Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 11
1.1 Гидрофилизированные порфирины 11
1.2 Реакции формирования сложноэфирной группы с участием производных хлрофиллаа 36
1.3 Димерные производные хлорофилла Основные результаты анализа литературных данных 43
2. Обсуждение результатов 45
2.1 Получение производных хлорофилла а с фрагментами олигоэтиленгликолей 45
2.2 Модификация хлоринов с фрагментами олигоэтиленгликолей 54
2.2.1 Димерные производные хлорофилла с олигоэтиленгликольными спейсерами 54
2.2.2 Аминометилирование винильной группы и синтез дикатионных производных 61
2.3 Исследование гидрофильности и цитотоксичности полученных производных 66
2.3.1 Оценка гидрофильности производных хлорофилла а с фрагментами олигоэтиленгликолей на основании данных ВЭЖХ 66
2.3.2 Влияние внедрения фрагмента олигоэтиленгликоля на токсичность 69
Экспериментальная Часть 74
- Реакции формирования сложноэфирной группы с участием производных хлрофиллаа
- Димерные производные хлорофилла Основные результаты анализа литературных данных
- Димерные производные хлорофилла с олигоэтиленгликольными спейсерами
- Оценка гидрофильности производных хлорофилла а с фрагментами олигоэтиленгликолей на основании данных ВЭЖХ
Реакции формирования сложноэфирной группы с участием производных хлрофиллаа
Известно, что порфириновый макроцикл гидрофобен по своей природе [21]. Способность растворения в воде он может приобрести либо в результате прото-нирования, либо при наличии нескольких гидрофильных заместителей на периферии молекулы, либо будучи включенным в гидрофильную полимерную матрицу [22]. Низкая растворимость порфиринов в воде обусловлена относительно высокой энергией кристаллической решетки порфиринов и низкими энергиями сольватации [21, 23, 24]. Наличие в порфиринах полярных групп повышает их растворимость в физиологических жидкостях. Растворимость в физиологических жидкостях является важным условием для успешности применения порфириновых соединений в качестве биологически активных веществ, поскольку она обеспечивает их высокую биодоступность [25, 26]. Кроме того, растворимость в воде может быть полезна в других областях, таких как катализ и электрокатализ, аналитическая химия и др. В связи с этим по разработке методов внедрения полярных групп на периферию макроцикла порфиринов ведутся интенсивные исследования. Гидрофильные тетрапиррольные соединения с полярными группами могут быть условно разделены на катионные, анионные порфирины и порфирины с электронейтральными полярными группами [21, 27].
Катионные порфирины в настоящее время активно изучаются, т.к. обладают высокой биологической активностью [25, 27–36]. Водорастворимые катионные производные порфиринов в последние годы активно изучаются в качестве потенциальных терапевтических агентов [30]. Катионные порфирины, в отличие от анионных или нейтральных аналогов, обладают выраженной антибактериальной активностью в отношении грамм-отрицательных бактерий [31], проявляют противовирусные и противогрибковые свойства [32, 33]. Показано, что положительно заряженные производные порфиринов способны селективно связываться с нуклеиновыми кислотами и расщеплять их [34], а также накапливаться в митохондриях опухолевых клеток и после активации светом вызывать их гибель путем апоптоза клетки [35]. Кроме того, катионные производные порфиринов рассматриваются в качестве ингибиторов теломеразы – фермента, отвечающего за «бессмертие» раковых клеток [36].
В качестве электронейтральных заместителей для повышения гидрофильно-сти порфириновых соединений чаще всего выступают фрагменты углеводов и полиэфиров. В последние годы возрос интерес к использованию гликопорфиринов в качестве сенсибилизаторов для ФДТ онкологических заболеваний и как противовирусный препарат направленного действия [19]. Помимо придания водораство-римости, объемистые углеводные группы могут служить для защиты активного реакционного центра от побочных реакций, влияние на физико-химические свойства, в частности, на геометрию молекул, способность к агрегации [37].
Таким образом, внедрение гидрофильных заместителей представляет большой интерес при синтезе биологически активных соединений на основе порфири-нов. В связи с этим далее рассмотрены основные методы внедрения гидрофильных групп различной природы на периферию порфиринового макроцикла.
В качестве анионных групп в гидрофильных порфиринах выступают, в основном, сульфо- и карбокси-группы. Анионные группировки на периферии пор-фиринового макроцикла возникают в этом случае за счет диссоциации этих кислотных групп, а водорастворимые производные в большинстве случаев представляют собой соли катионов щелочных металлов или замещенного аммония, образованного из биологически приемлемых аминов.
Метод внедрения сульфо-групп определяется структурой порфиринового соединения и реакционными центрами, имеющимися в его молекулах. Синтетические мезо-арилпорфирины являются относительно инертными соединениями, однако они могут выступать в качестве субстратов для электрофильного замещения. В связи с этим для внедрения сульфо-групп в такие порфирины используется сульфирование по механизму SE. В качестве объекта электрофильной атаки в мо 13 лекулах этих соединений могут выступать как сам порфириновый макроцикл, так и ароматические заместители на периферии. Направление сульфирования и количество внедряемых сульфо-групп зависит от строения профирина.
При действии концентрированной серной кислоты при 100 0C на тет-ра(мезо-фенил)порфин (1) происходит сульфирование всех четырех фенильных колец, причем сульфо-группа внедряется в пара-положение по отношению к пор-фириновому макроциклу (выход около 70%, схема 1) [38, 39]. Образующееся при этом тетрасульфопроизводное (2) растворяется в воде. Сульфирование по -положениям не происходит, возможно, вследствие дезактивации макроцикла при протонировании в серной кислоте.
Для внедрения сульфо-группы на периферию макроцикла природных пор-фиринов реакция сульфирования не применялась. В молекуах природных порфи-ринов нет ароматических заместителей и стерически доступных положений макроцикла. В связи с этим, по видимиму, сульфирование по механизму SE в случае этих соединений затруднительно. В то же время, молекулы природных порфири-нов имеют реакционные центры другого типа, которые могут быть использованы для конъюгирования этих порфиринов с молекулами, содержащими сульфо-группы. Например, для конъюгирования бактериохлоринового макроцикла с го-мотаурином, содержащим сульфо-группу, используется размыкание экзоцикла соединения (13) и образование амидов (14, 18) при действии на соответствующее производное N-гидроксисульфосукцинимида (15) (схема 7) [40, 41]. В качестве побочной реакции образуется основание Шиффа (17), содержащее три сульфо-группы.
Димерные производные хлорофилла Основные результаты анализа литературных данных
Как было показано в предыдущем разделе, одним из наиболее общих способов внедрения полиэфирного фрагмента на периферию порфиринового макроцикла является формирование соответствующих сложных эфиров. В связи с этим далее рассмотрены реакции образования сложных эфиров с участием производных хлорофилла а. Экзоцикл является одним из активных реакционных центров метилфеофорбида а (158). Сложноэфирная группа экзоцикла испытывает влияние кето-группы в положении 13(1), за счет кето-енольной таутомерии. Поэтому реакции сложноэфирной группы экзоцикла несколько отличаются от реакций других сложноэфирных групп производных хлорофилла а.
Так, например, переэтерификация сложноэфирной группы в положении 13(2) протекает при активации 2-хлор-N-метилпиридиний йодидом и DMAP в качестве основания при кипячении в толуоле [96]. Такой реакцией были получены 13(2)-эфиры метилфеофорбида а с различными спиртами [96, 97]. Известно, что этот рагент поволяет получить соответствующие сложные эфиры только из кар-боновых кислот. Поэтому, в случае сложноэфирной группы экзоцикла, по всей видимости, сначала происходит ее гидролиз, а затем этерификация образующегося карбокси-производного. Енолизация экзоцикла способствует этим процессам. В случае сложноэфирной группы в положении 17 такая реакция невозможна.
Аналогично можно получить хлориновые димеры [96], коньюгаты метилфео-форбида а с различными биомолекулами. Внедрение триэтиленгликоля (139) [98] позволяет повысить гидрофильность молекулы по сравнению с исходным метилфеофорбидом а (158) (cхема 39) [48].
Схема По результатам литературных данных можно сделать выводы, что выходы продуктов реакции зависят от стерической доступности гидроксильной группы спирта, а так же от его устойчивости в условиях данной реакции [14, 96–98].
Были получены эфиры (165a, 165b) при действии соответствующего спирта на активированную 2-хлор-N-метилпиридиний йодидом карбоксильную группу пирофеофорбида а (59) в смеси ТГФ с толуолом в присутствии DMAP (схема 40) [99]. Интересно отметить, что, в отличие от сложноэфирной группы экзоцикла метилфеофорбида а (158), сложноэфирная группа пропионатного заместителя в положении 17 в этих условиях переэтерификации не подвергается.
Схема 40 Помимо выше представленных незаряженных гидрофильных групп на периферию макроцикла могут быть внедрены фрагменты полиаминов. Для формирования амидной связи между хлориновым макроциклом и фрагментами полиаминов может применяться активация карбоксильных групп хлоринов различными карбодиимидами [48, 100]. Так были получены аминопроизводные хлорина е6 (166a) и (166b) (схема 41).
Известным фактом является то, что свою роль в биологических системах порфирины выполняют не как индивидуальные молекулы, а в виде молекулярных ансамблей, включающих как минимум две молекулы порфирина [22].
Фотохимические свойства многомеров порфиринов привлекает внимание с точки зрения получения подходящих модельных соединений для определения фо-тосинтезиющих свойств, как фотонные устройства (солнечные батареи, фотон-закрытые молекулярные провода) [101]. Ковалентно-связанные димерные порфирины интересуют ученых с целью структурно-функционального моделирования активного центра фотосинтетического аппарата [58, 96, 102–104]. Димерные порфирины, в частности циклофано-вые рассматриваются как перспективные катализаторы многоэлектронных окислительно-восстановительных процессов. Некоторые димеры на основе гемато-порфирина, исследуются в качестве медицинских препаратов, применяемых как лекарственные средства для фотодинамической терапии рака [18, 70, 105–106].
Синтез димеров, включающих и порфириновый, и хлориновый макроцикл представляет интерес. Синтез такого димера дает возможность получить молекулу, которой присущи свойства как порфирина, так и хлорина [107].
Димеры со сложноэфирной связью Активным началом препаратов для ФДТ, таких как «Фотофрин», «Фото-скан», являются димерные, тримерные и высшие олигомерные порфинрины с эфирной связью между макроциклами [108, 109]. По-видимому, димерные производные с другими типами связи играют меньшую роль [107].
Формирование сложноэфирной связи используется для получения димеров. Стерически не затрудненная карбоксильная группа пропионатного заместителя относительно легко подвергается этерификации и переэтерификации [100, 110]. При синтезе циклофанового димера (168) была использована активация 2-хлор-N-метилпиридиний йодидом (схема 42) [110].
При синтезе димера (170) сложноэфирную связь формировали переэтери-фикацией карбметоксильной группы в положении 13(2) метилфеофорбида а (158) гидроксихлорином (169) при активации 2-хлор-N-метилпиридиний йодидом (схема 43) [97].
Амидная связь, которая связывает макроциклы, образуется довольно легко и обладает относительно высокой химической прочностью. Для решения этой проблемы порфириновые фрагменты и мостиковые группы, модифицировали углеводородными остатками различной длины, что в некоторой степени увеличивает растворимость димерных соединений [70].
Синтез линейных димеров, у которых порфириновые остатки объедены амидной связью, представляют собой простейший случай.
Для синтеза димерных производных без использования активирующих агентов была осуществлена реакция амидирования сложноэфирной группы экзо-цикла в результате были получены соответствующие димеры (172, 173) (схема 44) [48].
Димерные производные хлорофилла с олигоэтиленгликольными спейсерами
Для перехода от димерных производных (223–227) к соответствующим хлорин-хлориновым димерам (228–232) экзоцикл исходных соединений был разомкнут действием метиламина (схема 53). В масс-спектрах (MALDI) полученных соединений наблюдаются пики протонированных молекуляных ионов, соответствующих димерным молекулам (228–232), что подтверждает целостность димер-ной молекулы. Как и в случае исходных форбин-форбиновых димеров (223–227), макроциклические фрагменты молекул полученных димерных производных (228– 232) равноценны и в спектрах ЯМР 1Н наблюдается один набор сигналов, соответствующий протонам макроциклов. Кроме того, в спектрах ЯМР 1Н полученных соединений (228–232) по сравнению с исходными форбин-форбиновыми ди-мерами (223–227) отсутствует синглет протонов в положении 13(2) экзоциклов и появляются дублеты АВ-системы метиленовых групп, образующихся в результате размыкания экзоциклов. Относительная интенсивность сигналов хлориновых макроциклов и метиленовых групп фрагментов олигоэтиленгликолей так же соответствует димерным производным (рисунок 6). В ИК-спектрах соединений (228– 232), по сравнению со спектрами соответствующих исходных форбиновых производных (223–227), отсутствует полоса при 1700 см-1, соответствующая валентным колебаниям кето-группы экзоцикла и появляются полосы «амид-I» и «амид-II», что так же подтверждает размыкание экзоцикла.
Анализ реакционной смеси до достижения полной конверсии показывает, что при размыкании экзоцикла форбин-форбиновых димеров (223–227) наблюа-ется образование продуктов с одним разомкнутым экзоциклом (218–222). Однако использовать эту реакцию для синтеза хлорин-форбиновых димеров (218–222) не представляется возможным, поскольку при действии избытка метиламина с самого начала в реакционной смеси присутствуют и хлорин-форбиновые (218–222) и хлорин-хлориновые димеры (228–232), близкие по хроматографической подвижности. При уменьшении избытка метиламина реакция сильно замедляется и, в то же время, избежать образования хлорин-хлориновых димеров (228–232) не удается.
Для более надежной идентификации хлорин-форбиновых димеров (218–222) был выполнен их встречный синтез. Димеры (218–222) получали при взаимодействии метилфеофорбида а (158) и производных хлорина е6 с олигоэтиленгликоль-ными фрагментами в положении 15 (201–205) аналогично синтезу форбин-форбиновых димеров (223–227).
В масс-спектрах (MALDI) наблюдаются пики, соответствующие протониро-ванным молекулярным ионам полученных соединений (218–222). В спектрах ЯМР 1Н хлорин-форбиновых димеров (218–222) наблюдаются сигналы хлоринового и форбинового фрагментов (рисунок 7).
Рисунок 7 – спектр ЯМР 1Н метилфеофорбида а (158), хлорина е6 13-N-метиламид-15-диэтиленгликолевого-17-метилового эфира (201) и хлорин-форбинового димера (218) (область 7.80-4.00 м.д., CDCl3, 300 МГц). В ИК-спектрах хлорин-форбиновых димеров (218–222) проявляются слабая полоса олигоэтиленгликольного фрагмента в области 2730-2740 см-1, полоса поглощения кето-группы в положении 13(1) при 1700 см-1 и полосы поглощения амидной группы («амид-I» – 1650 см-1 и «амид-II» – 1550 см-1). Таким образом, данные ИК и ЯМР 1H спектроскопии свидетельствуют о наличии в полученных соединениях форбинового и хлоринового макроциклов.
Как и в случае 13(2)-эфиров метилфеофорбида а (158, 191–194) по данным ЯМР 1Н (рисунок 8) хлорин-форбиновые димеры (218–222) представляют собой смесь двух диастереомеров (схема 54) с сильным преобладанием более стабильного 13(2) R-диастереомера. Дополнительным доказательством того, что низкоинтенсивные сигналы в спектрах ЯМР 1Н димеров (218–222) относятся к сигналами второго диастереомера является тот факт, что при действии метиламина на эти соединения образуются соответствующие хлорин-хлориновые димеры (228–232).
В случае форбин-форбиновых димеров (232–227) возможна изомерия по двум хиральным центрам, поэтому для них наблюдается образование трех диасте-реомеров (схема 55) (рисунок
Таким образом, в настоящей работе на основе метилфеофорбида а (158) синтезирован ряд форбин-форбиновых (223–227), хлорин-хлориновых (228–232) и форбин-хлориновых (218–222) димеров с олигоэтиленгликольными мостиками различной длины между макроциклами.
Известно, что катионные порфирины являются эффективными ФС для ФДТ онкологических заболеваний, причем их эффективность во многом обусловлена способностью накапливаться в определенных органеллах клетки [69]. Кроме того, катионные производные хлрофилла а могут быть использованы для антибактериальной фотодинамической терапии. Для получения устойчивых катионных производных хлорофилла а необходимо получить соединения с третичной амино-горуппой, связанной с макцроциклом углерод-углеродной связью. Для формирования такой связи при внедрении диметиламинометильных заместителей используют различные реакции электрофильного замещения.
Известно, что взаимодействие 13-амидов хлорина е6 с бис(N,N-диметиламино)метаном (117) приводит к внедрению в винильную группу двух диметиламинометильных заместителей и может быть использовано для синтеза предшественников дикатионных хлоринов [120].
Аминометилирование винильной группы 13-амидов хлорина е6 с гликоль ными заместителями в положении 15 (201–205) проводили при кратковременном (20-30 минут) кипячении хлоринов (201–205) с избытком бис(N,N диметиламино)метана (117) в смеси ТГФ с АсОН аналогично описанной в литературе реакции [120]. В результате образуются дважды аминометилированные по винильной группе 13-амиды хлорина е6 с олигоэтиленгликольными заместителями по положению 15 (233–237) (схема 56). CH3I СН3 е
Оценка гидрофильности производных хлорофилла а с фрагментами олигоэтиленгликолей на основании данных ВЭЖХ
Внедрение фрагмента любого фрагмента олигоэтиленгликоля в любое положение макроцикла существенно увеличивает хроматографическую подвижность на обращенной фазе (время удерживания уменьшается на 3-5 минут). Сходный эффект дает и внедрение второго полиэфирного фрагмента. Сопоставление хроматографических характеристик полученных в работе олигоэтиленгликольных производных (159, 188–208, 210–214) (таблица 1) позволяет отметить следующие особенности влияния структуры на гидрофильность полученных соединений. Из структурных факторов наиболее сильно влияет наличие/отсутствие экзоцикла и положение олигоэтиленгликольного фрагмента в макроцикле. Переход от форби-новых производных к хлориновым приводит, при прочих равных условиях (длина олигоэтиленгликольной цепочки и количество одинаковых заместителей), к повышению гидрофильности соединения. Так, переход от 13(2)-гликольных производных (159, 191–194) к соответствующим хлоринам (201–205) приводит к уменьшению времени удерживания примерно на 0.5-1.5 мин. Аналогично при переходе от форбиновых производных с полиэфирным фрагментом в положении 17 (188–190) к хлоринам с таким же фрагментом в том же положении (198–200) время удерживания уменьшается на 2-3 мин. При прочих равных условиях изомерные производные с фрагментом олигоэтиленгликоля в положении 17 имеют большую хроматографическую подвижность, чем производные с гликольным фрагментом в положении 13(2) (в случае форбиновых производных) или в положении 15 (в случае хлоринов). Так, время удерживания производных хлорина е6 с фрагментом олигоэтиленгликоля в положении 17 (198–200) примерно на 2 мин меньше, чем у аналогичных производных с фрагментом полиэфира в положении 15 (201–203). Разница во времени удерживания в случае форбиновых производных в аналогичных парах составляет, как правило, около 1 мин. Влияние длины олигоэтиленгликольной цепочки на хроматографическую подвижность производных значительно меньше влияния структурных факторов. Времена удерживания этих производных очень близки и разница этих величин для соединений, сходных по структуре, как правило, не превышает 0.5 мин. Интересно, что гладкого увеличения хроматографической подвижности с удлинением полиэфирной цепочки во многих случаях не наблюдается, что, по всей видимости, связано со сложным характером взаимодействия олигоэтиленгликольного фрагмента молекулы с неподвижной фазой. Таким образом, результаты оценки гидрофильности производных хлорофилла а с фрагментами олигоэтиленгликолей различной длины позволяют заключить, что для синтеза гидрофильных производных можно использовать более доступные ди-, три- и тетраэтиленгликоли вместо менее доступных пента- и гексамеров.
Ковалентное связывание фрагментов олигоэтиленгликолей с фрагментами производных хлорофилла а может существенно изменить их биологическую активность. В связи с этим нами была выполнена оценка темновой цитотоксичности полученных производных хлорофилла с полиэфирными фрагментами на периферии макроцикла. Оказалось, что в целом влияние внедрения олигоэтиленгликоль-ного фрагмента на темновую цитотоксичность неоднозначно и, как и в случае гидрофильных свойств, сильно зависит от строения макроцикла, положения полиэфирного заместителя, причем внедрение одного и того же олигоэтиленгликоль-ного фрагмента в молекулы разных производных хлорофилла а может привести как к усилению, так и к ослаблению темновой цитотоксичности. Так, например, в то время как внедрение фрагмента диэтиленгликоля (138) в положение 17 метил-феофорбида а (158) и метилпирофеофорбида а (55) приводит к уменьшению токсичности соответствующего производного, при внедрении этого же фрагмента в положение 17 13(1)-N-метиламид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е6 (217) приводит к существенному усилению токсичности (рисунок 18). Усиление токсичности при концентрации 100 мкМ происходит и в случае производного ме-тилфеофорбида а с фрагментом ДЭГ в положении 13(2) (191). Разный характер влияния внедрения фрагмента одного и того же олигоэтиленгликоля свидетельствует о том, что гидролиз сложноэфирной связи ферментами клетки не происходит и действует молекула в целом.
Удлинение полиэфирной цепочки приводит к некоторому снижению токсичности в ряду 13(2)-эфиров метилфеофорбида а (A, B (n=1-5)) (рисунок 19) и метилпирофеофорбида а по положению 17 (рисунок 20). В случае метиламидных производных с полиэфирными фрагментами в положении 15 производные с четным количеством звеньев в полиэфирной цепочке значительно токсичнее, чем производные с нечетным количеством звеньев (рисунок 21).
Таким образом, предварительная оценка темновой цитотоксичности производных хлорофилла с фрагментами олигоэтиленгликолей показывает, что внедрение фрагмента не приводит к заметному увеличению токсичности при концентрациях до 1 мкМ, поэтому все соединения могут рассматриваться в качестве потенциальных ФС. Темновая токсичность во всех случаях значительно снижается при переходе от мономерных хлоринов к димерным вне зависимости от строения макроциклов, объединенных в димер, поэтому димерные производные перспективны для дальнейшего исследования в качестве ФС.
![Использование нафталинового комплекса [CpRu(C10H8)]+ в качестве синтона фрагмента [CpRu]+](/i/i/4373/462256.png "Использование нафталинового комплекса [CpRu(C10H8)]+ в качестве синтона фрагмента [CpRu]+ Карслян, Эдуард Эдуардович")
