активности, и полученный ФС приблизительно равен по активности известному фталоцианиновому ФС фотосенсу, не обладая при этом характерной для последнего выраженной темновой токсичностью. Последующее восстановление двух кетонных групп в спиртовые, приводящее к двукратному уменьшению липофильности, даёт дальнейший рост активности примерно в 4 раза, и полученный ФС превосходит по активности как фотосенс, так и несколько производных хлорина Єб. Переход к ряду производных монозамещенного дейтеропорфирина IX подтверждает выявленную тенденцию, причем соединения этого ряда примерно в 1,5 раза активнее соответствующих производных 53. Основываясь на этих данных, можно сделать вывод о том, что рост активности в данном случае есть функция двух однонаправленно действующих факторов - в небольшой степени роста липофильности и во много большей степени - роста способности молекулы к образованию водородных связей с гетероатомами биологических субстратов. Ряд водорастворимых димеров порфиринов с алифатическими мостиками разной длины (п = 3-13) получен Кесселем и сотр.[45] По сравнению с другими димеры с n = 6 и 13 показали значительно более высокую опухолевую локализуемость. Уровень ФС в плазме крови равномерно возрастает по мере роста числа метиленовых групп в мостике порфирина от 3 до 13. Анионные порфирины. Большое распространение как ФС имеют сульфированные производные тетрафенилпорфина. Пик работ по их синтезу приходится на восьмидесятые года [46, 47]. Основным методом получения является сульфирование тетрафенилпорфина концентрированной серной кислотой, протекающее в основном в «-положения бензольных ядер. Однако, в этом случае, практически невозможно получить индивидуальное соединение 54 (R1-R4 = «-C6H4CH2-SO3H), а образуется смесь порфиринов, обозначаемая как TPPSn. Этот продукт, тем не менее, в опытах in vitro характеризуется высокой фотодинамической активностью [46]. Если в фенильном кольце присутствует какой-либо заместитель (например, А1Ю), то реакция идёт более направленно и появляется возможность с большим выходом выделить индивидуальные соединения, содержащие в каждом фенильном заместителе по одной сульфогруппе. Эти соединения в зависимости от числа и взаимного расположения заместителей, значительно различаются по биологической активности in vivo [47]. Прямое сульфирование тетрафенилпорфина, однако, не единственный путь к порфиринам этого типа. Недавно появилось сообщение [48] о синтезе подобных соединений путём смешанной конденсации пиррола и соответствующих поизводных бензальдегида. В работе [49] ряд сульфированных тетрафенилпорфиринов получен с высоким выходом путём хлорсульфирования.
Последующее взаимодействие хлорсульфонатов с нуклеофилами (водой, спиртами или аммиаком) даёт ряд интересных с точки зрения ФДТ производных. Такие сульфированные порфирины имеют такой же длинноволновой максимум поглощения (656 нм), как водорастворимые производные хлорина е6 (654 нм), быстро выводятся из организма и сравнительно малотоксичны. Однако, из-за высокой гидрофильности сродство к опухолевой ткани у них сравнительно небольшое. Перспективно повышение липофильности этих соединений за счет варьирования числа сульфогрупп, заместителей фенильного кольца (например, увеличение числа углеродных атомов в заместителе А1кОСбН4-) или варьирования .мезо-заместител ей. Пример использования остатка фосфорной кислоты для придания порфирину водорастворимости дается в работе [50]. Катионные порфирины. В работе [50] сообщается о получении соединений 55 (Ri=R2= 4-С5Н4 ҐНСІ/, RrR H H CH -CsHUN);, , 56 (R,=R3= 4-C5H4N+HCL-, R2-R4=.M-C6H4CH2N(CH2-2-C5H4N)2) 57 (R,=R3= 4-CsIijN+HCL, R4= -C6H4CH2N(CH2-2-C5H4N)2) исходя из 5-м-аминометилфенил-10,15,20-(4-пиридил)порфириновых предшественников с различными комбинациями заместителей путем их взаимодействия с метилиодидом (с последующим обменом иодид-аниона на хлорид-анион) и, на последней стадии, восстановительного аминирования с использованием 2-формилпиридина. Интересным примером получения катионного ФС является использование соли Манниха - иодида Н,Ы-диметилметиленаммония [51]. Это реакция электрофильного замещения, дающая диметиламинометильное производное, которое далее подвергают кватернизации йодистым метилом и нуклеофильному замещению для введения, например, цианометильной группы. Пандей и сотр. Исходя из дмэ 53, получили водорастворимые катионные производные, соответственно, 58 (R=Ri=CH=CHCH2N+Me3 Г), 59 (R=R,=CH2N+Me31).
Иммобилизация порфиринов на полимеры с целью получения водорастворимых соединений
Эффективность действия лекарственных препаратов может быть повышена путем иммобилизации их на полимерных носителях. Применение полимеров позволяет придать многим уже известным лекарственным веществам такие важные характеристики, как повышенная стабильность, регулируемая растворимость, низкая токсичность. Разнообразие физиологических функций, которыми обладают природные порфирины, явилось предпосылкой исследования их фармокологических свойств, молекулярных основ их биологической активности и совместного использования порфиринов в комплексе с другими биологически активными веществами. Производные порфиринов входят в состав многих лекарственных препаратов, но, как известно, все лекарства обладают ограниченным сроком действия, после чего они выводятся из организма. Причем, чем меньше молекулярная масса препарата, тем быстрее он выводится из организма. Для продления действия лечебных препаратов предложено физиологически активное вещество (ФАВ) прививать к полимеру-носителю за счет образования сложноэфирной связи, солевой и других, которые легко гидролизуются в организме.
Появляется возможность на основе известных ФАВ рационально конструировать физиологически активные полимеры (ФАП) с заданной активностью и рядом свойств, которые трудно, а порой и невозможно придать низкомолекулярным ФАВ. С теоретической точки зрения рациональное конструирование ФАП заключается в использовании специфических свойств макромолекулы для изменения свойств исходных ФАВ в желаемом направлении. Одно из интенсивно развивающихся в последнее время направлений моделирования функций гемопротеидов заключается в фиксации активных ферропорфиринов на полимерной матрице. Модель Дж. Уенга представляет полистирольную матрицу, включающую диэтиловый эфир гема и 1-(2фенилэил)-имидазол. При этом расположенные вблизи гема молекулы имидазола могут имитировать функцию дистального гистидина миоглобина. Эта модель обратимо фиксирует кислород и окись углерода в водной среде при комнатной температуре. Сравнительная оценка способности обратимо связывать кислород полимерными и мономерными гемохромами показала, что скорость поглощения и степень связывания кислорода полимерными гемохромами значительно выше [86]. Полимерные комплексы обладают следующими принципиальными свойствами: хорошая растворимость в воде при невысокой температуре; защитное действие полимерного окружения, затрудняющее необратимое окисление гема в процессе оксигенации; иммитация функций дистального гистидина. В качестве полимерных основ были использованы поливинилпирролидон (ПВП), бисглицериновый альдегид и полиуретановый полимер, полученный из полиэтиленгликоля и изоционата. Анализ литературных данных показал, что характер прикрепления порфиринов и их комплексов к полимерной матрице может быть различным. В ряде работ иммобилизация порфиринов и их комплексов была проведена за счет координационных связей. Подобные комплексы гема были синтезированы авторами работы [87, 88], используя в качестве полимерной матрицы следующие полимеры: поли-4-винилпиридин, поли-Ы-винил-2-метилимидат.
Однако наибольшее практическое значение нашли полимеры, содержащие ковалентно связанные порфирины и их комплексы, т.к. последние в отличие от координационно связанных характеризуются большей устойчивостью. Прикрепление порфиринов осуществляется за счет взаимодействия функциональных групп полимеров и производных порфиринов с образованием вторичных аминных, сложноэфирных и других функциональных групп. Полимерное производное гемина было получено конденсацией гемина по карбоксильным группам с полимером, содержащим хлормеилстирольные звенья [89]. Высокомолекулярные соединения, близкие по структуре к биополимерам, были получены по реакции образования оснований Шиффа между полимерами, содержащими аминогруппы и формилзамещенными в ядре производными порфирина или металлопорфирина [90]. Гемсодержащие полимеры были получены при использовании полиэиленгликоля [89], конденсацией гидроксильных групп полимера и карбоксильных и сложноэфирных групп металлопорфирина. Полимерное производное гемина было получено полимеризацией фенилбензилового эфира гемина, синтезированного взаимодействием гемина, гидроокиси триметил бензил аммония и хлорметил стирол а [91]. Факт иммобилизации порфиринов и металлокомплексов в приведенных работах подтверждается авторами методами электронной, ИК-спектроскопии и элементным анализом на азот. В случае полимерных металлопорфиринов массовые доли металлов оценены спетрофотометрически. Исследования, проведенные в лаборатории Ивановского государственного химико-технологического университета [92], показали принципиальную возможность ковалентной иммобилизации порфиринов на макромолекулах поливинилового спирта (ПВС) за счет образования ацетальных связей между гидрокси-группами ПВС и альдегидными группами порфиринов.
Таким образом, были получены водорастворимые иммобилизаты для феофитина в, родина g7 и их Cu(II) и Со(П) - комплексов. Исследованы каталитические свойства иммобилизатов в реакциях окислительного декарбоксилирования щавелевой кислоты и разложения перекиси водорода в водных средах. В работе [93], в качестве полимеров-носителей для ковалентной иммобилизации 5,10,15,20-тетрафенилпорфина (ТФП) использованы полихлорметилстирол, полиметилметакрилат и сополимер поли-Ы-винил-2-пирролидона и метакриловой кислоты. Были получены водорастворимые полимеры положительно, отрицательно заряженные и незаряженные. Блок-сополимер стирол-винилпмридина используется для введения хромофорных порфириновых групп [94]. Для иммобилизации гемина на полиметакриловую кислоту (ПМК) осуществляли реакцию совместной дегидратации ПМК и порфирина [95]. Анализ электронных спектров поглощения указывает на то, что мольное отношение порфириновых колец к мономерным звеньям соответствует конверсии звеньев гемин-метакриловая кислота в реакции дегидратации ПМК с гемином, повышается при увеличении температуры и максимальная конверсия составляет 18%. Наиболее часто для порфиринсодержащих полимеров используется реакция сополимеризации винилсодержащих полимеров с различными мономерами [96-98]. В качестве последних использовались акрилонитрил, метакриловая кислота и другие мономеры. Реакцией сочетания по Хеку синтезировали фотопроводящие полимеры общей формулы [99]:
Синтез водорастворимых производных гемина
Наличие в гемине (Fe-ПП) (21) концевых карбоксильных групп позволяет модифицировать его путем взаимодействия с основными реагентами, что приводит к образованию гидрофильных соединений. Кроме того, возможно взаимодействие экстралигандов с металлом порфиринового цикла, что также приводит к водорастворимым соединениям порфиринов [121]. Нами разработан способ получения гидрофилизированных производных гемина путем взаимодействия их с азотистыми основаниями. Схема синтеза растворимых геминсодержащих продуктов на основе азотистых оснований представлена на рис. 12. В качестве основных реагентов для получения водорастворимых продуктов нами использованы следующие азотистые основания (рис. 13): Препараты группы витамина Bj: витамин В] (Ві) и кокарбоксилаза (Сое); Использование в качестве оснований биологически-активных аминов позволяет не только получить гемин в водорастворимой форме, но и скомбинировать его с другим биологически-активным веществом. Такая комбинация может усилить биологическое действие как гемина, так и амина. Синтез водорастворимых производных гемина проводили в термостатируемых условиях, при атмосферном давлении, в водной среде при непрерывном перемешивании. Исходные реагенты (гемин : амин) брали в мольном соотношении 1:2 (по количеству карбоксильных групп в молекуле гемина). Поскольку исходные амины находились в виде солей (гидрохлоридов или гидробромидов), для получения свободных аминов использовали реакцию взаимодействия исходной соли амина с карбонатом натрия, при этом контролировали и поддерживали значение рН раствора в интервале 8-9 (в условиях потенциометрического титрования), так как при большем значении рН реакционной смеси, гемин способен образовывать гематин (натриевые соли гемина по концевым карбоксильным группам).
Следует отметить, что для экономии времени и вещества, при оптимизации условий синтеза, нами оценивалась только конверсия исходного гемина, значение конверсии гемина прямо пропорционально выходу продуктов реакции гидрофилизации и может быть использовано для оценки выхода продуктов реакции. Гидрофилизированные производные гемина представляют собой мелкодисперсные порошки черного цвета, хорошо растворимые в воде. Для определения оптимальных условий синтеза водорастворимых производных гемина варьировали следующие параметры: температура, мольное соотношение реагентов, время реакции. Результаты изучения оптимальных условий синтеза гидрофилизированных производных гемина представлены в таблицах 4, 5, 6. При подборе температурного режима исходили из мольного соотношения гемин : амин 1 : 2, массовая концентрация гемина 0,03 г/мл, время реакции 120 минут. Температура варьировалась от 20 до 90С (табл. 4). Результаты опытов по определению оптимальных условий синтеза водорастворимых производных гемина показали, что одним из основных факторов, от которого в значительной степени зависит выход продуктов реакции, является температура реакционной смеси. Как видно из таблицы 4, при температуре 20 С конверсия гемина не превышала 30-35 %. При повышении температуры выход может быть существенно увеличен.
Таким образом, для всех синтезированных соединений оптимальная температура реакции составляет 90С (за исключением Fe-ITII-Lis (28)). Конверсия гемина в этих условиях в изменяется в интервале 60-98 %. Закономерно, что наиболее мягкие условия синтеза (60 С) характерны для получения производного Fe-nn-Lis (28), поскольку используемый в данном случае в качестве основного реагента - лизин, являясь алифатическим амином, проявляет более высокую реакционную способность по сравнению с другими азотистыми основаниями в реакции солеобразования с карбокси-порфирином. Кроме того, в структуре молекулы лизина первичные NH2-группы более стерически доступны для образования ионной связи с концевыми карбоксильными группами гемина. Другие азотистые основания ведут себя в данной реакции в соответствии с их основной силой. Однако, поскольку, структуры данных соединений содержат пиридиновый (В6, Пф) и пиримидиновый фрагменты, в которых атомы азота близки по основности, то решающим фактором, оказывающим влияние на выход продуктов реакции, по всей видимости, будет стерический.
Выбор оптимального времени процесса гидрофилизации осуществляли при ранее подобранной температуре реакции. Время реакции варьировали от 30 до 150 минут, результаты синтезов представлены в таблице 5. Из результатов таблицы можно сделать вывод, что выход растворимых производных гемина может быть улучшен также и за счет увеличения продолжительности времени синтеза. Варьирование мольного соотношения реагентов от 1:1 до 1:3 показало, что оптимальным соотношением гемин : азотистое основание является соотношение 1:2, по числу карбоксильных групп в молекуле гемина. Мольный избыток азотистого основания не приводит к существенному повышению конверсии гемина (табл. 6).
Гидрофилизация карбоксихлоринов с использованием ТРИСа
Цинковый комплекс метилфеофорбида (а) (30 мг) растворяли в 3 мл пиридина, смесь кипятили в течение 10 часов с обратным холодильником. Реакционную смесь разбавляли двойным объемом хлороформа, смесь переносили в делительную воронку, отмывали пиридин разбавленной соляной кислотой (около 1%), остатки кислоты отмывали дистиллированной водой до нейтральной среды промывных вод. Экстракт сушили над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняли. Полученный продукт переосаждали из смеси хлороформа с пентаном. ИКС: уменьшения полосы валентных колебаний связи С=0 сложноэфирной группы при 1740 не произошло. 10 мг полученной смеси деметаллировали в смеси ТГФ с соляной кислотой, в полученной смеси при помощи ВЭЖХ, помимо 1 было идентифицировано небольшое количество 2. Взаимодействие 11 и 12 с аминами Комплекс (11) (5-7 мг) или смесь его с 1 растворяли в 1 мл ТГФ (в случае метиламина), в хлороформе (в случае диэтиламина, этаноламина и диметиламина). К полученному раствору прибавляли соответствующий амин (по 0,2 мл 33%-ного водного раствора в случае метил- и диметиламинов и 0,2 мл диэтиламина и этаноламина). Смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 1-6 часов. Качественный состав реакционной смеси анализировали методом ТСХ на пластинках Silufol (элюент - СС14 : ацетон - 4:1). Взаимодействие 11с гидроксиламином и борогидридом натрия Взаимодействие 11 с гидроксиламином и борогидридом натрия проводили в тех же условиях, что и соответствующие реакции I (см. ниже). Состав смеси анализировался при помощи ТСХ. Оксим метилфеофорбида (а) (14) К раствору 100 мг 1 в 3 мл пиридина добавляли 300 мг солянокислого гидроксиламина. Смесь нагревали до 100С в течение 10 минут. Образование продукта реакции контролировали методом ТСХ на пластинках Silufol ПО (элюент - ССЦ : ацетон - 4:1).
По окончании реакции смесь переносили в делительную воронку, разбавляли 50 мл хлороформа и отмывали от избытка пиридина 5 %-ной соляной кислотой, а от избытка кислоты дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод. Органическую фазу отделяли от водного слоя, высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали при погиженном давлении. Оксим (14) выделяли колоночной хроматографией на силикагеле (элюэнт - смесь четыреххлористого углерода с ацетоном в соотношениях от 70:1 до 2:1). Получили 74 мг (72,5 %) VI. ЭСП (СНС13; X, нм): 668; 603; 526; 501; 408 (полоса Сорэ). ИК (см 1, КВг): 1746 (vC=0, сложный эфир), 1644 (vC=N, кето-группа в экзоцикле), 1624 («хлориновая полоса») 896 (v N-O, оксим). ПМР (CDCI3, 400 МГц): 9,79 (с 1Н, (м 2Н, 8(1)-СН2); 3,85 111 (с ЗН, 13(4)-СН3); 3,52 (с ЗН, 12(1)-СН3); 3,43 (с ЗН, 17(4)-СН3); 3,40 (с ЗН, 2(1)-СН3); 2,99 (с ЗН, 7(1)-СН3); 2,72-2,10 (м 4Н, 17(1),17(2)-СН2); 1,91(д ЗН 7,6 Гц, 18(1)-СН3); 1,50 (т ЗН, 7,2Гц, 8(2)-СН3); сигналы NH-протонов хлоринового цикла отсутствуют. 13(1)-дезоксо-13(1)-гидрокси-метилфеофорбид (а) (16) К раствору 75 мг 1 в 3 мл ТГФ и добавляли 6 мг борогидрида натрия, образовавшуюся суспензию перемешивали на магнитной мешалке в течение 1 часа. Выделение комплекса проводили аналогично выделению комплекса (11). Получили 25 мг (33,2 %) 16 (смесь диастереомеров по положению 13(1)). ЭСП (СНС13; X, нм): 641; 592; 546; 505; 412 (полоса Сорэ). ИК (см 1, КВг): 1732 (vC=0, сложный эфир), полоса vC=0 (кето-группа в экзоцикле) К раствору 15 мг 16 в 3 мл хлороформа и прибавляли раствор 45 мг ацетата цинка в 3 мл метанола. Смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30 минут. Выделение комплекса 112 проводили аналогично выделению комплекса (И). Выход комплекса (X) 10,3 мг (61,3 %). ЭСП (СНС13; X, нм): 618; 568; 540; 500; 402 (полоса Сорэ). Навеску 13-Ы-метиламид-15,17-диметилового эфира хлорина е6 (5) (400 мг) растворяли в 3 мл ацетона, добавляли 0,6 мл концентрированной соляной кислоты и оставляли на 24 часа. Реакционную смесь разбавляли 40 мл хлороформа, отмывали соляную кислоту и ацетон водой в делительной воронке до нейтральной реакции (по универсальной индикаторной бумаге) и органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении. Остаток после упаривания хроматографировали на силикагеле (элюирование проводили смесью ССЦ: ацетон в соотношении от 20:1 до 3:1). Выход монометилового эфира - смесь хлороформа с этанолом в соотношениях от 9:1 до 6:1 по объему). Из 20 мг 3 было К раствору 88 мг феофорбида (а) в 3 мл хлороформа прибавляли мольный избыток этаноламина, метиламина (33%-го, водного). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. За ходом реакции и образованием продукта следили методом ТСХ (Silufol, СС14-ацетон 4:1).
Далее реакционную смесь разбавляли двойным объемом хлороформа, избыточный амин отмывали разбавленной соляной кислотой (в соотношении 1:30). Затем органическую фазу промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении при температуре 40-50С. Остаток после упаривания анализировали методом ТСХ (Silufol, ССІ4-ацетон 4:1). После чего полученные вещества хроматографировали на силикагеле (колонку наполняли «мокрым способом» с ССЦ), элюировали смесью ССЦ : ацетон в соотношении 10 : 1 (по объему). Колоночной хроматографией были выделены 13-Ы-метиламид-,13-Ы-(2 гидроксиэтиламид)-15-метиловые эфиры хлорина Єб хроматографически идентичные продуктам гидролиза амидов хлорина е6. Навеску карбоксихлорина (2 мг) растворяли в 2 мл раствора ТРИСа с минимальной концентрацией необходимой для растворения соответствующего карбокси-хлорина. Полученную смесь фильтровали через ватный тампон. При полном растворении карбокси-хлорина на фильтре осадка не наблюдается. Синтез гидрофильных комплексов гемина осуществляли в водном растворе в стеклянном термостатируемом реакторе, при перемешивании, атмосферном давлении и различных температурах. Амины, находящиеся в виде солей, предварительно получали в свободном состоянии, для чего к соли амина прибавляли эквимолярное количество карбоната натрия. Смесь перетирали в агатовой ступке, затем растворяли в определенном количестве дистиллированной воды, количественно переносили в реактор, в котором при помощи автоматического термостата поддерживалась постоянная температура, и оставляли на 10-15 минут для дальнейшего протекания реакции. После получения раствора свободного амина к нему добавляли навеску гемина. По истечении времени, осадок - не прореагировавший гемин - отделяли от раствора центрифугированием или фильтрованием на мембранном фильтре (d = 2,7 мкм) промывали водой, высушивали при комнатной температуре до постоянной массы. Далее проводили промывку водных растворов полученных соединений хлороформом с целью удаления непрореагировавших оснований и осаждение продуктов в системе вода:ацетон (1:20). Затем полученные осадки высушивали до постоянной массы при температуре 20-25С, взвешивали и рассчитывали конверсию гемина. Для синтеза полимерных комплексов водорастворимых производных гемина исходные соединения (гемин, амин и ПВП) брали в мольном соотношении 1:2:4. Синтез проводили двумя способами: а) навеску соли амина растворяли в определенном количестве воды, затем нейтрализовали ее карбонатом натрия. Через 10 минут добавляли гемин и полимер одновременно, и смесь термостатировали в течение 60 минут;