Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Основные типы клеток, входящие в состав сосудов. 10
Формирование первичной сосудистой сети (васкулогенез)
и ангиогенез
-
Активация ангиогенеза при опухолевом росте 12
-
Факторы роста клеток эндотелия сосудов 16
-
Факторы роста фибробластов 17
-
Фактор роста эндотелия сосудов VEGF-A 18 Изоформы фактора роста VEGF-A 20
-
Другие факторы роста семейства VEGF 23 Фактор роста VEGF-B 23 Фактор роста VEGF-C 25 Фактор роста VEGF-D 26 Фактор роста VEGF-E 27
Плацентарный фактор роста 28
1.4. Рецепторы факторов роста семейства VEGF 28
-
Рецепторы, взаимодействующие с фактором роста 29 VEGF-A (VEGFR1 и VEGFR2)
-
Рецептор VEGFR3 36
-
Нейропилины 3 8
1.5. Сигнальная система Tie2/Ang 39
-
Семейство рецепторов Tie и взаимодействующие с ними 39 факторы роста
-
Процессы, контролируемые сигнальной системой 42 Tie2/Ang-1 при формировании сосудов
-
Процесе формирования сосудов в норме и в опухоли и участие 44 в нем сигнальных систем
-
Сигнальные пути, в которых участвуют рецепторы семейства 47 VEGFR
-
Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR1 49
-
Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR2 50
-
Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR3 52
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 85
ІП. 1. Клонирование гена FLT4 ( VEGFR3) человека 85
Ш. 1.1 .Секвенирование и анализ клонов, кодирующих 85
трансмембранный и тирозинкиназные домены белкового
продукта гена FLT4 (VEGFR3)
Ш. 1.2 .Секвенирование и анализ клонов, кодирующих 92
внеклеточную область белкового продукта гена FLT4
(VEGFR3)
Ш. 1.3.Секвенирование и анализ клонов, содержащих З'-область 98
tgh2lFLT4(VEGFR3)
Ш.2. Частичное клонирование гена FU4 мыши 104
Ш. 3. Определение хромосомной локализации генов FH4 мыши и 113
FLT4 (VEGFR3) человека Ш.4. Исследование экспрессии гена FLТ4 ( VEGFR3) в линиях клеток 115 человека и грызунов, в плаценте человека и в нормальных тканях мыши методом Норзерн блот-гибридизации Ш.4.1. Исследование экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) в линиях 115
опухолевых клеток и плаценте человека Ш.4.2. Исследование экспрессии гена FU4 в нормальных тканях 119 мыши и в трансформированных линиях клеток грызунов
4
Ш.5. Исследование экспрессии генов рецептора FLT4 (VEGFR3) и его 122
лиганда VEGF-C в линиях опухолевых клеток человека и
трансформированных клеток экспериментальных животных
методом RT-PCR
Ш.6. Исследование роли VEGF-C/FLT4 (VEGFR3)-3aBHcrofofi 125
сигнальной системы в регуляции пролиферации клеток
Ш.7. Исследование экспрессии гена FU4 в спонтанных и 129
перевиваемых гепатомах мыши
Ш.8. Исследование экспрессии генов FLT4 (VEGFR3) и его лиганда 132
VEGF-C в опухолях человека
ГП.8.1. Исследование экспрессии FLT4 (VEGFR3) в опухолях 132
человека методом Норзерн блот-гибридизации Ш.8.2. Исследование экспрессии FLT4 (VEGFR3) и
взаимодействующего с ним фактора роста VEGF-C при 133
злокачественной и доброкачественной патологии
щитовидной железы человека методом RT-PCR
Ш.8.3. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков 142
FLT4 (VEGFR3) и VEGF-C в опухолях щитовидной железы
человека. Сравнение с нормальной окружающей тканью.
Ш.8.4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков 143
FLT4 (VEGFR3) и CD Зів опухолях щитовидной железы
человека
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 155
ВЫВОДЫ 179
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 180
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 184
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 193
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 197
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 204
БЛАГОДАРНОСТИ 225
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
VEGF - фактор роста эндотелия сосудов
(Vascular Endothelial Growth Factor)
VEGFR - рецептор фактора роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)
FGF - фактор роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor)
FGFR - рецептор фактора роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor Receptor)
PDGF - тромбоцитарный фактор роста (Platelet Derived Growth Factor)
PDGFR - рецептор тромбоцитарного фактора роста (Platelet Derived Growth Factor Receptor)
ТК-домены - тирозинкиназные домены
ИГ-домены - иммуноглобулинподобные домены
ТМ домен - трансмембранный домен
РТК - рецепторные тирозинкиназы
Ьр - пары оснований
Введение к работе
Необходимым условием роста и развития опухолей является ангиогенез - возникновение в них новой сосудистой системы. Понимание механизмов, регулирующих процессы формирования и развития систем кровеносных и лимфатических сосудов опухоли, может предоставить дополнительные возможности для терапии и диагностики злокачественных новообразований.
Важным достижением исследований в этой области за последнее десятилетие явилось обнаружение специфических рецепторов (VEGFR), локализованных на поверхностной мембране клеток эндотелия сосудов и взаимодействующих с ними факторов роста (VEGF).
Рецепторы VEGFR и их лиганды через связанные с ними сигнальные системы регулируют многие ключевые этапы формирования сосудов, включая пролиферацию клеток эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов, их дифференцировку из клеток-предшественников, а также процессы, приводящие к образованию зрелой сосудистой системы. Экспрессия всех 3-х рецепторов VEGFR совершенно необходима для формирования сосудов: отсутствие хотя бы одного из этих рецепторов приводит к нарушениям, несовместимым с жизнью эмбриона.
Рецепторы VEGFR и их лиганды - VEGF оказались удобными молекулярными маркерами, исследование экспрессии которых дает возможность оценить состояние сосудистой системы и активность ангиогенеза в ткани. Оценка этих показателей является важной с точки зрения прогноза дальнейшего развития новообразований, т.к. увеличение размеров и прогрессия опухоли тесно связаны со стимуляцией роста в ней новых сосудов. Кроме того, обнаружение рецепторов VEGFR и их лигандов предоставило возможность для поиска подходов к изменению активности ангиогенеза в ткани за счет стимуляции или ингибирования связанных с этими молекулами сигнальных систем.
7 В нашей работе был впервые клонирован ген одного из рецепторов клеток эндотелия сосудов - FLT4 (VEGFR3). Анализ структуры предполагаемого белкового продукта гена FLT4 (VEGFR3) показал, что он принадлежит к суперсемейству рецепторных тирозинкиназ и наиболее гомологичен рецепторам FLT1 (VEGFR1) и Flkl/KDR (VEGFR2) семейства факторов роста эндотелия сосудов VEGF. При этом оказалось, что в отличие от двух других рецепторов VEGFR, локализованных, в основном, на клетках эндотелия кровеносных сосудов, FLT4 (VEGFR3) преимущественно локализован на клетках эндотелия лимфатических сосудов, являясь тем самым одним из первых специфических маркеров лимфатических сосудов [69, 82].
Идентификация FLT4 (VEGFR3) в качестве маркера лимфатической системы, исследование уровня его генной экспрессии и распределения белка в опухолях и в нормальной ткани давали возможность изучить изменения, происходящие в лимфатической системе в процессе развития опухоли. Ранее, из-за отсутствия специфических маркеров, позволяющих различать эндотелий кровеносных и лимфатических сосудов, характеристика изменений, происходящих с лимфатической сосудистой системой при озлокачествлении ткани, была затруднена.
Цель дальнейшей работы заключалась в исследовании возможной роли рецептора FLT4 (VEGFR3) и связанных с ним сигнальных систем в опухолевой прогрессии и в регуляции пролиферации экспрессирующих этот рецептор клеток.
6 соответствии с этим, были поставлены следующие задачи:
Исследовать экспрессию гена FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-C в культурах нормальных и трансформированных клеток человека и грызунов.
Исследовать роль FLT4 (УЕОРІІЗ)-зависимой сигнальной системы в регуляции пролиферации экспрессирующих этот рецептор клеток.
Исследовать экспрессию гена FLT4 (VEGFR3) в спонтанных и индуцированных гепатомах мыши.
Исследовать экспрессию гена FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-C в образцах с различной патологией щитовидной железы человека, включающей в себя как доброкачественные и злокачественные опухоли, так и неопухолевые пролиферативные изменения.
Исследовать распределение белка FLT4 (VEGFR3) и VEGF-C в аденомах и аденокарциномах щитовидной железы человека.
Сравнить распределение и активность маркера кровеносных сосудов CD31 и маркера лимфатических сосудов FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы человека.
При исследовании экспрессии генов FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-C в культуральных линиях трансформированных клеток было установлено, что в линиях клеток, происходящих из солидных опухолей человека, ген FLT4 (VEGFR3) экспрессирован крайне редко, в отличие от практически всегда экспрессирующегося в этих линиях гена VEGF-C. Однако в тех исключительных случаях, когда в этих клетках наблюдается ко-экспрессия обоих генов, связанная с ними сигнальная система может вносить заметный вклад в регуляцию клеточной пролиферации.
В нашей работе были впервые получены данные об экспрессии генов рецептора FLT4 (VEGFR3) и одного из его лигандов - VEGF-C в образцах с различной патологией щитовидной железы человека: в злокачественных и доброкачественных опухолях, а также при различных зобных патологиях и аутоиммунных тироидитах. Впервые было показано, что экспрессия и гена, и белка FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы достоверно снижена по сравнению с его экспрессией в аденомах, в других исследованных тиреоидных патологиях или в нормальной ткани щитовидной железы человека.
Иммуногистохимическое сравнение экспрессии FLT4 (VEGFR3) и маркера кровеносной системы, CD 31, в аденокарциномах щитовидной железы не выявило аналогичного снижения уровня экспрессии последнего.
Таким образом, в нашей работе также впервые показано, что некоторые не являющиеся эндотелиальными опухолевые линии клеток могут экспрессировать рецептор FLT4 (VEGFR3) и его лиганд VEGF-C, и в таких клетках FLT4 (VEGFR3)-3aBHCHMaa сигнальная система вносит существенный вклад в регуляцию их пролиферации.
В нашей работе впервые показано снижение уровня экспрессии маркера лимфатических сосудов FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы человека по сравнению с другими пролиферативными тиреоидными патологиями и нормальной тканью щитовидной железы. Эти данные указывают на то, что в злокачественных опухолях щитовидной железы не только не происходит стимуляции лимфангиогенеза, но система лимфатических сосудов находится, скорее, в подавленном состоянии.
Сравнение экспрессии маркеров лимфатической - FLT4 (VEGFR3) - и кровеносной - CD 31 - систем показало, что такое подавление характерно только для лимфатических сосудов. Более того, уменьшение экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах может приводить к стимуляции ангиогенеза опухоли за счет того, что лиганды этого рецептора - VEGF-C и VEGF-D - в большей степени могут взаимодействовать со своим вторым рецептором - VEGFR2, являющимся основным регулятором формирования кровеносной сосудистой системы.
