Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Интерференционная микроскопия и микротомография фазовых объектов
1.1 Интерференционная микроскопия фазовых объектов 15
1.2 Схемы интерференционных микроскопов 18
1.3 Современное состояние интерференционной микроскопии 33
1.4 Оптическая микротомография 44
1.5 Выводы 53
Глава 2 Автоматизированный интерференционный микроскоп Линника
2.1 Формирования интерференционного изображения в микроскопе Линника с широким источником пространственно-некогерентного света 55
2.2 Исследование контраста и области локализации интерференционной картины в микроскопе Линника 61
2.3 Функциональная схема автоматизированного микроскопа 65
2.4 Оптическая схема автоматизированного микроскопа 68
2.5 Выводы 78
Глава 3 Измерение интегральных параметров фазовых микрообъектов с помощью автоматизированного интерференционного микроскопа Линника
3.1 Измерение интегральных характеристик стационарных фазовых микрообъектов 80
3.1.1 Морфометрия по фазовым изображениям 80
3.1.2 Измерение массы сухих веществ клетки 83
3.2 Измерение интегральных характеристик нестационарных фазовых микрообъектов 91
3.2.1 Динамическая фазовая микроскопия 91
3.2.2 Измерение инкремента показателя преломления (массы сухих веществ) живой клетки во времени 94
3.3 Выводы 100
Глава 4 Измерение локальных параметров фазовых микрообъектов методами оптической микротомографии
4.1 Микротомограф на основе интерференционного микроскопа Линника. 101
4.2 Конфокальный томографический интерференционный микроскоп 109
4.3 Интерференционный томографический микроскоп с зеркальным иммерсионным конденсором 120
4.4 Выводы 139
Заключение 141
Список литературы 143
Приложение 1. Технические характеристики автоматизированного интерференционного микроскопа 150
- Схемы интерференционных микроскопов
- Исследование контраста и области локализации интерференционной картины в микроскопе Линника
- Морфометрия по фазовым изображениям
- Конфокальный томографический интерференционный микроскоп
Введение к работе
Актуальность темы определяется недостаточностью разработки количественных методов исследования фазовых микрообъектов и измерения их интегральных и локальных параметров.
Фазовые микрообъекты, прозрачные для излучения. видимого оптического диапазона, широко распространены как в промышленности, так и в биологии и медицине. К ним относятся различные полимерные пленки, кристаллы, оптические микродетали, оптоволоконные изделия, и, наконец, биологические микрообъекты - клетки и др. Эти объекты описываются трехмерным (3D) пространственным распределением показателя преломления n(x,y,z), с которым связаны плотность, температура, концентрация и другие физические параметры объекта [ 1 ].
При изучении фазовых объектов сразу встает задача их визуализации. На сегодняшний день она решена, широко известны следующие методы: фазовый контраст (метод Цернике), интерференционный контраст, дифференциально-интерференционный контраст (метод Номарского, DIC), метод темного поля, поляризационный контраст и пр [2]. Однако в настоящее время при исследовании фазовых микрообъектов требуется не только наблюдать и оценивать различные геометрические параметры (площадь, периметр), но и проводить измерения их локальных и интегральных характеристик.
Исходным измеряемым параметром фазового микрообъекта является оптическая разность хода (ОРХ). Это интегральная характеристика, так как ОРХ представляет собой интеграл от функции распределения показателя преломления вдоль луча или одномерную (ID) луч-сумму. Двумерное (2D) распределение ОРХ, полученное вдоль набора параллельных лучей является параллельной 2D проекцией, а вдоль набора лучей, пересекающихся в одной точке - конусной 2D проекцией. Будем далее называть 2D распределение ОРХ фазовым изображением.
5 По набору значений ОРХ, измеренных при различных углах зондирования, можно реконструировать 3D пространственное распределение показателя преломления n(x,y,z) - локальный по пространству параметр фазового объекта. Из ОРХ и 3D распределения n(x,y,z) можно вычислить различные производные характеристики от этих величин:
плотность [1];
концентрацию [1];
морфометрические характеристики, например, объем, средний радиус, площадь клетки и т.п. [3];
массу сухих веществ биологической клетки [4]. Devis и Wilkins [5] показали связь между оптической разностью хода света, прошедшего через клетку, и массой ее сухого вещества, a Barer [6,7] - возможность ее измерения с помощью интерференционного микроскопа;
величину двулучепреломления (ДЛП). Традиционно измеряемый поляризационными методами, показатель ДЛП может быть измерен интерференционно-поляризационным методом. Этот метод выгодно отличается от аналогичных поляризационных методов отсутствием необходимости измерения толщины исследуемого объекта [8,9].
Показатель преломления связан с поляризуемостью белковых структур клетки, следовательно, фазовое изображение несет ценную диагностическую информацию о состоянии биологического микрообъекта. Поэтому с помощью интерференционного микроскопа можно вести мониторинг состояния как отдельной клетки [10-13], так и целой популяции клеток [14]. Это может быть использовано, например, для диагностики состояния системы крови [14].
Корреляция между различными процессами, происходящими в живой клетке, и величиной ОРХ позволяет использовать фазовое изображение также для исследования этих динамических процессов [15,16].
Количественные исследования характеристик фазовых микрообъектов можно проводить только с помощью интерференционных микроскопов [17]. Только они позволяют измерять ОРХ. Другие способы позволяют лишь
визуализировать, либо измерять производную по направлению от ОРХ (DIC). Однако, широкому распространению интерференционных микроскопов препятствовало отсутствие автоматизированных методов расшифровки интерферограмм, что тормозило внедрение данных микроскопов в практику лабораторных исследований и рутинных измерений.
Для проведения измерений в основном используют микроскопы, в основе которых лежат различные схемы двулучевых интерферометров Майкельсона, Маха-Цендера и Миро [17]:
схема деления пучков Майкельсона используется в микроинтерферометре академика В.П. Линника (1933). Микроскоп Линника позволяет работать с микрообъективами больших числовых апертур. Для исследования фазовых микрообъектов, они должны размещаться на зеркале, расположенном в предметном канале. В этом случае излучение дважды проходит сквозь них (схема на отражение) [17,21].
схема деления пучков Маха-Цендера используется в микроскопе Хорна (Horn, 1950). В своем составе он имеет две идентичные ветви, в которых располагаются исследуемый препарат и препарат сравнения. Излучение проходит через исследуемый микрообъект один раз (схема на просвет) [17, 5].
схема деления пучков по Миро используется в микроскопе Дайсона (Dyson, 1950; Pfeiffer, 1954). Пучок сравнения формируется из той части предметного пучка, которая не прошла через исследуемый объект Недостатком этой схемы является значительная потеря света и рассеянный свет, возникающие вследствие многих отражений. Данная схема также предназначена для исследования фазовых микрообъектов на просвет [17].
Одной из тенденций современной интерференционной микроскопии является создание самостоятельных оптических узлов с микрообъективами, реализующих тот или иной вид интерференционной схемы (микрообъектив-интерферометр). Известны такие схемы, реализованные для интерферометров Физо, Миро, Майкельсона и Линника.
Традиционно расшифровка интерферограмм, полученных на таких микроскопах, производилась вручную. Только в последние десятилетия были предложены и освоены алгоритмы автоматической расшифровки интерферограмм, которые впоследствии были применены и в интерференционных микроскопах. Этому способствовало появлением быстрых ПЭВМ, систем захвата и обработки изображений, высоко чувствительных ПЗС-камер.
Впервые автоматизированный вариант интерференционного микроскопа Линника МИИ-4 был разработан профессором В.П. Тычинским (1989) и назван «Эйрискан» [15] [18]. В качестве фотоприемного устройства в этом микроскопе используется диссектор. Изображение объекта получается путем развертки. Для реконструкции фазы реализован компенсационный метод (метод временных интервалов [19]). Значение фазы в выбранной точке пропорционально нормированному временному интервалу между моментами регистрации двух минимальных значений интенсивности на фотоприемнике при сдвиге зеркала опорного канала на половину длины волны излучения (я). Время съема данных прямо пропорционально зависит от числа отсчетов, в которых производятся измерения и составляет 1мс/пиксель. Т.е. за время одного телевизионного кадра (40мс) регистрируется изображение размером 40 пикселей.
Известен также автоматизированный вариант микроскопа Хорна (Zicha и Dunn, 1995) [5]. В этом микроскопе используется метод фазовых шагов [20]. Дискретный фазовый сдвиг обеспечивается поперечным перемещением компенсационного клина, управляемого от шагового двигателя. Данный метод получил название DRIMAPS (digitally recorded interference microscopy with automatic phase shifting - цифровая интерференционная микроскопия с автоматическим фазовым сдвигом). Схема микроскопа Хорна сложна в эксплуатации и настройке, так как требует наличия двух идентичных каналов с одинаково приготовленными препаратами: исследуемого препарата и препарата сравнения.
8 Среди всех схем наиболее предпочтительна схема интерферометра Линника [21]. Ее преимущества в том, что она позволяет обеспечить:
высокое пространственное разрешение, вследствие возможности использования микрообъективов большой числовой апертуры;
повышенную чувствительность в измерении ОРХ из-за двойного
* прохождения света (схема на отражение).
Отсюда следует, что, несомненно, актуальной является тема разработки и исследования методов интерференционной микроскопии, позволяющих автоматизировать измерения, повысить разрешающую способность и чувствительность, а также сократить время съема данных для измерения ОРХ как статических, так и динамических объектов при большом числе отсчетов.
Для измерения локальных характеристик внутренних неоднородностей микрообъектов разработаны методы конфокальной сканирующей микроскопии [22-24], оптической когерентной микроскопии [25, 26], а также методы, использующие томографическую реконструкцию. В конфокальном микроскопе
изображения внутренних сечений формируются за счет сканирования и пространственной фильтрации излучения. Данный метод пригоден лишь для исследования самосветящихся- (флуоресцентных) объектов. Оптическая когерентная микроскопия основана на принципах оптической когерентной томографии и представляет метод оптической локации с использованием низкокогерентного излучения [27]. Изображение сечения получается за счет интерференции света, рассеянного в тонком слое внутри объекта, и опорной волны. Толщина слоя определяется длиной когерентности источника. Метод пригоден для визуализации градиентов показателя преломления сильно рассеивающих фазовых объектов и слоистых структур. Так как в
микроинтерферометрии фазовых объектов измеряемым является интегральный параметр - ОРХ, то для реконструкции n(x,y,z) необходимо использовать только принципы томографии [28].
Известен микроскоп, подобный конфокальному, с реконструкцией по томографическим алгоритмам [29]. Вместо точечного детектора использовался
9 матричный фотоприемник, на котором регистрировались суммарные изображения и решалась обратная задача. Недостаток этого метода состоит в необходимости сканирования по всем трем направлениях и регистрации большого объема данных.
Особенность интерференционной вычислительной микротомографии заключается в решении технически сложной задачи встраивания системы сбора проекционных данных в интерференционный микроскоп [30]. Зондирование объекта может осуществлять либо параллельным пучком света либо расходящимся (коническим). В первом случае формируются параллельные проекции, а во втором - конические.
Возможные следующие варианты зондирования:
поворот пучка зондирующего излучения относительно неподвижного объекта;
вращение (наклон) объекта относительно неподвижного пучка зондирующего излучения.
Схемы с поворотом пучка относительно неподвижного объекта различаются по траектории, которую описывает зондирующий пучок относительно объекта, или области (сетке), на которой регистрируются проекции. Известны следующие подходы:
внеосевая вращающаяся точечная диафрагма в плоскости апертурной диафрагмы микрообъектива [31]. Траектория зондирования - окружность;
одномерное смещение точечного источника в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и получение наклонного освещения [32]. Траектория зондирования - прямая (ID);
использование матрицы микрозеркал DMD (Digital Micromirror Devices), помещенных в апертурной диафрагме микрообъектива, для создания наклонного освещения [33]. Схема может быть использована только для небольших объектов. Траектория зондирования - любая двумерная (2D);
- двумерное смещение точечного источника в плоскости апертурной
диафрагмы микрообъектива и получение наклонного освещения [34-36].
Траектория зондирования - любая двумерная (2D).
Среди этих схем наибольшее предпочтение имеют схемы, обеспечивающие двумерную траекторию. Все подходы имеют общий
* недостаток, заключающийся в том, что угол зондирования объекта ограничен
числовой апертурой микрообъектива и не превышает ±45.
Схемы со сканированием объекта относительно неподвижного пучка (micro-axial tomography) реализованы для следующих вариантов вращения:
- вращение капилляра с находящимся внутри него объектом [37-39];
- наклон объекта, помещенного между двумя покровными стеклами.
Эти схемы обеспечивают большой угол зондирования. Однако для их
реализации необходимо, чтобы ось вращения проходила через объект, иначе при вращении он выйдет из области фокусировки. Т.е. необходимо создавать сложные поворотные механизмы, обеспечивающие выравнивание
микрообъекта относительно оси вращения.
Таким образом, из всего вышеизложенного следует, что в области интерференционной микроскопии актуальной является также проблема разработки методов оптической микротомографии фазовых объектов, обеспечивающих большой угол зондирования, различные траектории сканирования и большое число проекций.
Цель работы
Разработка и исследование интерференционных методов измерения
интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов на основе
оптической микроскопии и микротомографии, позволяющих автоматизировать
* измерения, повысить разрешающую способность и чувствительность
измерений, сократить время съема данных, а также увеличить диапазон углов зондирования и расширить набор траекторий сканирования.
Основные задачи исследования
Исследование принципа формирования изображения в интерференционном микроскопе Линника с широким источником монохроматического пространственно-некогерентного света.
Разработка и исследование автоматизированного интерференционного микроскопа. Определение точности измерения ОРХ.
л 3) Разработка метода вычисления интегральных параметров (массы
сухого вещества клетки) по фазовым изображениям, полученным на интерференционном микроскопе.
4) Разработка и исследование схем интерференционных микротомографов:
на базе микроскопа Линника;
на базе конфокального микроскопа;
на базе микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором.
Научная новизна
1) Впервые показано, что интерференционное изображение,
формируемое в микроскопе Линника с источником пространственно-некогерентного света, является суммой интерферограмм от каждой пары предметного и опорного пучков, образующихся из одной и той же точки источника. Область локализации такой суммарной интерферограммы
12 (контрастная интерференционная картина) наблюдается в ограниченной узкой зоне.
Теоретически и экспериментально исследованы факторы, влияющие на случайную погрешность измерения массы сухого вещества клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе.
Разработана схема интерференционного томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором, позволяющая получать проекционные данные в полярном угле ±63 и диапазоне азимутального угла 0-360 с шагом 10.
Практическая ценность и использование результатов работы
Разработанные методики могут быть применены для создания автоматизированных интерференционных микроскопов и интерференционных томографических микроскопов, для автоматизации существующих интерференционных микроскопов. Изложенные методики получения фазовых изображений, измерения интегральных параметров (морфометрических параметров, массы сухих веществ) и динамической фазовой микроскопии реализованы для автоматизированного интерференционного микроскопа Линника (ВНИИОФИ), а также для автоматизированных интерференционных микроскопов Центра Аналитической Микроскопии (Пущино), Московского Областного Научно-Исследовательского Института им. Владимирского (МОНИКИ), кафедры биофизики биофака МГУ им. М.В. Ломоносова и «Научно-исследовательского центра по изучению свойств поверхности и вакуума» («НИЦПВ»).
Апробация работы, публикации
Основные материалы, представленные в диссертации, были доложены на:
«Научной сессии МИФИ 2003»;
7-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2003 г.;
«Научной сессии МИФИ 2004»;
Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2004г.;
15-ой научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», 2005 г.;
9-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2005 г.;
Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2005г.
Структура и объем работы
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 7 тезисов докладов на отечественных научно - технических конференциях, 3 статьи в журналах «Оптика и спектроскопия», «Измерительная техника» и «Microscopy and Analysis» (Англия).
Основные положения, выносимые на защиту
1) Изображение, формируемое в микроскопе Линника с пространственно-некогерентным источником света, является суммой интерферограмм волновых полей, исходящих из различных точек источника, поэтому контрастная интерференционная картина наблюдается в плоскости изображения предметного и опорного зеркал.
Среднеквадратическая погрешность измерения на автоматизированном интерференционном микроскопе Линника двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через биообъект, составляет не более 1/150 от длины волны зондирующего излучения, что позволяет вычислять массу сухого вещества внутри клетки с относительной погрешностью, не превышающей двух процентов.
Освещение коническим пучком объекта с его сканированием в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, и использование
14 матричного фотоприемника, позволяет получать двумерные параллельные проекции объекта. При этом количество проекций равно числу элементов фотоприемника, геометрия их расположения определяет траекторию зондирования, а количество отсчетов в проекции равно числу шагов сканирования.
4) При использовании микрообъектива с числовой апертурой NA>\, максимальный угол зондирования объекта, находящегося в среде с показателем
'ли^
преломления пср, равен arcsin
v"«> j
при условии распространения излучения в конденсоре со средой, показатель преломления которой больше, чем NA.
»
Схемы интерференционных микроскопов
Все основные схемы интерференционных микроскопов были разработаны в первой половине 20-го века, когда интерференционная микроскопия бурно развивалась [17]. Современные интерференционные микроскопы представляют собой сложные автоматизированные устройства, реализованные, как правило, на базе этих схем. Интерференционные микроскопы можно разделить по типу используемой интерференционной схемы [41]: 1) интерферометры с совмещенными ветвями: - с двойным фокусом - двухфокусный микроскоп (Smith, Baker, Захарьевский); - с призмой Волластона - ширинг-микроскоп (Smith,- Nomarski, Захарьевский, Лебедев); - с дифракцией на точке - микроскоп с дифракционным разделением пучков (Лейкин, Поляков); 2) интерферометры бокового сдвига: - на базе интерферометра Маха-Цендера - микроскоп Biolar Р; - на базе циклического интерферометра Харихарана и Сена - микроскоп с обратно круговым ходом лучей (Савин); 3) двулучевые интерферометры: - интерферометр Майкельсона (Линник); - интерферометр Маха-Цендера (Horn); - интерферометр Миро (Дайсон); 4) многолучевые интерферометры (Osterberg, Smith) Рассмотрим оптические схемы этих микроскопов подробнее. Микроскопы со схемой интерферометра с совмещенными ветвями Двухфокусный микроскоп Популярный коммерческий микроскоп, разработанный Смитом (1950), был одним из вариантов микроскопа Бэйкера, который широко выпускался в Великобритании и Америке [17]. Принципиальная схема микроскопа представлена на рис. 1.1. Свет от источника J проходит сквозь поляроид Р и падает на двоякопреломляющую линзу L, помещенную в переднем фокусе конденсора К. Вторая двоякопреломляющая линза L2 находится в заднем фокусе объектива О. Отрицательные линзы L и L2 изготовлены из одноосного кристалла (кварц, кальцит), и их кристаллические оси перпендикулярны к оптической оси микроскопа. Каждая из отрицательных линз L и L2 склеена с положительной стеклянной линзой и вместе с ней является почти плоскопараллельной пластинкой. Комбинация линзы L и конденсора К дает два изображения источника света J, расположенные в плоскостях R и В и поляризованные во взаимно перпендикулярных направлениях. После прохождения через объектив О и линзу L2 изображения R и В вновь соединяются и дают только одно изображение в точке J . В том случае, когда анализатор А скрещен с поляризатором Р, в поле зрения наблюдается погашение света. Если поместить в плоскости
Схема с двойным фокусом дает хорошее контрастирование при освещении источником белого света. Изначально она применялась для усиления контраста прозрачных объектов, и в 60 годах с их помощью были записаны цветные фильмы о функционировании клеток. Недостатком является ограничение на измерение оптической разности хода вследствие неполного разделения предметного и опорного пучков (так как оба проходят через объект). Выходом является применение стандартных компенсационных схем поляризационной оптики, например, компенсатора Сенармона. состоящего из пластинки Q в «четверть волны» и вращающегося анализатора А.
Так как у объективов с большой числовой апертурой фокальная плоскость находится внутри оптической системы, то для них более удобна схема рис. 1.2, в которой для раздвоения пучков применены плоские пластинки, изготовленные из одноосных кристаллов. На фронтальную линзу конденсора К наклеена кварцевая пластинка С, которая дает два фокуса в плоскостях R и В. На фронтальную линзу микрообъектива О наклеена кварцевая пластинка С, которая дает два фокуса в плоскостях R и В. На фронтальную линзу микрообъектива О наклеена кальцитовая пластинка G, вновь соединяющая раздвоенные лучи. Кристаллические оси кварца и кальцита параллельны плоским поверхностям пластинок. Кварцевая отрицательная линза L введена в схему для более точной компенсации взаимодействия пластинок С и G (Захарьевский, Гальпер и Кузнецова, 1958). Рисунок 1.2 - Схема двухфокусного микроскопа с кристаллическими двояко-преломляющими пластинками [17]. Ширинг-микроскоп Ширинг-микроскоп фактически является микроскопом, в котором реализован метод сдвиговой интерферометрии. В нем раздвоение изображения происходит в плоскости, перпендикулярной к оптической оси. Такое раздвоение получается, например, в том случае, если в переднем фокусе конденсора К (рис. 1.3) и в заднем фокусе микрообъектива О установлены двоякопреломляющие призмы Волластона Wj, и Wi (Smith, 1950; Nomarski, 1955; Захарьевский, 1956) [17].
Каждый луч, проходящий через призму W\ раздваивается, и через препарат В проходят два луча, поляризованные во взаимно перпендикулярных направлениях. Призма W2 вновь соединяет раздвоенные лучи. Вносимый микроскопическим объектом сдвиг фазы может быть измерен, как и в схемах рис. 1.1 и 1.2, с помощью компенсатора Сенармона или путем перемещения призмы W2 перпендикулярно оптической оси микроскопа.
Призмы Волластона могут быть помещены в фокальных плоскостях конденсора и объектива только у слабых систем. Если призмы не находятся в фокальных плоскостях, то в поле зрения возникают интерференционные полосы. Поэтому с сильными объективами применяются более сложные схемы (Nomarski, 1955; Huxley, 1957), эквивалентные по своему действию схеме рис. 3. Известны также схемы ширинг-микроскопов с плоскими двоякопреломляющими пластинками, расположенными между конденсором и объективом микроскопа (Лебедев, 1931; Smith. 1955). Кристаллические оси пластинок расположены в этом случае под углом около 45 к их поверхностям.
Недостатком таких микроскопов является наличие в поле зрения двух изображений объектов. В микроскопе DIC (Nomarski) этот поперечный сдвиг имеет величину меньше разрешающей способности микроскопа, поэтому он может не учитываться. Для других вариантов ширинг-микроскопов этот сдвиг составляет значение в несколько десятых долей от поля зрения и накладывает серьезное ограничение, особенно при исследовании клеточной популяции, когда в поле зрения находится множество объектов.
Микроскопы с двоякопреломляющими элементами отличаются простотой устройства и обращения с ними, однако ограничены для исследования объектов обладающих двулучепреломлением.
Исследование контраста и области локализации интерференционной картины в микроскопе Линника
Использование широкого источника в микроскопе Линника приводит к локализации интерференционной картины - контрастная интерференционная картина наблюдается в ограниченной области вдоль оптической оси.
Так как выходная плоскость 12 и плоскости размещения зеркал 7, 10 оптически сопряжены, то оси пучков из всего набора точечных источников, на которые условно разбит протяженный источник света 1, будут пересекаться в одной точке, лежащей в плоскости фокусировки изображения зеркал 7, 10. Таким образом, только в этой плоскости элементарные интерференционные картины от каждого точечного источника будут суммироваться без поперечного смещения. Поэтому только в данной плоскости будет наблюдаться наиболее контрастная интерференционная картина. В любой другой плоскости такие элементарные картины из-за расходимости пучков будут смещены друг относительно друга, и видность полос суммарной интерферограммы уменьшится. Это говорит о том, что область локализации интерференционных полос в микроскопе Линника с протяженным источником пространственно-некогерентного света совпадает с плоскостью 12 изображения зеркал 7, 10 предметного и опорного каналов [54].
Для проверки этих доводов были проведены следующие эксперименты. Исследована зависимость угла расходимости лазерного излучения на выходе из тубуса фотографического канала от диаметра диафрагмы (методом двух сечений) на микроскопе Линника МИИ-4 (ЛОМО). Было установлено, что при изменении диафрагмы от 1/1 до 1/2 угол расходимости пучка меняется в пределах от 5 до 2.8.
Теоретически промоделирована и экспериментально исследована зависимость видности интерференционных полос при различном диаметре диафрагмы и дефокусировки, определяемой смещением объектива предметного канала. Диафрагма изменялась от 1/1 до 1/2. Шаг смещения объектива был равен одному делению микрометрического винта и составлял 3 мкм. С помощью системы ввода изображения (ПЗС камеры и платы ввода) было зарегистрировано по 11 интерференционных изображений на каждое значение диафрагмы. Первое изображение имело наибольший контраст интерференционных полос (рис. 2.3 а,б).
Расшифровка интерферограмм на микроскопе Линника МИИ-4 производится вручную с помощью оператора. При этом интерференционные изображения наблюдаются визуально - через окуляр или фотографируются. По искривлению полос оценивается величина фазового сдвига, вносимого объектом. Как известно, использование ручной обработки данных носит субъективный характер и зависит от квалификации оператора. Такие измерения требуют временных затрат и не позволяют получать двумерное распределение ОРХ, а лишь ведут оценку в некоторых точках. В главе 1 говорилось, что в настоящее время широко развиваются методы автоматизированной интерференционной микроскопии. Автоматизация измерений позволяет не только получать 2D распределение ОРХ - т.н. фазовое изображение, но и значительно увеличить точность измерения ОРХ.
Для расшифровки интерферограмм в микроскопе Линника реализован метод дискретного фазового сдвига (метод фазовых шагов) [20]. Сдвиг вносится при помощи управляемого от компьютера зеркала на пьезоэлементе (далее пьезозеркала) в опорном плече микроинтерферометра. Интерферограммы при различных положениях пьезозеркала с помощью ПЗС-телекамеры, встроенной в окулярный или фотографический канал, через плату ввода поступают в персональный компьютер (ПЭВМ), где производится их автоматическая обработка. В результате работы алгоритма реконструкции фазы восстанавливается двумерное распределение оптической разности хода (ОРХ) или фазовое изображение. Результаты измерений отображаются на экране компьютера. Для управления вводом изображений, сдвигом пьезоэлемента и расшифровки интерферограмм разработано специальное программное обеспечение для работы в операционной среде DOS «Phast» (Шумский Е., ВНИИОФИ) и среде WINDOWS «WinPhast» (Сухорукое К., Трофимов А., ВНИИОФИ).
Наличие лазерного источника освещения, имеющего значительную пространственную когерентность, приводит к образованию спекл-картины. Для подавления спекл-шума используется источник лазерного освещения с разрушителем пространственной когерентности.
Оптическая схема автоматизированного микроскопа представлена на рис. 2.8. Лазерный пучок от блока разрушителя когерентности 1,2,3 через световод 4 поступает во входной зрачок микроскопа. Выходной торец световода расположен в апертурной диафрагме, которая совпадает с передней фокальной плоскостью конденсора 5. После конденсора параллельный пучок лучей попадает на светоделительную пластинку 6 со светоделительным покрытием. Она делит падающий пучок пополам: один пропускает, а другой отражает.
Отраженный от пластинки 6 пучок собирается в фокусе микрообъектива 8(2) на поверхности зеркала с фазовым объектом, после отражения от которой снова проходит через микрообъектив 8(2), пластинку 6 и собирается в фокусе объектива 10, где наблюдается изображение исследуемого фазового объекта. Зеркало 11 направляет пучок лучей в визуальный тубус.
Второй пучок, пройдя через пластинку 6, компенсатор 7, собирается в фокусе микрообъектива 8(1) на эталонном зеркале 9, отразившись от которого, снова проходит через микрообъектив 8(1), компенсатор 7, падает на разделительную пластинку 6 и не участвует в образовании изображения. Другая часть лучей отражается от пластинки 6 и интерферирует с лучами первой ветви микроинтерферометра, образуя резкое изображение интерференционных полос в бесконечности. Это изображение объективом 10 переносится в фокальную плоскость окуляра 12. Вместо окуляра в визуальный тубус вставляется ПЗС камера. Таким образом, изображение интерференционных полос и фазового объекта получается в фокальной плоскости окуляра (ПЗС камеры), и налагаются друг на друга.
Морфометрия по фазовым изображениям
Фазовое изображение или двумерное распределение ОРХ несет ценную количественную информацию о различных интегральных характеристиках фазовых микрообъектов, в отличие от амплитудных изображений таких объектов, которые имеют низкий контраст. К ним относятся: морфометрические параметры, сухой вес клеток, инкремент показателя преломления и др. Измерения этих параметров может происходить в стационарных условиях, когда фазовый объект стационарен (квазистационарен) во времени, а также за определенный промежуток времени при нестационарном объекте. На рис. 3.1 представлено фазовое изображение эритроцита в псевдоцветах, полученное на автоматизированном интерференционном микроскопе Линника. Восстановление фазы производилось по методу фазовых шагов в программе «Phast» (Шумский Е., ВНИИОФРІ). Каждый цвет соответствует определенному значению ОРХ. В левой и нижней частях рисунка приведены горизонтальное и вертикальное сечения изображения. Рисунок 3.1 - Фазовое изображение эритроцита в псевдоцветах. Каждый цвет соответствует определенному значению ОРХ (рад). Размерность по XY в пикселях (один пиксель - 0.04 мкм). Окно программы «PHAST». На рис. 3.2 представлено то же фазовое изображение в аксонометрическом виде. Рисунок 3.2 - Фазовое изображение эритроцита в псевдоцветах в аксонометрическом виде. Каждый цвет соответствует определенному значению ОРХ (рад). Размерность по XY в пикселях (один пиксель - 0.04 мкм). Окно программы «PHAST». Фазовое изображение несет информацию о пространственном распределении показателя преломления внутри клетки в интегральной форме. Только в частном случаях, при постоянстве показателя преломления n(x,y,z)=const (например, для эритроцита) фазовый портрет клетки является ее геометрическим рельефом (1.7). Поэтому для анализа фазовых изображений клеток, имеющих сложную пространственную структуру, необходимо использовать априорную информацию о значениях показателей преломления содержащихся в ней веществ или применять принципы вычислительной томографии.
Для клеток с постоянным показателем преломления фазовое изображение наглядно передает геометрию клетки и позволяет проводить качественный анализ, например дифференциацию клеток по типам [61]. Это хорошо видно из представленного на рис. 3.2 изображения эритроцита, который по классификации является дискоцитом. Основные морфометрические параметры, которые могут быть получены из анализа фазовых изображений, традиционны для морфометрии клеток [62]: - число, положение и параметры формы клеток; - площадь клетки или ядра клетки; - периметр клетки; - максимальное значение ОРХ [63]; - линейные размеры (эффективный радиус, диаметр и пр.); - коэффициент вытянутости (отношение двух главных моментов); - коэффициент формы (степень отличия от круга); - отношение площади ядра клетки к площади цитоплазмы; - объем. Во ВНИИОФИ была разработана программа «Visual», предназначенная для вычисления морфометрических параметров клеток. На рис. 3.3. представлено окно программы с фазовым изображением эритроцита и вычисленными по нему параметрами площади (Area) и эффективного радиуса (Radius). Values _} erZasc 83 Plane by HAND Plane Eugene Moo = 8.574Э7Е+0 Radius 4.32400E+Q mkm Area = 5.87383E+1 ткіїг2 Weight = 4,83309E-11gr. X Scale coef. Z": 0.001133754 Zero level: level = 1 er2.asc Рисунок 3.3 - Фазовое изображение эритроцита и вычисленные морфометрические параметры: эффективный радиус (4.3 мкм), площадь (58.7 мкм ). Окно программы «Visual».
Основной измеряемой с помощью микроскопа Линника характеристикой световой волны является распределение фазы света, прошедшего через объект. В линейном (эйкональном) приближении распределение фазы определяется разностью оптической длины пути света Ф(х,у), возникающей при зондировании объекта и окружающей объект среды в направлении оптической оси z:
По концентрации солей внутриклеточная вода близка к физиологическому раствору, и ее показатель преломления можно принять равным nw=l,334. В клетке величина а определяется в основном белками и нуклеиновыми кислотами и может быть принята равной 0,0018 см /г [66]. Она практически постоянна при изменении концентрации белков до 50% и мало зависит от молекулярного веса белка и солей в пределах концентраций, встречающихся в клетках.
При вычислении сухого веса клетки измеряемой величиной является интеграл от ее фазового изображения по всей площади (М), которое занимает клетка. Эта область определяется по фазовому изображению клетки. Предполагается, что область, которую занимает клетка, замкнута, и значение фазы в ней превышает АЛ 50. При мониторинге живых клеток измерялась площадь клеток, и ее изменение во времени. Измерения показали, что в ряде случаев площадь менялась. Это может происходить из-за изменения объема клетки V, что влияет на точность измерения сухого веса. Изменение объема может происходить из-за того, что в клетку, когда она находится в иммерсионной жидкости, в процессе наблюдения поступает либо эта жидкость, либо растворитель, на основе которого она делается. Оценим влияние указанного процесса на измерение сухого веса клетки. В том случае, когда в клетку поступает иммерсионная жидкость, изменяются объем клетки V и средний показатель преломления клеточного вещества п0. Однако, учитывая правило аддитивности показателей преломления для растворов, нетрудно показать, что величина М = V (п0 — nim), используя которую затем вычисляют сухой вес клетки по формуле (3.7), остается неизменной. Если в клетку поступает только растворитель, то величина М изменяется. Нетрудно показать, что при поступлении в клетку растворителя объемом AV с показателем преломления пр величина М будет равна: М2 = М1 + (пр -nim)- AV, где Mi и М2 - измеренные значения интеграла от фазового изображения до поступления растворителя внутрь клетки и после соответственно. Таким образом, если в процессе мониторинга клетки происходит проникновение растворителя внутрь клетки, то это приведет к изменению ее размера и измеряемого значения сухого веса. Оценим данные изменения на примере анализа эритроцита в физиологическом растворе. В этом случае показатель преломления клеточного вещества эритроцита п0=1,39, показатель преломления физиологического раствора (иммерсионной жидкости) п;т=1,333, показатель преломления растворителя (воды) пр=1,331. Относительное изменение Мдля приведенных выше значений показателей преломления составит: SM =Zt2. = l+±- 21 »1-0.035-=-. (3.9) Проведенный анализ показывает, что изменение объема- клетки в процессе исследования на одну треть приводит к изменению ее сухого веса на 1%. Более значительное увеличение объема легко заметить по фазовому и видео - изображениям клетки. Влияние рефракции света на точность измерения сухого веса Выражение (3.1), определяющее значение фазы света после прохождения его через объект, предполагает прямолинейное распространение излучения без преломления на границе раздела между клеткой и иммерсионной средой. Для того чтобы оценить влияние эффекта рефракции на изменение измеряемой в приборе величины М, было проведено математическое моделирование процесса распространения света в микрообъекте с учетом рефракции. В качестве модели была выбран микрообъект с параметрами, близкими к параметрам эритроцита: показатель преломления клетки п0=1.39, показатель преломления иммерсии nim=1.33.
Форма клетки изменялась от сферы радиуса R до эллипсоида с отношением полуосей, равным двум. Объем клетки при этом оставался неизменным. Радиус сферы изменялась от 3 до Юмкм. Результаты моделирования показали, что величина М изменяется на 1,5-2%. При этом основной вклад в погрешность вносят краевые области, где происходит «потеря» лучей из-за полного внутреннего отражения. Эти области на реальном видеоизображении клетки видны как темные контуры, на фазовом изображении микрообъекта значение фазы в этой области близко к нулю. Если отбросить краевые области, то погрешность вычисления М составляет 0.3-0.4%.
Конфокальный томографический интерференционный микроскоп
Для преодоления сложностей реконструкции по зеркальным проекциям в работе было предложено использовать проекции, полученные при однократном прохождении излучения сквозь объект. В основе схемы такого микротомографа лежит конфокальный микроскоп.
Обычно считается, что применение точечной диафрагмы в конфокальном сканирующем микроскопе позволяет достичь избирательную селективность по глубине объекта (глава 1). При этом не принимается во внимание тот факт, что получаемые данные представляют собой луч-суммы по прямым, проходящим через вершину конуса или веера (область зондирования отмечена серым на рис. 1.20). Наиболее адекватный подход к решению этой проблемы связан с применением принципов томографии. Для этого необходимо разработать алгоритм для получения проекций в параллельных пучках (и в дальнейшем использовать классические методы восстановления по набору проекций в параллельных пучках) из проекций в конусном пучке. Рассмотрим это более подробно.
При зондировании объекта конусным (в двумерном случае - веерным пучком), что по существу и происходит в конфокальном сканирующем микроскопе (см. рис. 1.20), возможны два варианта зондирования: перетяжка пучка находится внутри объекта (обычная схема, используемая в конфокальном микроскопе) (рис. 4.4 а) и перетяжка находится вне объекта (рис. 4.4 б). При этом сканирование объекта, происходит в плоскости, перпендикулярной оси конуса.
Для простоты, предположим, что движение совершает не объект, а источник зондирующего излучения вместе с регистратором (рис. 4.5). В сканирующем конфокальном микроскопе источник и регистратор неподвижны, а движется сам объект, расположенный на сканирующем столике, т.е. реализуется схема scanning stage.
В одномерном случае источник и регистратор движутся по прямой относительно неподвижного объекта, а на регистраторе формируется набор веерных планарных проекций. При зондировании объекта веерным пучком всегда можно выделить те лучи, которые зондируют объект под одним и тем же углом. Выделив из всех веерных проекций наборы таких лучей, мы получим проекции в параллельных пучках (рис.4.5). В этом заключается смысл алгоритма. Каждый луч в веерном пучке попадает на свой фотоэлемент матрицы (пиксел). Так как луч в веерном пучке распространяется под своим углом, то количество углов зондирования определяется числом пикселов на фотоприемнике. Следовательно, общее число проекций зависит от количества пикселов на матрице. А вот количество отсчетов в каждой проекции будет зависеть от количества шагов сканирования.
Такая система сбора проекционных данных может быть легко реализована в конфокальном микроскопе, для этого необходимо, чтобы перетяжка пучка находилась выше объекта. Для получения конусных проекций необходимо лишь обеспечить двумерное плоско-параллельное сканирование объекта и заменить точечный фотоприемник - матрицей фотоэлементов. Как правило, для томографической реконструкции используется не более 100 проекций. Тогда число элементов фотоприемника должно быть равно 100 (матрица 10x10). Такое небольшое число элементов позволяет использовать фотоприемники, составленные из различных дискретных фотоэлементов (например, ФЭУ).
Плоско-параллельное сканирование в зоне конусного пучка представляет еще один способ сбора проекционных данных в схемах со сканированием объекта относительно неподвижного пучка (см. п. 1.2.2). Его основные преимущества по сравнению со схемами, использующими вращение или наклон, заключаются в том, что: - объект не выходит из фокуса во время сканирования, т.е. нет необходимости в создании- сложных механизмов и алгоритмов, обеспечивающих выравнивание объекта относительно оси вращения; - его легко можно реализовать в микроскопе, поместив объект на предметный сканирующий столик. В данной схеме траектория сбора данных определяется геометрией расположения элементов фотоприемника, т.е. можно обеспечить любую траекторию, в том числе и «квадрат», использовав матрицу фотоприемников. Однако для достижения максимального угла зондирования необходимо применение микрообъективов с большой числовой апертурой (иммерсионных) и большим рабочим отрезком. Таким образом, освещение коническим пучком объекта с его сканированием в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, и использование матричного фотоприемника, позволяет получать двумерные параллельные проекции объекта. При этом количество проекций равно числу элементов фотоприемника, геометрия их расположения определяет траекторию зондирования, а количество отсчетов в проекции равно числу шагов сканирования. Это третье научное положение.
