УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия для медицинской диагностики Салмин, Владимир Валерьевич

Введение к работе

Актуальность темы. В современной медицинской диагностике широкое распространение получают оптические методы исследования живых тканей, получившие название «оптическая биопсия» (Optical Biopsy) (Bigio, 2003; Popp, 2006). В оптической биопсии используются как оптическая спектроскопия - абсорбционная, флуоресцентная, спектроскопия комбинационного рассеяния света, так и методы медицинской оптической визуализации - оптическая когерентная томография (Brezinski, 1996), конфокальная лазерная эндомикроскопия, эндоцитоскопия (Newton, 2011). Основное преимущество использования оптической биопсии заключается в высокой скорости проведения анализа. Вторым достоинством является возможность исследований с высоким пространственным разрешением. Уникальным свойством оптической биопсии является возможность прямого исследования метаболических превращений в клетках живых тканей (Adachi, 1999; Vishwasrao, 2005).

Среди методов оптической биопсии особое место занимает анализ люминесценции живых тканей. Во-первых, этот метод обладает наивысшей чувствительностью. Во-вторых, параметры люминесценции весьма чувствительны к состоянию микроокружения флуоресцирующего агента (флуорофора), что позволяет отслеживать степень его агрегации, свойства микроокружения, включая полярность и жесткость среды, наличие поблизости зарядов и молекул - акцепторов энергии электронного возбуждения. Флуоресцентные методы оптической биопсии можно условно разделить на два класса: 1) методы, основанные на регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров - аутофлуоресценции (Monici, 2005); 2) методы, использующие различные флуоресцирующие соединения - флуоресцентные метки и зонды, вводимые в ткань для визуализации исследуемых процессов (Michalet, 2005).

Использование собственной флуоресценции (аутофлуоресценции) для прижизненной диагностики тканей является наиболее привлекательным, поскольку практически не меняются условия протекания в них основных биохимических процессов. Собственная флуоресценция тканей in vivo исследуется достаточно давно. Накоплен значительный экспериментальный материал по использованию этого метода в диагностических целях в различных областях медицины - гастроэнтерологии (Лисовский, 1984; Beuthan, 1996; Cothren, 1990; Lin, 2003), онкологии (Alfano, 1984; Loschenov, 1994; Loschenov, 1992a), гинекологии (Agrawal, 1999; Belyaeva, 2003; Zuev, 2001), офтальмологии (Docchio, 1989), стоматологии (Amaechi, 2002; Matsumoto, 2000; Qin, 2007; Sinyaeva, 2004), дерматологии (Синичкин, 2007; Синичкин, 2001). Определены основные тканевые флуорофоры, разработаны различные прототипы установок для клинического использования (Loschenov, 1998; Meerovich, 1995; Meerovich, 1996; Rogatkin, 2009), предложено большое количество методик изучения типовых патологических процессов. Однако, несмотря на накопленный обширный экспериментальный опыт, широкого распространения этот метод в медицинской диагностической практике до сих пор не получил. Связано это с рядом причин. Во-первых, необходимо решить вопросы стандартизации методик исследований. Сказанное в полной мере относится и ко вновь разрабатываемым методикам. Во-вторых, требуют дополнительного исследования вопросы побочных эффектов УФ лазерного излучения на биологические ткани. Третьей причиной является проблема выбора лазерного источника для возбуждения аутофлуоресценции.

Длительное время для УФ возбуждения аутофлуоресценции живых тканей использовался импульсный лазер на молекулярном азоте (А=337,1 нм). Выбор именно этого лазера для возбуждения аутофлуоресценции тканей основан на том, что основной тканевый флуорофор - НАД(Ф)Н - имеет один из максимумов поглощения на длине волны 340 нм. Однако азотные лазеры имеют целый ряд недостатков, ограничивающих как точность исследований, так и потребительские свойства разработанных установок.

Среди основных потребительских характеристик лазеров для оптической биопсии можно назвать малогабаритность, надежность, стабильность, большой ресурс работы и невысокую стоимость. Флуоресцентный метод оптической биопсии используется в условиях значительного фонового освещения, поэтому для получения приемлемого отношения «полезный сигнал/фон» необходимо использовать высокую мощность возбуждающего излучения. Указанные параметры наиболее просто реализовать путем применения импульсно-периодических лазеров. При этом точность измерений будет зависеть от количества измерений сигнала флуоресценции, а время проведения анализа обратно пропорциональна частоте повторения импульсов. Немаловажную роль играет также качество лазерного пучка, поскольку системы доставки излучения до объекта исследования используют оптиковолоконную технику и требуют тщательного согласования лазерного пучка с оптическим волокном.

Таким образом, разработка приборов и методов лазер-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии для медицинской диагностики является одним из актуальных направлений лазерной физики.

Цель работы. Разработка физических основ применения новых эффективных источников УФ лазерного излучения для лазер-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии биологических тканей в медицинской диагностике.

Задачи работы:

1. Поиск новых эффективных методов возбуждения импульсных газовых лазеров и лазеров на красителях. Изучение физических процессов в азотных лазерах и разработка эффективных источников УФ лазерного излучения на их основе.

2. Разработка физических основ методов лазерной УФ-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии для задач медицинской диагностики.

3. Исследование фотофизических процессов и фотобиологических эффектов при воздействии интенсивного лазерного излучения на основные эндогенные хромофорсодержащие молекулы.

Научная новизна.

3. 1. Впервые показана высокая эффективность возбуждения азотного лазера (337,1 нм) с продольным разрядом от генератора наносекундных импульсов с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса (КПД=0,15 %, E= 1 мДж).

   2. Впервые получена генерация в волноводном азотном лазере (337,1 нм) в режиме самопробоя от источника постоянного напряжения.

   3. Впервые получена генерация на лазере на красителе родамин 6G при возбуждении волноводным азотным лазером, а также перестраиваемая генерация (555-580 нм) лазера на красителе родамин 6G при возбуждении азотным лазером с магнитным сжатием импульса возбуждения.

   4. Впервые показано, что аутофлуоресценция органов брюшной полости (in vivo), индуцированная излучением азотного лазера (337 нм), имеет достоверно отличающиеся спектры при воспалении (перитонит).

   5. Впервые показано, что при аутофлуоресценции миокарда (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), динамика флуоресценции в течение 20 мин периода острой ишемии на длинах волн 430 и 470 нм имеет монотонный характер, и достоверно отличаются как динамика флуоресценции, так и спектры флуоресценции миокарда, подвергавшегося и не подвергавшегося кардиоплегической защите. Постоянные времени динамики флуоресценции претерпевают значимые изменения при использовании в кардиоплегическом растворе модификаторов гемопротеидов.

   6. Впервые показано, что при аутофлуоресценции твердой мозговой оболочки (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), спектры флуоресценции до и во время острой ишемии мозга значимо отличаются. Наибольшие отличия в нормированных спектрах флуоресценции наблюдаются на длинах волн 430 и 470 нм.

   7. Впервые показано, что при аутофлуоресценции хрусталика человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), наибольшее отличие в нормированных спектрах здоровых и пораженных возрастной катарактой хрусталиков наблюдается на длине волны 440 нм, а на длинах волн 400 и 500 нм амплитуды нормированных спектров не отличаются.

   8. С использованием разработанного спектрального критерия - индекса помутнения хрусталика - впервые показано, что индекс помутнения линейно зависит от стадии развития катаракты. Впервые предложена диагностическая формула расчета стадии развития катаракты на основании измерения индекса помутнения.

   9. Впервые показано, что при аутофлуоресценции роговицы человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), отношение интенсивностей флуоресценции на длинах волн 410 и 460 нм линейно возрастает с увеличением срока ношения контактных линз. Впервые продемонстрированы достоверные отличия указанного отношения при сроках ношения контактных линз 5 и 10 лет.

   10. Впервые показан иммуномодулирующий эффект высокоинтенсивного (1=0,5^5 МВт/см ) излучения азотного лазера (337 нм) в отношении иммунокомпетентных клеток.

   11. Впервые показано, что при активации макрофагов усиливается их аутофлуоресценция в области 440±10 нм при возбуждении излучением с длиной волны 340±10 нм.

   12. Впервые показано, что зависимость эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина от степени насыщения, имеющая максимум в области 50% насыщения, формируется за счет кооперативного характера связывания лиганда (СО) с гемоглобином.

   13. Впервые определен спектр эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина в области 550-585 нм при лазерном флеш-фотололизе в цельной крови человека.

   Практическая значимость работы.

   3. 13. 1. Разработано устройство магнитного сжатия и умножения напряжения импульса. По разработанной схеме создан высоковольтный генератор наносекундных импульсов со следующими параметрами:

          Энергия в импульсе 0,5 Дж Амплитуда напряжения выходного импульса 150 кВ Длительность фронта импульса напряжения 5 нс Частота следования импульсов 1000 Гц

          Генератор может быть использован для питания импульсных частотных нагрузок, импульсных газовых лазеров, ускорителей частиц, клистронов, магнетронов высоковольтными наносекундными импульсами с высокой частотой повторения.

          3. 13. 2. Разработан эффективный компактный азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса накачки. Лазер имеет следующие характеристики:

                 Длина волны 337,1 нм

                 Частота повторения 20 - 500 Гц

                 Длительность импульса на полувысоте 2 нс Энергия импульса 50 мкДж

                 Энергетическая нестабильность 5%

                 Импульсная мощность Средняя мощность Диаметр пучка Ресурс работы Расходимость пучка Потребляемая мощность Размеры

                 25 кВт

                 15 мВт при 400 Гц 2 мм круглое сечение 1.2*10⁹ имп.

                 3 мрад 150 Вт при 400 Гц 30 x 15 x 15 см

                 Лазер предназначен для использования в следующих областях: флуоресцентная спектроскопия с высоким временным разрешением, экологический мониторинг водоемов и почвы, медицина, оптическая биопсия, лазерная масс-спектрометрия, квантовая электроника.

                 3. С использованием малогабаритного азотного лазера с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса накачки создан прототип лазерного автоматизированного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучения для оптической биопсии. Комплекс имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений. Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели 0,3 - 20 нм. Частота измерений 1000 с^-1.

                 4. Разработаны и протестированы оригинальные спектрофлуориметрические методики оценки состояния тканей (in vivo):

                 2. брюшной полости при перитоните;

                 3. миокарда при ишемии в условиях кардиопротекции;

                 4. головного мозга при аноксии и ишемии;

                 5. хрусталика при различных стадиях развития возрастной катаракты;

                 6. роговицы при дегенеративных изменениях, связанных с длительным ношением контактных линз.

                 Положения, выносимые на защиту

                 1. Схема магнитного сжатия и умножения напряжения импульса позволяет

                 эффективно возбуждать газовые лазеры наносекундным продольным разрядом.

                 6. 14. В волноводных азотных лазерах с продольным разрядом реализуется механизм возбуждения генерации за счет самопробоя газа в лазерной ячейке в постоянном электрическом поле.

                    15. Волноводный азотный лазер и азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса эффективны для возбуждения лазеров на красителях.

                    16. УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия при возбуждении излучением азотного лазера информативна для операционного мониторинга тканей миокарда и головного мозга при острой ишемии, тканей внутренних органов при воспалении.

                    17. Результаты экспериментальных исследований, методы измерений, алгоритм обработки спектров УФ лазер-индуцированной аутофлуоресценции позволяют производить дифференциальную диагностику стадий развития возрастной катаракты; степени дегенерации роговицы, вызванной ношением контактных линз.

                    18. Излучение азотного лазера при высоких интенсивностях модулирует активность клеток иммунной системы (молекула-мишень - НАДФН).

                    19. Эффективность фотодиссоциации карбоксигемоглобина имеет спектральный максимум, соответствующий пику а полосы спектра поглощения, а зависимость модуляции оптической плотности от степени насыщения имеет максимум, связанный с точкой перегиба кривой насыщения.

                    Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в работе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, кафедры глазных болезней, кафедры хирургических болезней № 2, кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России, используются в образовательном и научно - исследовательском процессе на кафедре фотоники и лазерных технологий ФГАОУ ВПО СФУ.

                    Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: 1) Second International Conference on Laser Scattering Spectroscopy of Biological Objects Pecs, Hungary, 29 Aug. - 2 Sept., 1988; 2) V Всесоюзной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния света,

                    Ужгород, 1989; 3) Laser Applications in Life Sciences Moscow, Russia, 27 August, 1990; 4) First Russian-Chinese Seminar on Laser Physics and Laser Technology, Krasnoyarsk, Russia, June 2-8, 1993; 5) 5th International Conference on Laser Applications in Life Sciences. Minsk, Belarus, 28 June - 2 July, 1994; 6) Первая Всероссийская конференция токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии», Санкт-Петербург, 1995; 7) Laser Optics '95: Biomedical Applications of Lasers. St. Petersburg, Russia, 27 June 1995; 8) Russian-German Laser Symposium, St. Petersburg, Russia, 1-5 July 1995; 9) Third Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology Krasnoyarsk, Russia, October 8-10, 1996; 10) IV Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Irkutsk, Russia, 3-8 September, 1996; 11) Всероссийская научно- практическая конференция «Механизмы адаптации организма», Томск, 1996; 12) 7 Всероссийский симпозиум «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 17-22 марта 1996; 13) Гомеостаз и окружающая среда: VIII Всероссийский симпозиум, Красноярск, 1014 марта 1997; 14) VI Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Foundation, Khabarovsk, Russia, 1998; 15) IX Международный симпозиум «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; 16) XVI International Conference on Coherent and Nonlinear Optics, ICONO '98, Moscow, Russia, June 29- July 3, 1998; 17) 4th Chinese- Russian-Korean Symposium on Laser Physics and Laser Technology, Harbin, China, 1998; 18) VII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Hirosaki, Japan 16-17 September, 1999; 19) Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Достижения науки и техники - развитию сибирских регионов", Красноярск, 24-26 марта, 1999; 20) 10th European Students' Conference For Medical Students And Young Doctors, Berlin, Germany, 20-24 October 1999; 21) Научно- практическая конференция "Проблемы экологии и развитие городов" Красноярск, 5-6 июня 2000; 22) Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II Saratov Russia, 3 October 2000; 23) 3d International Symposium on Modern Problems of Laser Physics, Novosibirsk, 2000; 24) 10th Conference on Laser Optics, St Petersburg, Russia, 2000; 25) 5th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology - Tomsk: 2000; 26) VIII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Blagoveshchensk, 21-22 September, 2000; 27) 2-ая Всероссийская конференция «Достижения науки и техники — развитию Сибирских регионов», Красноярск, 2000; 28) I Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика-2001", 18-22 июня 2001; 29) V Международная конференция "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул" г.Томск, 9-14 сентября 2001; 30) ICONO 2001 - International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (XVII) Minsk, Belarus, June 26 - July 1, 2001; 31) 9th International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange, Kanazawa, Japan, 2001; 32) Atomic and Molecular Pulsed Lasers V Tomsk, Russia, Tomsk, 15-19 September 2003; 33) American Society for Microbiology Conference "Bio-, Micro-, and Nanosystems", New York, July 7 -10, 2003; 34) 2nd International conference "High medical technologies in XXI century" Benidorm, Spain November 1-8, 2003; 35) Optical Technologies in Biophysics and Medicine, V Saratov Fall Meeting, 2003; 36) XI Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Niigata, Japan 10-11 August, 2004; 37) IV International Symposium "Modern Problems of Laser Physics" MPLP'2004, Novosibirsk, Russia, 22 - 27 August, 2004; 38) DESORPTION-2004, Saint-Petersburg, Russia, August 29 - September 2, 2004; 39) The 7th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technologies, Tomsk, Russia, December 20, 2004; 40) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2005: Laser Technologies for Environmental Monitoring and Ecological Applications, and Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2005 St.Petersburg, Russia, May 11-15, 2005; 41) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2007: Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2007, Minsk, Belarus, 28 May 2007; 42) International Conference on Laser Applications in Life Sciences LALS 2007, Moscow, Russia,11-14 June 2007; 43) 18th International Laser Physics Workshop LPHYS' 09, July 13 - 17, 2009, Barcelona, Spain; 44) VI Russia-Japan Workshop "Integrative Neuroscience: Molecular and Translational Medicine", Krasnoyarsk, July 2011, семинарах и заседаниях кафедры квантовой электроники, кафедры фотоники и лазерных технологий Сибирского федерального университета (1990-2011 гг.), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого (2006-2011 гг.), кафедры биофизической генетики и молекулярной медицины Медицинского факультета Университета Канадзавы (Япония, 2010).

                    Публикации. По материалам диссертации опубликовано 61 печатная работа, из них 17 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получено 4 патента. Перечень основных 36 работ приведен в конце автореферата.

                    Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 301 странице текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 фотографий, 94 рисунка, 22 таблицы. Библиографический список включает 329 источников, из которых 30 отечественных и 299 иностранных.

                    Похожие диссертации на УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия для медицинской диагностики

                    Методы оптической спектроскопии для диагностики стоматологических заболеванийСухинина Алина Викторовна

                    Поляризационная спектроскопия плазмы и диагностика функции распределения электронов в электрическом полеМельничук, Сергей Васильевич

                    Эмиссионная спектроскопия в задачах диагностики лазерной плазмыБазаров, Иван Васильевич

                    

                    Нелинейная колебательно-вращательная спектроскопия неравновесных многокомпонентных газов и ее применение в диагностике атмосферыИванов Сергей Викторович

                    Метод дистанционной диагностики окружающей среды на основе эффекта СКР в УФ диапазоне длин волнЖарков Виктор Иванович

                    

                    Исследование характеристик генерации индукционного УФ азотного лазераЧуркин Дмитрий Сергеевич

                    

                    Импульсные газовые лазеры, возбуждаемые самостоятельным разрядом с автоматической УФ-предионизациейФедоров Анатолий Игнатьевич

                    Формирование УФ излучения с высокими спектрально-временными и пространственными характеристиками в эксимерных XeCl лазерах для воздействия на твердотельную мишеньСлободчиков, Евгений Викторович

                    Генерация сверхкоротких импульсов в лазере с керровской нелинейностью в резонаторе и применение этого лазера в нелинейной спектроскопии гладких и профилированных поверхностейАнгелуц, Андрей Александрович

                    Одночастотные инжекционные лазеры для атомной спектроскопии высокого разрешенияЯровицкий, Александр Владимирович