Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Выбор объекта исследования 7
1.1.1. Стволовые клетки и канцерогенез 7
1.1.2. Сигнальные пути Wnt/Fzd 9
1.1.3. Белки Wnt и Fzd-рецепторы как биомишени для создания новых лекарственных препаратов 12
1.2. G-белок сопряженные рецепторы 14
1.3. Органические соединения, регулирующие сигнальный путь Wnt/Fzd 15
1.4. Пептидомиметики 19
1.5. Компьютерные методы моделирования 23
1.5.1. Моделирование по гомологии 24
1.5.2. Виртуальный скрининг 26
1.5.3. Дизайн органических соединений методом de novo 28
1.5.4. De novo моделирование пространственной структуры белков 30
1.5.5. Белок-белковый докинг 31
ГЛАВА 2. Моделирование пространственной структуры CRD-доменов FZD-рецепторов человека 33
2.1. Построение моделей пространственной структуры CRD-доменов 33
2.2. Моделирование полной пространственной структуры hFzdl-рецептора с использованием методов de novo дизайна 35
2.3. Анализ общих элементов структуры димерных CRD-доменов Fzd-рецепторов человека 39
2.4. Межсубъединичные взаимодействия в mFzd8 и hFzdS-рецепторах 46
ГЛАВА 3. Построение моделей пространственной структуры белков wnt человека и их комплексов с FZD-рецепторами 50
3.1. Построение пространственной модели структуры белка xWnt8 и его комплекса с CRD-доменом mFzd8-peu,enTOpa 50
3.2. Построение комплекса белка xWnt8 и димерного CRD-домена mFzd8-рецепторов методом белок-белкового докинга 54
3.3. Построение модели димерного xWnt8 белка 64
ГЛАВА 4. Сравнение моделей CRD-доменов HFZD- рецепторов и методы дизайна селективных органических соединений 66
4.1. Сайты связывания на поверхности димерных CRD-доменов Fzd-рецепторов 71
4.2. Сравнительный анализ димерных CRD-доменов рецепторов hFzd8nhFzd5 78
4.3. Сравнение сайтов связывания CRD-доменов рецепторов hFzdl, hFzd2, hFzd7nhFzd8 82
4.4.Сравнение рецепторов hFzd4 и hFzd8 88
4.5. Пути повышения селективности лигандов к рецепторам hFzd6 93
4.6. Структура CRD-доменов рецепторов группы hFzd9-10 97
4.7. Пептидные лиганды как ингибиторы димеризации CRD-доменов 101
ГЛАВА 5. Сравнение моделей белков WNT человека и дизайн фармакофорных групп селективных органических соединений 103
5.1. Белки xWnt8-hWnt8a-hWnt8b и фармакофорные группы селективных органических соединений 107
5.2. Увеличение селективности органических соединений к белкам hWnt8 и hWnt2b 109
5.3. Анализ различий в области 1 белков hWnt8 и hWnt3a 112
5.4. Сравнение сайтов связывания на поверхности белков hWnt8 и hWnt4 114
5.5. Анализ областей докинга лигандов для белков hWnt8 и hWntl 1 118
ГЛАВА 6. Дизайн органических соединений -перспективньгх агонистов и антагонистов WNT-FZD взаимодействий 122
6.1. Выбор сайтов связывания на поверхности биомишеней 122
6.2. Виртуальный скрининг 123
6.2.1. Выбор базы данных органических соединений 123
6.2.2. Подготовка базы данных 124
6.2.3. Сравнение жесткого и гибкого докинга 126
6.2.4. Подготовка биомишеней 127
6.2.5. Процедура виртуального скрининга (докинга) 128
6.2.6. Обработка и анализ результатов 130
6.2.7. Анализ результатов виртуального скрининга 131
6.3. Моделирование новых структур лигандов методами de novo 144
Выводы 154
Список литературы 155
- Белки Wnt и Fzd-рецепторы как биомишени для создания новых лекарственных препаратов
- Моделирование полной пространственной структуры hFzdl-рецептора с использованием методов de novo дизайна
- Построение комплекса белка xWnt8 и димерного CRD-домена mFzd8-рецепторов методом белок-белкового докинга
- Сравнение сайтов связывания CRD-доменов рецепторов hFzdl, hFzd2, hFzd7nhFzd8
Введение к работе
Одним из наиболее актуальных направлений в современной химической науке является создание лекарственных соединений, селективно влияющих на различные формы онкологических заболеваний. Не менее актуальной и важной является задача поиска малых молекул, способных регулировать активность участия стволовых клеток взрослого организма в процессе регенерации тканей. Эти два направления взаимосвязаны между собой на уровне участвующих в них сигнальных путей.
Примером таких путей, передающих сигналы между клетками, является путь Wnt/Frizzled - один из наименее изученных и, в то же время, один из наиболее важных путей передачи сигнала в процессах онкогенеза и формирования тканей.
Белки Wnt отвечают за передачу межклеточных сигналов внутрь клетки посредством взаимодействия с трансмембранными рецепторами Frizzled (далее -Fzd).
Понимание молекулярных основ взаимодействия белков Wnt и Fzd-рецепторов может позволить конструировать малые молекулы, способные оказывать селективное воздействие на сигнальный путь Wnt/Fzd и, соответственно, способных ингибировать процессы канцерогенеза (антагонисты) и активировать процессы образования новых тканей (агонисты).
В настоящее время отсутствуют какие-либо данные о пространственной структуре белков Wnt и Fzd-рецепторов человека в связи со сложностью их экспериментального изучения, что делает методы молекулярного моделирования крайне важными для изучения строения и функционирования белков Wnt и Fzd-рецепторов. На данный момент отсутствуют публикации о природных или синтетических малых молекулах, взаимодействующих непосредственно с этими биомишенями.
Целью данной работы является построение молекулярных моделей Wnt-белков человека, CRD-доменов рецепторов Frizzled (Fzd), изучение Wnt-Fzd взаимодействий и использование построенных молекулярных моделей для
компьютерного дизайна органических соединений - перспективных селективных агонистов и антагонистов сигнального пути Wnt/Fzd. На рис.1 приведена общая схема работы.
Димерный
CRD-домен
рецептора
Fzd8- мыши
(рентген)
Модель de novo
белка Wnt8
шпорцевой
лягушки
Сфокусированные
выборки соединений к
исследованным
биомишеням
Модели CRD-
доменов
Fzd-рецепторов
человека
Модели белок-белковых комплексов (CRD)i-Wnt
Модели белков Wnt человека
Л V
Виртуальный скрининг коммерчески доступных
баз данных органических соединений
Области для виртуального скрининга баз органических
соединений
Методы
повышения
аффинности и
селективноси
органических
лигандов
Пептиды и
модифицированные
пептиды - ингибиторы
\7
Дизайн новых
соединений -
увеличение
аффинности
Дизайн новых соединений - увеличение
селективности к различным
биомишеням внутри семейств белков
Wnt и Fzd-рецепторов
Рис. 1. Общая схема исследования.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ Таблица 1. Сокращения названий аминокислот, использованные в работе.
N- и С- концы белка - участки нециклических белков, соответствующие -NH2 и -СООН группам на окончаниях пептидной цепи. CRD - участок, обогащенный цистеинами. А.О. - аминокислотные остатки.
Белки Wnt и Fzd-рецепторы как биомишени для создания новых лекарственных препаратов
Во взрослом организме человека существует более двухсот типов клеток. Большинство клеток взрослого организма являются специализированными. Все эти типы клеток появляются в результате процесса дифференцировки из стволовых клеток в процессе развития эмбриона. В отличие от специализированных клеток, стволовые клетки являются неспециализированными до тех пор, пока не получат сигнал дифференцировки. Стволовые клетки могут претерпевать симметричное или несимметричное деление. Во время симметричного самообновления стволовая клетка делится на две идентичных новых стволовых клетки, в случае же несимметричного деления стволовая клетка делится на новую стволовую клетку и на дифференцированную клетку [1,2].
Стволовые клетки присутствуют в организме животных в течение всей жизни, начиная с момента эмбриогенеза и до смерти. Функции взрослых стволовых клеток заключаются в образовании и дальнейшем поддержании в функциональном состоянии тканей [2-4]. При отсутствии внешних негативных воздействий на организм стволовые клетки взрослого организма неактивны и находятся в т.н. «дормантном» (спящем) состоянии. Активность стволовых клеток взрослого организма регулируется сигналами от окружающих клеток, совокупность которых называют стволовой нишей [6]. На данный момент стволовые ниши были обнаружены в различных типах тканей человека [7, 8]. У взрослых организмов стволовая ниша предотвращает канцерогенез за счет контроля над судьбой стволовых клеток - поддерживая их в неактивном состоянии в отсутствие внешних сигналов и поддерживая баланс между самообновлением и дифференцировкой.
Процессы регуляции активности клеток, их роста и деления тесно связаны с процессами канцерогенеза. Большая часть путей, передающих сигнал активации к симметричному делению стволовых клеток также поддерживают неограниченное деление раковых тканей. Таким образом, при осуществлении регенерации тканей необходимо использовать методы, не провоцирующие процессы канцерогенеза и в то же время при лечении различных форм рака необходимо свести к минимуму негативное воздействие на правильное функционирование стволовых и специализированных клеток. Такой баланс должен поддерживаться за счет селективной, контролируемой активации или ингибирования сигнальных путей, отвечающих за регенерацию тканей или приводящих к неконтролируемому делению клеток т.е. к раку.
Основными сигнальными путями, которые отвечают за регуляцию поведения стволовых клеток в стволовой нише, являются сигнальные пути: Wnt/Fzd, Shh и Notch [9, 10]. Для каждого из этих сигнальных путей имеется множество данных об участии в самообновлении стволовых клеток и регенерации тканей, а также о возможности лечения ряда раковых заболеваний за счет ингибирования этих же сигнальных путей [11-14]. Сигнальный путь Wnt/Fzd является наиболее разнородным по числу участников и по числу регулируемых процессов. В то же время этот сигнальный путь является одним из наименее изученных.
Действие этого типа сигнальных путей было обнаружено на таких процессах, как контроль асимметричного деления, образование оси симметрии у Drosophila и развитие центральной нервной системы у позвоночных, а также при анализе причин онкологических заболеваний [15, 16]. Название белков Wnt происходит от комбинации названия гена Wingless - мутация которого приводит к нарушению формирования крыльев у мух и гена Int-1 гомологичного белка Wnt у мышей, который отвечает за индуцирование рака одним из типов онковирусов. Слово Frizzled в контексте рецепторов Frizzled переводится как "завитые".
Секретируемые белки Wnt передают межклеточный сигнал внутрь клетки через взаимодействие с Fzd-рецепторами (рис. 2) [17-19]. Далее сигнал передается за счет активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые влияют на клеточную дифференцировку, деление клеток, клеточную подвижность и клеточную полярность [20, 21].
Ингибирование сигнального пути Wnt/Fzd может приводить к остановке роста злокачественных образований и даже к появлению признаков дифференцировки обратно в нормальные клетки [22, 23]. В настоящее время изучено множество Fzd-рецепторов у различных видов организмов [24, 25]. У человека известно 19 белков Wnt и 10 Fzd-рецепторов, а также несколько Fzd-подобных белков, предположительно взаимодействующих с белками Wnt [26]. Все Fzd-рецепторы имеют N-концевую сигнальную последовательность, высококонсервативный CRD-домен, содержащий 10 консервативных цистеиновых остатков, линкерную часть, трансмембранный домен, содержащий 7 трансмембранных а-спиралей и шесть гидрофильных внутриклеточных и внеклеточных петель, а также С-концевой участок, отвечающий за передачу внутриклеточного сигнала [19, 27]. Доказано, что во взаимодействиях с белками Wnt участвуют CRD-домены Fzd-рецепторов [28-30]. Существует также семейство секретируемых Fzd-подобных белков (SFRP), содержащих CRD-домен и, предположительно, играющих роль антагонистов Fzd-рецепторов при взаимодействии с белками Wnt. Белки SFRP играют важную роль в инициировании апоптоза и предотвращении канцерогенеза и регуляции сигнальных путей Wnt/Fzd [31-35].
Моделирование полной пространственной структуры hFzdl-рецептора с использованием методов de novo дизайна
Для построения моделей пространственной структуры CRD-доменов hFzd-рецепторов был проведен поиск гомологичных белков с экспериментально изученной третичной структурой в базе данных PDB (protein data bank, www.RCSB.org), а также поиск методом протягивания с использованием программы mGenThreader сервера PSIPRED. В итоге были найдены две структуры с кодами 1IJY и 1IJX, соответствующие CRD-домену FzdS-рецептора мыши (mFzd8) и CRD-домену внеклеточного Fzd-подобного белка SFRP3 мыши соответственно, которые также описаны в статье [28].
В качестве белка-шаблона в работе была выбрана структура CRD-домена mFzd8 (мышиного Fzd-рецептора) из базы PDB-структур RCSB.ORG, с хорошим разрешением (1.35 А), имеющая высокую степень идентичности (70-80%) с CRD-доменами FzdS-рецепторов человека (рис. 8), что позволило использовать метод моделирования по гомологии, тем самым значительно повысив точность предсказания структуры.
Для моделирования по гомологии в работе была использована программа Modeller8vl, которая хорошо отвечает нашим задачам построения молекулярных моделей белков по гомологии с белком-шаблоном. Поскольку Fzd-рецепторы активируют канонический сигнальный путь, находясь в димерном состоянии, была построена модель димерных CRD-доменов в соответствии со структурой шаблона-димера CRD-домена Fzd8-рецептора [156].
Положение CRD-доменов для Fzd-рецепторов человека определялось с помощью попарного выравнивания аминокислотных последовательностей белка-шаблона и аминокислотных последовательностей Fzd-рецепторов человека, которое было выполнено с помощью программы ClustalX, с матрицей идентичности Blossum32. Аминокислотные последовательности были взяты из базы Protein сервера NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Также были построены модели пространственной структуры мономерных CRD-доменов Fzd-рецепторов. Именно для мономерного домена и был проведен первоначальный белок-белковый докинг de novo структуры белка xWnt8. По результатам белок-белкового докинга, а также благодаря сравнительному анализу электростатических и гидрофобных поверхностей мономерных и димерных CRD-доменов был сделан вывод о возможности расположения на межмолекулярной поверхности, образуемой димерными CRD-доменами, потенциального сайта связывания низкомолекулярных лигандов, а также участков, взаимодействующих с белками Wnt. При этом важно отметить, что в димерном CRD-домене образуется дополнительная гидрофобная полость, которая отсутствует в мономерном CRD-домене.
Для всех структур димерных CRD-доменов были использованы кольмановские зарядовые схемы, после чего для всех полученных структур димерных CRD-доменов hFzd-рецепторов была проведена оптимизация геометрии методом Powell с помощью силового поля Tripos программного комплекса Sybyl7.3 [118].
Качество полученных структур проверялось программой Procheck, модулем Check Protein программы Sybyl7.3 и сервером ProSa. Кроме того, был проведен сравнительный анализ среднеквадратичных отклонений (RMSD) для построенных моделей и белка шаблона с помощью программы VMD 1.8.6. [157]. Все значения RMSD моделей к шаблону - ниже порога в 3 А, который часто используется как критерий качества пространственной структуры, полученной моделированием по гомологии с шаблоном, в случае наличия высокой идентичности между моделью шаблона и моделируемым белком. Для liFzd8-pe4enTopa CRD-домен идентичен CRD-домену гпРгё8-рецептора. Наибольшая степень структурной близости к шаблону наблюдается у белка hFzdlO, который имеет точное совпадение расположения дисульфидных связей с белком hFzd8, а также hFzd5, который имеет наиболее высокую степень идентичности с hFzd8 по первичным аминокислотным последовательностям.
Для получения более полной информации о функциях CRD-домена Fzd-рецепторов важно понимание роли N-концевого участка CRD-домена, роли линкера между CRD-доменом и трансмембранной частью, а также ориентации CRD-домена относительно трансмембранной части. Поэтому очень важным является знание полной структуры hFzd-рецепторов. Кроме того, было интересно протестировать предсказательную способность программы Rosetta для de novo дизайна полной пространственной структуры Fzd-рецепторов. Поэтому с использованием программы Rosetta (сервер robetta) в работе были созданы полные de novo модели Fzdl-рецептора человека, для которых точно известно участие в каноническом Wnt/Fzd-сигнальном пути. В результате получено десять различных пространственных структур hFzdl -рецептора (рис. 9). Анализ участков Fzdl-рецептора, для которых известны аналоги, показал достаточно высокую предсказательную способность программного комплекса Rosetta. В частности, были правильно распознаны число и длина трансмембранных а-спиралей и внутриклеточной а-спирали, ориентация и взаимное расположение которых соотносятся с аналогичным расположением а-спиралей для известных G-белок сопряженных рецепторов. Димерный CRD-домен был распознан с достаточно высоким RMSD по сравнению со структурой 1IJY для всех десяти альтернативных моделей. Однако ряд различий среди полученных структур не позволяет сделать однозначного выбора для предсказания полной структуры Fzdl-рецептора и ориентации CRD-домена относительно трансмембранного домена.
Если отбросить все модели, в которых CRD-домен находится на уровне трансмембранного домена, то в большинстве остальных моделей он ориентирован в сторону клеточной мембраны под различными углами, в том числе и перпендикулярно. Таким образом, с учетом приведенных выше ограничений на ориентацию CRD-домена относительно трансмембранной части в качестве наиболее вероятных можно рассматривать структуры Fzdl-1, Fzdl-8, Fzdl-2 и hFzdl-9, Fzdl-10.
Построение комплекса белка xWnt8 и димерного CRD-домена mFzd8-рецепторов методом белок-белкового докинга
В межсубъединичных взаимодействиях в гомодимере hFzd8 принимают участие как гидрофобные, так и полярные аминокислотные остатки, а также заряженные аминокислоты, участвующие в образовании солевых мостиков.
Анализ поверхности белок-белковых взаимодействий показал, что гомодимер CRD-доменов не является абсолютно симметричным (рис. 14, рис.15). Кроме того, такая асимметрия гомодимера включает в себя так называемую ротационную асимметрию некоторых аминокислотных остатков, например, Тугі 00, которая наблюдается часто при различных конформационных переходах из-за невозможности одновременного принятия одинаковой конформации для двух аминокислот, находящихся напротив друг друга. Стерические затруднения, возникающие при принятии идентичными аминокислотными остатками идентичных ориентации приводят к изменению взаимной ориентации белков в гомодимере и возникновению частичной или полной асимметрии. Кроме асимметричности взаимного расположения аминокислотных остатков Asp99, Тугі 00 и Lyl02 наблюдается также асимметричность ориентации Metl49, который для одного из CRD- доменов не может принять идентичную ориентацию со вторым Met 149 из-за стерических затруднений, вызванных боковой группой Leu 147 второго CRD-домена. Важно отметить, что Met 149 входит в состав CMD-мотива, для которого известна важность для активации сигнального пути Wnt/Fzd с помощью аланинового скрининга и трипептидных вставок. Исходя из этих данных, мы предполагаем, что ротационная асимметрия Тугі 00 и частичная асимметрия гомодимера, а также ее возможное изменение при взаимодействии с белком Wnt может участвовать в конформационном переходе, отвечающем за активацию/дезактивацию димерного CRD-домена.
В работе [84] сделано предположение о возможности ингибирования белками SFRP канонического сигнального пути Wnt/Fzd за счет образования гетеродимеров с рецепторами Fzd. На основе анализа различий в симметричности и асимметричности димеров Fzd и SFRP мы предполагаем, что в стабилизации таких гетеродимеров Fzd/SFRP, а также FzdKaH0HH4ecK„a /Fzd„eKaHonH4ecKHH могут участвовать белки типа Wnt5a/Wntll, которые известны как ингибиторы канонического и активаторы неканонических сигнальных путей.
Переход от симметричных димерных CRD-доменов к симметричному гетеродимеру должен происходить легче, чем переход между асимметричным гомодимером и симметричным гетеродимером. А поскольку мы предполагаем, что гетеродимер скорее имеет симметричную конформацию, близкую к структуре димеров SFRP(CM. глава 2), это означает, что переход между гетеро-и гомодимерами для hFzdl, 2, 7 будет происходить легче, чем в hFzd5, 8. В таком случае, в соответствии с нашей гипотезой о важности асимметрии и симметрии для hFzdl, 2, 7, возможность переключения между каноническим и неканоническим сигнальными путями будет в большей степени зависеть от взаимодействующих с ними белков Wnt. Белки Wnt в таком случае должны стабилизировать гомодимерную асимметричную, или гетеродимерную симметричную конформации и соответственно переключать канонические и неканонические сигнальные пути.
Взаимодействия между CRD-доменами в димере hFzd8-pe4em:opa приведены на рис. 15. Аминокислота Argl53(l) образует солевой мостик с аминокислотой Glu 140(2). Аминокислотный остаток Pro 144(2) находится в окружении гидрофобных аминокислот от первой субъединицы: Пе95(2), Пе97(2), Tyrl51(l), Metl49(l), Glyl42(l). При этом -SCH3 группа Metl49(l) ориентирована в противоположную сторону по отношению ко второму CRD-домену. Аминокислотный остаток Gly 142(1) создает дополнительный карман для Рго144(2). Карбонильные группы амидных связей аминокислот Aspl50(2) и Asn 152(2) образуют водородные связи с амидогруппой боковой цепи аминокислотного остатка Glnl41(l). Для гидрофобных аминокислот Leul47(l) и Leul47(2) наблюдаются симметричные гидрофобные взаимодействия друг с другом. Аминокислота Рго144(1) (как и Рго144(2)) находится в окружении гидрофобных заместителей Metl49(l), Туг151(1), Glyl42(2), образующих гидрофобный карман за счет своих гидрофобных групп и полости, образуемой Gly 142(2). Аминокислоты Ие95(2), Leu97(2) находятся значительно дальше от пролина, чем для другого CRD-домена, что опять же показывает асимметричность димера на уровне белок-белковых взаимодействий. Карбонильная группа Gly 142(2) образует водородную связь с NH-группой аминокислотного остатка Asnl52(2).
Сравнение сайтов связывания CRD-доменов рецепторов hFzdl, hFzd2, hFzd7nhFzd8
Далее была оценена комплементарность положительно и отрицательно заряженных областей, а также число аминокислот xWntS-белка и димерного CRD-домена, находящихся на расстоянии менее 5А (максимальное расстояние для учета энергетических вкладов образования солевых мостиков) друг от друга [160]. В соответствии с моделью положительно заряженные области на поверхности белка xWnt8 расположены напротив отрицательно заряженной области на поверхности CRD-домена mFzd8-peueiiTOpa (рис. 18).
Электростатическая поверхность димерного CRD-домена mFzd8-рецептора. Синяя область - наибольшая концентрация отрицательного заряда, оранжевые области - наибольшая концентрация положительных зарядов.
В соответствии с построенной моделью белок xWnt8 состоит из двух доменов. Один домен образован десятью а-спиралями, второй домен состоит из одного р-листа (состоящего из трех (З-структур) и одной а-спирали (рис. 16).
Наличие большого числа глицинов, локализованных близко друг к другу в пространстве, может свидетельствовать о функциональной важности образуемой ими полости. Можно предположить, что наличие пяти глицинов в районе предполагаемого сайта связывания белка xWnt8 с CRD-доменом mFzd8-рецепторов указывает на важность наличия свободного пространства в этом участке. Было сделано предположение о возможности образования следующих дисульфидных связей цистеиновыми остатками, расположенными на расстоянии менее 3 А (с учетом погрешности моделирования) в xWntS-белке: Cys325-328; Cys276-298; Cysl90-195; Cys55-105; Cys325-328; Cys291-321; Cysl33-260; Cys315-337. Из этих дисульфидных связей в районе потенциального связывания xWnt8-белка с CRD-доменом в соответствии с построенной моделью находятся: Cys291-321, Cysl90-195, Cys325-328 дисульфидные связи.
Модель xWntS-белка была взята в качестве шаблона для моделирования по гомологии структуры семейства белков Wnt человека и молекулярного комплекса белка hWnt8 с белком hFzd8. В качестве исходных аминокислотных последовательностей были использованы аминокислотные последовательности hFzdS-рецептора и hWntS-белка и других белков hWnt из базы данных последовательностей белков PROSITE сайта http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Для моделирования комплекса hWht8a-hFzd8 были построены попарные выравнивания аминокислотных последовательностей моделируемых белков и белков-шаблонов mFzd8 и xWnt8, соответственно (рис. 8 и рис. 19). В соответствии с построенными попарными выравниваниями аминокислотных последовательностей была произведена замена неидентичных аминокислот с помощью программы Modeller8vl с последующей оптимизацией геометрии получаемых моделей. Далее для каждого из белков, участвующих в комплексе (hFzd8 и hWnt8a), были воссозданы дисульфидные связи в соответствии со сделанными нами ранее предположениями об их расположении в белке xWnt8, а для CRD-доменов hFzdS-рецепторов - в соответствии с их расположением в mFzd8-pe4enTope [161]. Также нами были сделаны предложения относительно расположения дисульфидных мостиков в структурах других белков hWnt (табл. 8). При этом важно отметить, что для некоторых цистеиновых остатков белков xWnt8 и hWnt8a возможны альтернативные варианты образования дисульфидных связей и точное предсказание положения дисульфидных мостиков затруднено.
Геометрия полученных белков hWnt8 была оптимизирована с помощью программного комплекса Sybyl 7.3. Качество построенных моделей проверялось с помощью программы Procheck, а также с помощью модуля CheckProtein программы Sybyl 7.3 и программой ProSa. Для моделей hWnt8-белка и CRD-домена hFzdS-рецептора соответственно методом моделирования по гомологии был построен белок-белковый комплекс hWnt8-hFzd8.
После изучения взаимодействий в белок-белковых комплексах была построена схема сайта связывания белка xWnt8 с димерными CRD-доменами mFzdS-рецептора и схема сайта связывания белка hWnt8 с димерными CRD-доменами hFzdS-рецептора. Было изучено расположение функциональных групп, образующих данные сайты связывания, и, в соответствии с расположением сайтов связывания, предсказаны основные фармакофорные группы селективных лигандов-ингибиторов взаимодействия CRD-домена с белком xWnt8 или белком hWnt8. Подробнее сайты связывания на поверхности белков Wnt описаны в главе 5
