Содержание к диссертации
Введение
1. Синтез и таутомерия З-гетарил-4- гидроксикумаринов и их аналогов 8
1.1. Синтез З-гетарил-4-гидроксикумаринов и их аналогов 8
1.2. Таутомерия производных 4-гидроксикумарина 23
2 Новые реакции гетероциклизации (3,|3-три-карбонильных соединений в ряду производных кумарина 33
2.1. Реакции гетероциклизации З-алканоил-4-гидроксикумаринов 33
2.1.1. а-Пиронокумарины. Новая схема синтеза 33
2.1.2. Гидразоны З-ацетил-4-гидроксикумарина. Изомериза-ционные превращения и реакция гетероциклизации 40
2.2. Реакции гетероциклизации 4-гидрокси-З-циннамоил-кумаринов 45
2.2.1. 4-Гидрокси-З-циннамоилкумарины. Синтез, спектральные свойства и таутомерия 45
2.2.2. Реакции 4-гидрокси-З-циннамоил кумаринов с С- нуклеофилами. 4-Гидрокси-З-пиридилкумарины 53
2.2.3. Реакции 4-гидрокси-З-циниамоилкумаринов с N-нуклеофилами 58
2.2.3.1. 4-Гидрокси-З-пиразолинилкумарины: синтез и сольватохромные превращения 59
2.2.3.2. 4-Гидрокси-З-пиразолилкумарины 68
2.2.3.3. 4-Гидрокси-З-диазепинилкумарины: синтез, спектральные свойства и таутомерия 70
2.2.3.4. Синтез производных дигидрофуро-[2,3-с]кумарин-3-она 73
3. Потенциальные области практического применения новых З-гетарил-4-гидроксикумаринов 76
3.1. Сенсорные флуоресцентные системы 76
3.2. Оценка биологической активности 87
4. Экспериментальная часть 92
4.1. Методики спектральных измерений 92
4.2. Квантово-химические расчеты 93
4.3. Синтез З-гетарил-4-гидроксикумаринов 93
Выводы 118
- Таутомерия производных 4-гидроксикумарина
- Реакции гетероциклизации 4-гидрокси-З-циннамоил-кумаринов
- 4-Гидрокси-З-пиразолилкумарины
- Оценка биологической активности
Введение к работе
Среди производных кумарина 4-гидроксикумарины, замещенные по положению 3, занимают особое место. Это определяется, в первую очередь, выраженной биологической активностью многих 3-Я-4-гидроксикумаринов, проявляющих противовоспалительный, противотуберкулезный и антикоагулирующий эффекты [1-6]. К настоящему времени синтезировано значительное количество 3-замещенных 4-гидроксикумаринов, изучено их фармакологическое действие. В качестве примера можно назвать известные фармацевтические препараты - антикоагулянты крови - фенпрокумон, варфарин и синкумар.
ОН С2Н5
фенпрокумон
варфарин
синкумар
Многие 3-замещенные кумарины отличаются и выдающимися спектральными свойствами. Ниже показаны структуры некоторых лазерных красителей.
кумарин 6
кумарин 7
кумарин ЗО
Высокие квантовые выходы флуоресценции лазерных красителей -производных кумарина позволяют широко применять их в качестве флуоресцентных меток биологических субстратов в биохимических исследованиях.
Учитывая сказанное, в этой работе была поставлена задача развития
новых методов синтеза производных 4-гидроксикумарина,
модифицированных по лактонному кольцу. В качестве ключевых исходных соединений в работе применены З-ацил-4-гидроксикумарины, прежде всего, 3-алканоил- и З-циннамоил-4-гидроксикумарины и их бордифторидные комплексы. Названные структуры относятся к ряду р,р-трикарбонильных соединений и способны реагировать как с нуклеофильными, так и с электрофильными реагентами по типу прямого и сопряженного присоединения. Кроме того, ранее было показано, что комплексообразование с соединениями бора существенно расширяет круг потенциальных синтетических превращений З-ацил-4-гидроксикумаринов [7].
Для целей практического применения новых производных 4-гидроксикумарина принципиальный интерес представляет изучение их строения и структурных превращений под влиянием внешних факторов. В частности, ранее была высказана идея о том, что механизм антикоагулянтного действия 3-Я-4-гидроксикумаринов прямо связан с их способностью к таутомерным превращениям [8-Ю]. Silverman предложил механизм антикоагулянтного действия производных 4-гидроксикумаринов [10]. Он заключается в том, что производное 4-гидроксикумарина, переходя в таутомерную форму 2,4-хромандиона, реагирует с энзимом эпоксид редуктазы витамина К, ингибирует таким образом цикл "витамин К -
эпоксид витамина К" и предотвращает тем самым синтез протромбина, ответственного за свертываемость крови.
/WYVWVVWWyWA
HS S~ X і
Л)
тхг
hS S~ X
0 R
A/VVVVVWVN/VYVVA
HS S "X
Эта схема механизма остается гипотетической, поскольку таутомерные превращения в ряду 4-гидроксикумаринов систематически не изучались, а данные, доказывающие наличие кето-енольной таутомерии 3-замещенных 4-гидроксикумарина, немногочисленны.
Способность З-ІІ-4-гидроксикумаринов к таутомерным превращениям лежит не только в основе их фармакологического действия. Повышенная склонность к таутомерным превращениям обусловливает значительную чувствительность кумаринов, функционализированных по лактонному кольцу, к различным воздействиям - облучению, эффектам растворителей, ионам металлов, рН среды, изменениям температуры. Вызывая структурные изменения, указанные воздействия становятся причиной изменений различных свойств соответствующих производных кумарина и, в первую очередь, электронных спектров поглощения и спектров флуоресценции, что представляет несомненный интерес в поиске органических соединений, перспективных для новых технологий - создание новых средств регистрации и хранения информации, материалов оптоэлектроники, сенсорных элементов и устройств.
7 В соответствии с вышесказанным, в настоящей работе поставлены следующие научные задачи:
изучить новые реакции гетероциклизации З-ацил-4-гидроксикумаринов на основе 3-алканоил- и З-циннамоил-4-гидроксикумаринов, а также их бордифторидных комплексов;
исследовать спектральные свойства новых соединений, особенности их электронного и пространственного строения, способность к изомеризационным (в первую очередь, таутомерным) превращениям под действием различных факторов: облучение, эффекты растворителей, взаимодействие с биоорганическими субстратами;
- определить возможные направления практического применения новых
соединений - производных 4-гидроксикумарина, прежде всего, в качестве
сенсоров и биологически активных соединений.
Отдельные части работы выполнены в сотрудничестве с коллегами из других научных центров, в связи с чем выражую свою благодарность м.н.с. Иваненкову Я.А. (Исследовательский институт химического разнообразия, Химки), д.х.н., проф. Полыпакову В.И. (ВНИХФИ, Москва), д.х.н., проф. Ярмолюку С.Н. (Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины).
За неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы благодарю своего руководителя - профессора Травеня В.Ф. Особую благодарность выражаю старшему научному сотруднику Манаеву А.В. и доценту Подхалюзиной Н.Я. (РХТУ им. Д.И. Менделеева), а также коллективу кафедры органической химии РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Работа выполнена при поддержке Российского Фонда
Фундаментальных Исследований (грант № 07-03-00936).
Работа состоит из 133 с. машинописного текста и включает введение, четыре главы, выводы, список литературы, 11 таблиц и 20 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 146 ссылок.
Таутомерия производных 4-гидроксикумарина
Подводя итог, следует отметить, что общим недостатком многих из вышеперечисленных методов является сложность выделения продуктов реакции в индивидуальном виде и, соответственно, их низкие выходы. Кроме того, описанными способами удалось получить лишь ограниченный ряд производных З-гетарил-4-гидроксикумаринов. В то же время, данные литературного обзора подтверждают мнение о том, что синтез и изучение производных 4-гидроксикумарина, содержащих в положении 3 гетероциклический фрагмент, является перспективным направлением в поиске новых соединений с полезными прикладными свойствами. Многие производные кумарина проявляют высокую биологическую активность и склонны к структурным превращениям под влиянием внешних факторов (эффект растворителя, облучение, ионы металлов). Во введении уже отмечались те производные, которые нашли применение в терапевтической практике при их использовании в качестве антикоагулянтов непрямого действия, и роль их таутомерных превращений в механизме фармакологического эффекта. Вследствие этого, как при выполнении собственного эксперимента, так и в ходе анализа литературных данных значительное внимание диссертации уделено вопросам изомеризационных и, прежде всего, таутомерных превращений соответствующих субстратов. Теоретически исходный 4-гидроксикумарин может существовать в следующих трех таутомерных формах: 4-гидроксикумарин (а), 2,4-хромандион (б) и 2-гидроксихромон (в). Таутомерные превращения 4-гидроксикумарина изучались различными методами. В частности, получены данные о его реакционной способности [69-82]. Так, Арндт с сотр. подтвердили существование таутомерных форм при исследовании реакции взаимодействия 4-гидроксикумарина с диазометаном CH2N2 [69]. Он обнаружил, что в этой реакции образуется не только 4-метоксикумарин, но в небольших количествах и 2-метоксихромон.
Этот факт можно интерпретировать так, что 4-гидроксикумарин частично находится в форме 2-гидроксихромона. 2,4-Хромандионовая форма б была предложена в качестве интермедиата на стадии перегруппировки 4-ацетоксикумарина в З-ацетил-4-гидроксикумарин при изучении механизма реакций 4-гидроксикумарина с ацилхлоридами [70]. Несмотря на то, что 2,4-хромандион 56 не был выделен как стабильный продукт или интермедиат, 3,3 -дизамещенные 2,4-хромандионы существуют в качестве стабильных продуктов некоторых реакций. Так, 3,3 -диалкил 2,4-хромандионы были получены обработкой серебряной соли 4-гидроксикумарина алкилиодидами [75]. Также 3-арилазо-2,4-хромандионы были получены в реакциях азосочетания 4-гидроксикумарина с арендиазониевыми солями [76]. Строение и таутомерные превращения 4-гидроксикумарина и его производных изучались также расчетными методами квантовой химии и физико-химическими методами (электронная спектроскопия поглощения, ИК-спектроскопия, рентгеноструктурный анализ) [76-90]. В ходе анализа электронных спектров поглощения 4-гидроксикумарина и его производных было установлено, что в то время как у 4-гидроксикумарина в водных и этанольных растворах преобладает кумариновая форма а, бис-производные существуют в той же среде в хромоновой форме. Данные были получены на основании сравнения УФ-спектров 4-гидроксикумарина и биспроизводных кумарина со спектрами кумарина и 4-метоксикумарина (рис. 1,2) [89]. Были изучены инфракрасные спектры 4-гидроксикумарина, 4-метоксикумарина, этилового эфира ди-(4-гидроксикумаринил-3)-уксусной кислоты («пелентан»), О О -диметилпелептана и 2-метоксихромона в области 1600-1800 см"1, в которой сосредоточены полосы, отвечающие валентным колебаниям карбонильной группы и отличающиеся значительной зависимостью от характера связей, находящейся в соседстве с ней в молекуле вещества. В ходе изучения был сделан вывод [90], что у 4-гидроксикумарина, имеющего спектр, сходный со спектром кумарина, преобладает кумариновая структура а, в то время как в «пелентане», имеющем спектр, подобный хромону, необходимо предполагать в качестве преобладающей, структуру хромона (рис.3). Аналогичные данные были получены и W. Porter с сотр. На основании сравнения спектров 4-гидрокси и 4-алкоксипроизводных кумарина был сделан вывод, что ИК-спектр 4-гидроксикумарина более похож на спектр 4-метоксикумарина, чем на спектр 2-метоксихромона [81]. Американские химики продолжили изучение ИК-спектров 4-гидроксикумарина и его производных и пришли к выводу, чтс 2-гидроксихромоновая форма может наблюдаться только в случае безводного 4-гидроксикумарина, находящегося в твердом виде [82]. Подводя итог изучению таутомерии 4-гидроксикумарина спектральными методами следует отметить, что 4-гидроксикумарин по выводам авторов статей в твердом виде и в растворах находится либо в енольной форме а, либо в виде двух равновесных енольных форм айв.
Вместе с тем, спектральными методами не удалось обнаружить дикето-форму б. Таутомерия производных 4-гидроксикумарина систематически изучается в работах В.Ф. Травеня с сотр. Так, таутомерия 4-гидроксикумарина и его производных - 4,5- и 4,7-дигидроксикумарина, 4-гидрокси-3-(4 -метоксифенилазо)кумарина, З-ацетил-4-гидроксикумарина, 4-метоксикумарина - была изучена методом ЯМР спектроскопии на ядрах Н и С в различных растворителях [91]. Было установлено существование данных соединений в форме 4-гидроксикумарина. Расчеты, выполненные квантово-химическим методом MNDO, показали, что для всех вышеуказанных соединений наиболее устойчивой является форма а, имеющая минимальные значения теплот образования АНД За ней следует по устойчивости форма б и наименее устойчивой оказалась таутомерная форма в. При этом следует отметить, что значения теплот образования очень сильно различались для таутомеров б в зависимости от строения производного 4-гидроксикумарина. Наиболее устойчивым из изученной серии оказался 4,5-дигидроксикумарин 58. Этот факт объясняется, по-видимому, внутримолекулярным Н-связыванием между кето-группой в положении 4 и гидрокси-группой в положении 5. Изучение реакции дейтерирования замещенных 4-гидроксикумаринов показало, что H-D обмен эффективно протекает в метаноле. При этом обмену при третьем атоме углерода С(3) подвергаются все исследуемые производные кумарина, за исключением З-ацетил-4-гидроксикумарина. Авторы связывают данный факт с тем, что таутомерная форма данного соединения в метаноле не содержит атома водорода в положении 3. Продолжая исследования, В.Ф. Травень и сотр. изучили таутомерию 4-гидроксикумарина методами Неї фотоэлектронной спектроскопии и квантовой химии [92], поскольку расчетные методы наилучшим образом описывают состояние молекулы в газовой фазе. Были рассчитаны энтальпии образования таутомерных форм 4-гидроксикумарина более совершенными чем MNDO, полуэмпирическими квантово-химическими методами AMI, РМЗ. Было обнаружено, что наиболее устойчивой является 2,4-хромандионовая форма б. Для подтверждения этого был также проведен расчет ab іпісіо в базисе 6-31G (Gaussian). На основании анализа полученных результатов фотоэлектронных спектров 4-гидроксикумарина, 4-этоксикумарина и 3,3 -диметил-2,4-хромандиона (рис.4), а также данных расчетов параметров МО этих соединений и таутомерных форм 4-гидроксикумарина были отнесены полосы ионизации в спектре 4-гидроксикумарина.
Реакции гетероциклизации 4-гидрокси-З-циннамоил-кумаринов
В литературе описано несколько способов получения 3-циннамоилкумаринов - кумариновых аналогов халконов [44-51]. По данным [47] конденсация З-ацетил-4-гидроксикумарина с 4-нитро-, 4-метокси- и с незамещенным бензальдегидом при проведении реакции в присутствии каталитических количеств 10% раствора NaOH без растворителя проходит с выходами около 40%. Мы предприняли попытки воспроизвести данную методику, однако они не увенчались успехом. Попытки получить кумариновые аналоги халконов по методике, представленной Triverdi J.С. с сотр. [48], также встретили ряд затруднений. " Согласно этой методике, конденсация ацилгидроксикумаринов с ароматическими альдегидами протекает за 1-1,5ч. при проведении реакции в хлороформе в присутствии пиперидина. Мы установили значительное увеличение времени реакции при использовании З-ацетил-4-гидроксикумарина и п-анисового альдегида. Анализ реакционной массы при конденсации З-ацетил-4-гидроксикумарина с п-диметиламинобензальдегидом по истечении 10 часов после начала реакции показал, что реакция прошла только на 30% (по данным жидкостной хроматомасс-спектрометрии). Дальнейшее кипячение (до 40ч.) не привело к увеличению содержания целевого продукта в реакционной массе. Ранее на кафедре органической химии РХТУ им. Д.И. Менделеева [51] было установлено, что при применении бордифторидного комплекса 3-ацетил-4-гидроксикумарина 11а оказываются весьма доступными борхелатные комплексы 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов. Продолжив эти исследования, через соответствующие бордифторидные комплексы 25а-1 мы получили целый ряд кумариновых аналогов халконов 26а-1. ангидриде (способ А) или в уксусной кислоте в присутствии каталитических количеств конц. H2SO4 (способ Б). Гидролиз бордифторидных комплексов 4-гидрокси-3-циннамоилкумаринов и их аналогов был проведен в водно-спиртовой среде в присутствии 5-10 кратного избытка Na2C03 с последующим подкислением реакционной массы разбавленной соляной кислотой (схема 7).
Успех синтеза 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов 26а-1 по предпринятой нами методике объясняется свойствами бордифторидного комплекса 3-ацетил-4-гидроксикумарина (На). Как было ранее показано [105], комплексообразование З-ацетил-4-гидроксикумарина с BF3 заметно увеличивает длину связи СО (карбонил) (от 1,252 до 1,285 А) и сокращает длину связи СО(карбонил)-СН3. Указанные изменения в длинах связей отвечают смещению структуры ацетильной группы в направлении ее енолизации, что и ведет к повышению скорости взаимодействия образующегося енола с альдегидом. Строение полученных соединений доказано данными спектров ЯМР Н, хроматомасс-спектрами и данными анализа элементного состава. В спектрах ЯМР Н 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов 26, помимо сигналов ароматических протонов в области слабого поля (7.30 - 9.00 м.д.), появляются сигналы протонов винильной группы Н(9) и Н(10) в виде дублетов с КССВ J= 12-15 Гц. Такое значение КССВ свидетельствует о том, что протоны винильной группы находятся в транс-положении друг к другу. В электронных спектрах поглощения соединений 25а-1 в видимой части спектра находится узкая интенсивная полоса поглощения. Мы получили также бордифторидные комплексы 25m-r, продукты конденсации З-ацетил-4-дифторборилоксикумарина (На) с гетероциклическими альдегидами, дающие после гидролиза а,р-ненасыщенные кетоны 26m-r (схема 8). Строение полученных соединений 25m-r и 26m-r также доказано данными спектров ЯМР н, записанных в ДМСО-ёб и CDCI3 (кроме соединения 25р, спектр ЯМР Н которого записать не удалось из-за его низкой растворимости). В спектре соединений 26m-q, помимо сигналов ароматических протонов, наблюдаются сигналы протонов винильной группы в виде двух дублетов в области слабого поля с КССВ J= 14.3-15.2 Гц. / Все полученные соединения обладают интенсивной окраской, а в электронных спектрах поглощения 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов и их аналогов в видимой части спектра наблюдается узкая интенсивная полоса поглощения.
Изучив электронные спектры поглощения соединений 26, мы получили данные о существовании данных соединений в различных таутомерных формах. Так, в электронном спектре поглощения соединения 26j наблюдается значительная зависимость положения длинноволновой полосы поглощения от состава растворителя (рис.7) В спектрах ЯМР Н 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов, записанных как в ДМСО-ёб, так и в CDCb, в слабом поле присутствуют сигналы гидроксигрупп, однако в ДМСО-сіб в области 14 м.д., а в CDC13 - в области 19 м.д. Не исключено, что сильнопольные сигналы протонов ОН соответствуют форме «экзо-енола», а слабопольные, наблюдаемые в хлороформе - форме «эндо-енола». 4-Гидрокси-З-пиридилкумарины В целях изучения реакций 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов с С-: нуклеофилами были проведены реакции с ацетилацетоном, ацетоуксусным эфиром, метилцианоацетатом, нитроэтаном в присутствии основания (поташ, KF). Большего успеха нам удалось достичь в синтезе пиридилкумаринов по реакции Кренке [106]. В качестве С-нуклеофилов в этой реакции гетероциклизации выступают фенацилпиридинийбромиды. Кроме потенциальной биологической активности, 4-гидрокси-З-пиридилкумарины могут представить интерес и как элементы различных сенсорных систем, в том числе на ионы различных металлов [107-111]. В то же время, в литературе встречаются данные только о 3-пиридилкумаринах [112]. Сведения о 4-гидрокси-З-пиридилкумаринах отсутствуют. Пиридилкумарины 27 были получены по методике [106], согласно которой бромпиридиниевые соли кетона реагируют с а,3-ненасыщенными кетонами в присутствии ацетата аммония. В нашем случае в качестве а,р ненасыщенных кетонов были использованы 4-гидрокси-З- циннамоилкумарины (схема 9).
4-Гидрокси-З-пиразолилкумарины
Строение полученных пиразолилкумаринов ЗОа-с доказано данными анализа элементного состава, масс-спектров и спектров ЯМР !Н, записанных в двух растворителях - ДМСО-с16 и CDCI3. В отличие от спектров ЯМР Н пиразолинилкумаринов, спектры соединений ЗОа-с в полярном и неполярном растворителях в области 9-14 м.д. практически одинаковы: присутствует только один сигнал, находящийся в интервале химсдигов 13.80-14.07 м.д. и отвечающий, вероятнее всего, сигналу ОН-группы. Сигналы в виде дублета дублетов в области 3-5 м.д., отвечающие протонам пиразолинового кольца, исчезают. В области слабого поля появляется сигнал в виде синглета, соответствующий протону Н-9. Так, в ДМСО-сіб сигнал, соответствующий данному протону в соединении 30а, появляется при 7.32 м.д., а в CDCb - при 7.52 м.д. Теоретически, соединения 30 также могут находиться в различных таутомерных формах. Две наиболее вероятные формы показаны ниже. Строение соединений 31 было доказано спектрами ЯМР Н. В спектрах исчезают сигналы протонов винильной группы, характерные для 3-циннамоилкумаринов, а в области сильного поля появляются сигналы протонов диазепинового цикла. Из спектров следует, что протоны диазепинового цикла при девятом атоме углерода неэквивалентны. Этот факт объясняется, вероятнее всего, заторможенностью конформационных превращений семичленного цикла. Подобным образом проявляют себя и протоны диазепинилкумарина 31а при семнадцатом атоме углерода. Для реакции 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов с диаминами возможны два направления реакции (схема 15), отличающиеся первой стадией - реакция по карбонильной группе (путь 1) или по двойной связи (путь 2). В связи с тем, что в изученных ранее реакций с нессимметричными дизамещенными гидразинами первой стадией являлась атака по карбонильной группе, то и в данном случае, по-видимому, следует отдать предпочтение именно этому направлению реакции (путь 1). Как и все изученные ранее 3-замещенные 4-гидроксикумарины, 4-гидрокси-3-диазепинилкумарины 31 оказались способны к таутомерным превращениям. По данным расчетов методом AMI диазепинилкумарин 31а может находиться в 2-х таутомерных формах.
На основании данных по энтальпиям образования AHf был сделан вывод, что наиболее устойчивой формой диазепинилкумаринов является кето-форма, т.к. рассчитанная энтальпия образования AHf для этой формы имеет наименьшее значение. Электронные спектры поглощения подтвердили таутомерные превращения наличием изобестических точек в спектрах при смене растворителя (рис. 13). Изучая реакции гетероциклизации 4-гидрокси-З-циннамоилкумаринов, мы обнаружили возможность формирования дигидрофуранового цикла, конденсированного по З-Н-связи кумарина, при обработке дибромпроизводного 4-гидрокси-З-циннамоилкумарина 32 органическими основаниями. Соединение 32 было получено путем бромирования соответствующего 4-гидрокси-З-циннамоилкумарина 26j в уксусной кислоте: Ионизация гидроксигруппы в положении 4 делает возможным нуклеофильное замещение брома в а-положении к карбонильной группе с образованием дигидрофуранового цикла. Как видно из схемы, амины в этой реакции выступают не в качестве нуклеофила, а в качестве основания и обеспечивают элиминирование НВг из интермедиата. Обнаруженная реакция представляет собой ещё один пример гетероциклизации по лактонному кольцу кумарина при применении 4-гидрокси-З-циннамоилкумарина в качестве ключевого исходного соединения. В ходе работы мы изучили возможные направления практического применения полученных нами новых соединений. Выше уже отмечалось, что многие З-замещенные-4-гидроксикумарины отличаются ценными спектральными свойствами, в частности, значительной флуоресценцией и проявляют высокую биологическую активность. Вследствие этого были изучены изменения спектральных свойств 3-гетарил-4-гидроксикумаринов, прежде всего, спектров поглощения и флуоресценции, при облучении видимым и УФ-светом, а также при взаимодействии с белками и нуклеиновыми кислотами. С использованием программы ИГТК-1 (SmartMining) были построены карты Кохонена и рассчитаны возможные типы биологической активности полученных соединений. Следует отметить, по крайней мере, три результата, полученные при изучении влияния различных факторов на флуоресценцию новых 3-гетарилкумаринов. L Тушение флуоресценции при фотоароматизации пиразолинилкумаринов. В ходе выполнения аспирантской работы И.Иванова было установлено, что пиразолинилкумарины 28а-п, синтезированные в ходе нашего исследования, способны в растворе CCL), под действием видимого свет количественно переходить в пиразолилкумарины: Этот факт интересен тем, что в процессе фотоароматизации наблюдается резкое снижение интенсивности флуоресценции (рис.14). Как известно, производные пиразолов по сравнению с производными пиразолинов обладают весьма незначительной флуоресценцией.
В сотрудничестве с Центром фотохимии РАН (лаборатория канд. физ.-мат наук В.А. Барачевского) мы установили, что облучение видимым светом диазепинилкумаринов, растворенных в ацетонитриле, сопровождается отчетливым изменением электронного спектра поглощения. Для примера на рис. 15 показаны спектральные изменения диазепиникумарина 31Ь. Изменения в спектре поглощения обратимы. Как показано на рис. 15, после прекращения облучения поглощение соединения 31 b восстанавливается, однако, лишь частично. Отчетливо видно, что облучение сопровождается и деградацией исходного диазепинилкумарина (рис. 16). Важно отметить вместе с тем, что продукты фотодеградации соединения 31Ь обладают значительной флуоресценцией. Рост интенсивности флуоресценции раствора по мере облучения показан на рис. 17. Этот результат, безусловно, заслуживает внимания и может представить интерес в создании систем, пригодных для записи и хранения информации. При облучении как видимым, так и УФ светом представителей других групп синтезированных соединений (кумариновые аналоги халконов, пиразолилкумарины, пиридилкумарипы), изменения в спектрах оказались несущественными. 3. Флуоресцентные сенсоры для определения белков и нуклеиновых кислот В сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии и генетики НАН Украины (С.Н. Ярмолюк и В.Б. Ковальска) синтезированные соединения были изучены в качестве флуоресцентных красителей для определения природных и искусственных белков и нуклеиновых кислот . Для этой цели были записаны спектры флуоресценции красителей, как в свободном виде, так и в смесях красителей с ДНК, РНК и с белком BSA (бычий сывороточный альбумин) и BSA/SDS (додецилсульфат натрия). Установлено, что взаимодействие изученных красителей с белком BSA и BSA/SDS сопровождается изменениями в спектрах флуоресценции и для изученных соединений флуоресценция увеличивается в десятки раз (рис. 18). Кроме того, в спектрах некоторых красителей в присутствии BSA появляются новые полосы. Ввиду этого перспективным является их применение в качестве флуоресцентных сенсоров природных и синтетических белков.
Оценка биологической активности
Структуры синтезированных в ходе работы соединений были изучены in silico с целью формирования групп соединений, перспективных для биологических испытаний на определенный вид активности. Методология основана на построении классификационных моделей КССА (Количественная Связь Структуры и Активности) (QSAR) при помощи алгоритма самоорганизующихся карт Кохонена [126]. Самоорганизующиеся карты Кохонена представляют собой современный инструмент для высокоэффективного анализа и визуализации мультипараметрических данных, позволяющий создавать дву- или трехмерные изображения многомерных пространств и свойств [127]. Этот метод находит все более широкое применение в различных областях органической и медицинской химии, включая предсказание физиологических и физико-химических свойств соединений (например, [128-132]). Использованный в настоящей работе метод позволяет в рамках одной КССА модели предсказывать эффективность связывания не с одной, а с целым рядом терапевтически значимых биологических мишеней. Теоретическим и практическим аспектам использованной методологии посвящен ряд публикаций [133-138]. В настоящей работе в качестве обучающей выборки были использованы лекарственные соединения из базы данных Prous Ensemble (Prous Science, URL: http://www.prous.com). Выборка состояла из 17 000 веществ с экспериментально определенной и подтвержденной мишень-специфичной активностью. В обучающую выборку вошли лекарственные соединения, обладающие активностью по отношению к различным группам биологических мишений, всего в пределах обучающей выборки насчитыва- Расчет биологической активности выполнен в Исследовательском институте химического разнообразия (Химки) м.н.с. Иваненковым Я.А. лось более 200 уникальных типов биологических мишеней. Посредством комплексных процедур были отобраны восемь дескрипторов, способных наиболее адекватно описать мишень-специфичную активность, а также учитывать таутомерные превращения тестируемых соединений.
В результате работы были построены карты Кохонена, являющиеся двумерным отображением, в нашем случае, 8-мерного пространства. Некоторые из них для примера показаны на рис. 19. При этом в исследуемом 8-мерном пространстве свойств имеются компактные регионы, соответствующие группам соединений с различным профилем мишень-специфичной активности. РИС. 19. а - карта Кохонена полной исходной обучающей выборки (17 000 лекарственных соединений), б,в - области распределения репрезентативных групп соединений, обладающих различной мишень-специфичной активностью Мы использовали найденные закономерности размещения различных лекарственных субстанций на картах Кохонена для прогнозирования профиля мишень-специфичной активности соединений, синтез которых описан в данной работе, прежде всего, соединений, не содержащих атом бора. Из этих соединений структуры, склонные к таутомерным превращениям, были исследованы в двух таутомерных формах: в енольной форме а и кето-форме б. Методология прогнозирования состоит из расчета для каждого члена тестируемой выборки восьми дескрипторов, аналогичных использованным для построения модели, и последующего проявления положения каждого соединения на картах Кохонена. Тестируемое соединение классифицируется как принадлежащее к уникальному классу(ам) физиологически активных лекарственных субстанций, если оно попадает в наиболее темную область на карте, в которой преобладают соединения с конкретной мишень-специфичной активностью из обучающей выборки. На рис. 20 приведены несколько репрезентативных карт Кохонена для пиразолинилкумаринов 28а-п, где черные точки - соединения в енольной форме а, оранжевые точки - в кето- форме б. В результате расчетов с помощью самоорганизующихся карт Кохонена удалось показать, что в рамках одной группы структуры в енольной и кето-формах могут обладать принципиально различной мишень-специфической активностью. Так, пиразолинилкумарины 28m,n находящиеся в кето-форме б прогнозируются ингибиторами активности вазопрессина; напротив, при нахождении этих соединений в енольной форме а - ингибиторами тромбоксансинтазы и тромбинсинтазы. Следует отметить, что в большинстве случаев локализация соединений из тестируемой выборки, находящейся в кето-таутомерной форме, отличается, от соединений в гидрокси-таутомерной форме. Полученные результаты еще раз подтверждают важность изучения таутомерных превращений в ряду 4-гидроксикумарина в различных растворителях.
В общем, в результате расчетов с помощью самоорганизующихся карт Кохонена было определено, что синтезированные соединения являются ингибиторами активности целого ряда биологических мишеней: 1) циннамоилгидроксикумарины 26а-г прогнозируются ингибиторами активности редуктазы, транскрипционного фактора NFkB, HIV-интегразы, хемокиновых рецепторов, альдозредуктазы, ацетилхолинэстеразы; 2) пиразолинилкумарины 28а-п ингибиторами активности вазопрессина, тирозинкиназы, тромбоксансинтазы, тромбинсинтазы, серинпротеазы, Са-каналов; 3) пиразолилкумарины ЗОа-с прогнозируются ингибиторами активности серинпротеазы, РРА, циклооксигеназы, Са-каналов, холецистокина, альдозредуктазы; 4) диазепинилкумарины 31а-с прогнозируются ингибиторами активности тромбинсинтазы, К-каналов, фосфодиэстеразы, топоизомеразы, хемокиновых рецепторов, 5а-редуктазы; 5) пиронокумарины 12a-d, 17a-b, 18a-b прогнозируются ингибиторами активности серинпротеазы, Са-каналов, МАО, альдозредуктазы; 6) пиридилкумарины 27a-h прогнозируются ингибиторами активности вазопрессина, РРА, альдозредуктазы; 7) гидразоны З-ацетил-4-гидроксикумарина 23a-f прогнозируются ингибиторами тромбинсинтазы, серинпротеазы, обратной транскриптазы, К- каналов, фосфолипазы, ГАМК-рецепторов. 4.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 4.1. Методики спектральных измерений Спектры ЯМР Н растворов в CDC13 и ДМСО-с16 получены на спектрометре Bruker WP-400 SY (400 МГц), внутренний стандарт ТМС. Хроматомасс-спектры сняты на спектрометре РЕ SCIEX API 165 (ELSD UV254), колонка Synergi 2u Hydro-RP Мегсшу, 20x2.0 mm. Электронные спектры поглощения записаны на спектрометре «СФ— 104» в различных растворителях: диметилформамид, этанол, хлороформ, четыреххлористый углерод. Измерение флуоресценции образцов при анализе их применимости в качестве флуоресцентных меток на ДНК, РНК, белки Исходные растворы красителей были приготовлены разбавлением красителей в ДМФА до концентрации 2x10"3 М. Исходные растворы нуклеиновых кислот были приготовлены растворением в 0.05 М в Tris-HCl (рН 8.0) буфере, их концентрации составили 6x10"3 М (ДНК) и 1.2 х10"2 М (РНК). Исходные растворы BSA были приготовлены растворением в 0.05 М Tris-HCl (рН 8.0) буфере. Концентрации BSA в исходных растворах были 0.2 мг/мл. Все рабочие растворы были приготовлены непосредственно перед экспериментами. Рабочие растворы красителей в присутствии ДНК, РНК были приготовлены разбавлением исходных растворов красителей и соответствующей нуклеиновой кислоты в буфере. Для приготовления рабочих растворов красителей в присутствии белка BSA исходный раствор красителей был добавлен к 0.2 мг/мл раствору BSA в буфере. Абсорбционные спектры были записаны на спектрофотометре Specord М-40 (Carl Zeiss, Germany). Спектры флуоресценции были зарегистрированы на Сагу Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, Australia). Все измерения были проведены при комнатной температуре. Квантово-химические расчеты полуэмпирическим методом AMI и ZINDO/S проведены с использованием пакета программ МОР АС [141]. Предварительная оптимизация геометрии молекулы осуществлена с использованием метода молекулярной механики в варианте ММ+.
![Новые реакции 2,3-дигидрофуро[3,2-С]кумарин-3-ОНА, его арилиден- и циннамилиден-производных](/i/i/4432/382125.png "Новые реакции 2,3-дигидрофуро[3,2-С]кумарин-3-ОНА, его арилиден- и циннамилиден-производных Кондратова Наталья Анатольевна")
