Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности биотерапии (обзор литературы) 13
1.1. Иммунологический подход к лечению больных с солидными опухолями 14
1.2. Молекулярно-генетические основы иммунологического распознавания 16
1.3. Опухолеассоциированные антигены, идентификация и клиническое значение 21
1.4. Кинетика противоопухолевого иммунного ответа 28
1.5. Механизмы уклонения опухоли от иммунного ответа 35
1.6. Разработка высокотехнологичных противоопухолевых вакцин 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Материалы 51
2.1.1. Характеристика пациентов, получавших вакцинотерапию аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с адъювантом BCG 57
2.1.2. Характеристика пациентов, получавших вакцинотерапию аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с адъювантом ILl-р 59
2.1.3. Характеристика пациентов, получавших вакцинотерапию аутологичными опухолевыми клетками, модифицированными геном tag7 61
2.1.4. Характеристика пациентов, получавших вакцинотерапию аутологичными костномозговыми предшественниками дендритных клеток 65
2.2. Методы 67
2.2.1. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток 68
2.2.1.1. Дезагрегация образцов опухоли 68
2.2.1.2. Нарашивание клеток опухоли в культуре 70
2.2.1.3. Характеристика клеточного состава 72
2.2.1.4. Криоконсервация и хранение культур опухолевых клеток 76
2.2.1.5. Блокада пролиферации опухолевых клеток 77
2.2.1.6. Обоснование числа опухолевых клеток, вводимых при вакцинации 78
2.2.2. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевы клеток 78
2.2.2.1. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевы клеток с адъювантом BCG 79
2.2.2.2. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевы клеток с адъювантом IL-lp 80
2.2.2.3. Приготовление вакцины на основе аутологичных костномозговых дендритных
клеток 83
2.3. Характеристика приготовленной вакцины 87
2.4. Мониторинг больных 90
2.5. Методы изучения иммунной системы и неспецифической резистентности 91
2.5.1. Исследование поверхностного фенотипа лимфоцитов и моноцитов 91
2.5.2. Стимуляция лимфоцитов митогенами 92
2.5.3. Иммуноглобулины 92
2.5.4. Циркулирующие иммунные комплексы 93
2.5.5. Функциональная активность фагоцитов 93
Глава 3. Клиническая оценка эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с иммунологическим адъювантом BCG у больных с диссеминированными солидными опухолями 94
3.1. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG у больных с диссеминированными солидными опухолями 95
3.2. Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG 98
3.3. Оценка прогностических факторов иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG 111
Глава 4. Клиническая оценка эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с иммунологическим адъювантом IL-р у больных с диссеминированными солидными опухолями 124
4.1. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом IL1-P у больных с диссеминированными солидными опухолями 125
4.2. Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом ILl-р 127
4.3. Оценка прогностических факторов иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом IL1 -Р 143
Глава 5. Клиническая оценка эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7y больных с диссеминированными солидными опухолями 152
5.1. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7 у больных с диссеминированными солидными опухолями 153
5.2. Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7 166
Глава 6. Клиническая оценка эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток у больных с диссеминированными солидными опухолями 181
6.1. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток у больных с диссеминированными солидными опухолями 182
6.2. Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток 191
Глава 7. Обсуждение результатов исследования 210
Выводы 239
Литература 241
Приложения 263
- Опухолеассоциированные антигены, идентификация и клиническое значение
- Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG
- Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7
- Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее десятилетие достигнуты несомненные успехи в лечении злокачественных опухолей, в первую очередь, вследствие прогресса лекарственной терапии. Одновременно достижения молекулярной биологии, иммунологии, углубленное понимание механизмов прогрессии опухоли и взаимоотношений иммунной системы и опухоли, а также развитие биотехнологии обусловили реальные перспективы улучшения результатов лечения опухолей с помощью методов биотерапии.
Разработка методов биотерапии у больных солидными опухолями, основанных на иммунопатологических особенностях заболевания является актуальным направлением в современной клинической онкологии (Cемиглазов В.Ф. и соавт., 1996; Барышников А.Ю. и соавт., 1998; Якубовская Р.И. и соавт., 2004; Georgiev G.P. et al., 1998). Кроме того, понимание механизмов иммунной защиты, исследование причин их несостоятельности и разработка методов коррекции представляет также несомненный научный интерес (Кадагидзе З.Г. и соавт., 2004). Это связано с тем, что злокачественная опухоль в организме является своего рода моделью реакции “трансплантат против хозяина”. Неуклонный рост частоты онкологических заболеваний, низкий уровень выживаемости у больных с IV стадией, недостаточная эффективность традиционных методов лечения у этой категории больных обуславливают социальную значимость данной проблемы (Чиссов В.И. и соавт., 1998; Давыдов М.И. и соавт., 2002).
Большой научный интерес представляет изучение механизмов формирования иммунодепрессии у больных злокачественными опухолями. Способность опухоли индуцировать анергию и апоптоз иммунокомпетентных клеток свидетельствует о том, что иммунодепрессия при опухолевом росте может являться следствием негативного исхода клеточной активации (Хансон К.П. и соавт., 1996). Происходит ли это на самом деле у больных солидными опухолями, насколько подвержены нарушения иммунитета биотерапевтической коррекции, как изменение баланса цитокинов сказывается на течении заболевания, и, в том числе, на выраженности специфического противоопухолевого иммунного ответа – все это составляет тот спектр вопросов, который в настоящее время остается во многом не выясненным (Моисеенко В.М. и соавт., 1998).
Кроме того, в доступной литературе отсутствует обоснование режимов вакцинотерапии больных злокачественными опухолями, что связано с недостаточным пониманием механизмов индукции оптимального иммунного ответа на каждый опухолеассоциированный антиген. Между тем, очевидно, что эффективность этого метода во многом зависит от рационального его применения.
Таким образом, из всего вышесказанного следует, что, несмотря на колоссальные достижения фундаментальной и прогресс клинической онкологии, остается много неясного во взаимоотношении опухоли и иммунной системы организма практически на всех этапах опухолевой прогрессии. Кроме того, появляется целый спектр вопросов, связанных с воздействием различных методов современной биотерапии на это взаимоотношение, что определило цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования
Повышение эффективности лечения больных солидными опухолями на основе современных высокотехнологичных методов биотерапии.
Задачи исследования
-
Обоснование и разработка современных методов биотерапии солидных опухолей.
-
Изучение влияния на отдельные звенья иммунной системы, а также клиническую эффективность методов активной специфической иммунотерапии на основе:
костно-мозговых предшественников дендритных клеток;
немодифицированных опухолевых клеток с иммунологическими адъювантами;
геномодифицированных опухолевых клеток.
-
Оценка токсичности различных методов активной специфической иммунотерапии.
-
Определение показаний и противопоказаний к проведению различных вариантов вакцинотерапии.
-
Определение места современной биотерапии в комплексном лечении больных меланомой кожи и раком почки.
Научная новизна
В диссертационной работе впервые:
разработана оригинальная методика активной специфической иммунотерапии на основе аутологичных костно-мозговых предшественников дендритных клеток (Патент на изобретение № 2203683 от 10.05.2003 г., Заявка на изобретение №2008115173/14, приоритет от 17.04.2008);
изучены различные способы введения костно-мозговых предшественников дендритных клеток с иммунологическими адъювантами больным с диссеминированным опухолевым процессом;
разработан способ иммунотерапии аутологичными опухолевыми клетками с адъювантом IL-1 (Беталейкин) больных солидными опухолями (Патент на изобретение № 2267326 от 10.01.2006);
разработан оригинальный способ получению культур опухолевых клеток человека на полупромышленном уровне с использованием метода автоматический дезагрегации и пассирования образцов аутологичной опухоли;
изучены и определены решающие условия успешной генотерапии больных меланомой кожи и раком почки с использованием липосомной трансфекции гена tag7.
Практическая значимость
Обоснована целесообразность использования высокотехнологичных методов биотерапии в комплексном лечении больных диссеминированной меланомы и раком почки.
Оценена клиническая и иммунологическая эффективность противоопухолевых вакцин, основанных на аутологичных костно-мозговых предшественниках дендритных клеток и геномодифицированных опухолевых клетках.
Внедрен в клиническую практику метод оценки реакции гиперчувствительности замедленного типа на вакцинный препарат и на аутологичные опухолевые клетки (“bystander effect”).
Определен приоритет внутрикожного способа введения вакцины на основе дендритных клеток по сравнению с внутривенным введением и инъекциями в периферические лимфатические узлы.
Обоснована целесообразность использования противоопухолевых вакцин в комбинации с иммунологическими адъювантами (интерлейкин -1, -2).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Биотерапия с использованием вакцин – эффективный метод лечения больных солидными опухолями.
-
Разработанные оригинальные противоопухолевые вакцины на основе генетически модифицированных опухолевых клеток и костно-мозговых предшественников дендритных клеток вызывают специфический иммунный ответ, приводящий к регрессу опухоли, и могут быть рекомендованы к практическому применению.
-
Основные механизмы противоопухолевого действия вакцин связаны с нормализацией либо стимуляцией функциональной активности отдельных звеньев иммунной системы (CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, HLA DR+, CD25+, CD38+, CD71+, CD95+ лимфоцитов, CD16+ NK-клеток, ФГА и КонА активированных клеток).
Апробация диссертации
Основные результаты работы обсуждались на научных конференциях ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» совместно с Кафедрой онкологии с курсом клинической радиологии и на Кафедре клинической лабораторной диагностики Cанкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования.
Результаты работы были представлены на II съезде иммунологов России (г. Сочи, 1999), Европейской школе по онкологии (г. Москва, 1999), III—XI научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 1999—2007) III, V и IX (г. Москва, 1999, 2001 и 2006) Ежегодных Российских онкологических конференциях, I Международном конгрессе «Новые медицинские технологии» (г. Санкт-Петербург, 2001), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (г. Москва, 2002), Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (г. Санкт-Петербург, 2002), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (г. Москва, 2002), конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» (г. Киев, 2003), 14th Inter. Congress on anti-CancerTreatment (Paris, 2003), III съезда ВОГиС «Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2004), межрегиональной научно-практической конференции «Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии» (г. Барнаул, 2004), научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (г. Томск, 2004), конференции «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (г. Санкт-Петербург, 2004), III и V съезде онкологов и радиологов СНГ (г. Минск, 2004; г. Ташкент, 2008), IV—VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (г. Москва, 2005—2008), научно-практической конференции онкологов СЗФО «Меланома кожи. Современное состояние диагностики и лечения» (г. Великий Новгород, 2005), I Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (г. Санкт-Петербург, 2005), Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике» (г. Барнаул, 2005), 6th World Congress on Melanoma (Vancouver, 2005), Congress «Мediated diseases from theory to therapy» (Moscow, 2005), научно-практической конференции онкологов СЗФО «Меланова кожи. Современное состояние диагностики и лечения» (г. Санкт-Петербург, 2005), XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Rhodes, 2005), 8th International Symposium Biological Therapy of cancer from disease to targeted therapy (Dresden, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008).
Внедрение результатов работы в практику
Результаты работы внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий», Институте биологии гена РАН (г. Москва), Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (г. Санкт-Петербург), в учебном процессе кафедры онкологии с курсом клинической радиологии и кафедры клинической лабораторной диагностики Cанкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и 9 приложений. Текст изложен на 263 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 133 рисунка. Список литературы включает 433 источника.
Опухолеассоциированные антигены, идентификация и клиническое значение
Важным этапом изучения биологии рака было выявление опухолеспецифических антигенов. Первые очевидные признаки их существования описаны в работах L. Gross (1943), E.J. Foley (1953), Prehn Т.Т., Main J.M. (1957), G. Klein и соавт. (1960), L.G. Old и соавт. (1962), которые исследовали экспериментальные опухоли, индуцированные химическими соединениями и ультрафиолетовым излучением. Однако последующие десятилетия поиска молекулярно-генетических признаков существования опухоль-специфических антигенов, т.е. молекул, которые были бы распознаны иммунной системой и кодированы как опухольеспецифические антигены, не принесли результата. Трудность идентификации специфических ОАА в те годы заключалась в недостаточном количестве клонированных образцов предполагаемых опухолевых антигенов.
Т. Boon (1992) впервые описал невирусные ОАА, которые вызывали специфический ответ цитотоксических Т-лимфоцитов с клетками мышиной мастоцитомы р815. В исследованиях автора использовали методы, которые позволили идентифицировать антигены на поверхности опухолевых клеток с помощью специфических клонов цитотоксических Т-лимфоцитов. Клоны цитотоксических Т лимфоцитов, специфичные для аутологичньгх опухолевых клеток, были получены из периферической крови или опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов пациентов с меланомой. В культуре такие клоны могли поддерживаться в течение длительного времени и использоваться для выявления ОАА на многих образцах клеток меланомы.
С помощью библиотеки меланомных генов P. Coulie и соавт. (1993) получили линии лимфоцитов, распознающих аутологичные опухолевые клетки с видоизмененной антигенной структурой. Объектом исследования служили первичная меланома кожи и ее метастазы в регионарные лимфатические узлы.
U. Sahin и соавт. (1995) на основе генной библиотеки опухолеассоциированных генов разработали метод скрининга ОАА в сыворотке крови онкологических больных (в настоящее время известный как SEREX). Используя этот подход, авторы идентифицировали ОАА, одновременно являющиеся мишенями для Т- и В-клеток. В последние годы выделены МНС класса I рестриктированные антигены, обладающие высокой индивидуальной специфичностью (Barrow С. et al., 2006; Slingluff C.L.Ir., Speiser D.F., 2005; Jager D„ 2007).
В настоящее время список ОАА постоянно увеличивается благодаря использованию следующих молекулярно-биологические и иммунологических методов:
выявление экспрессии cDNA клонированных Т-клеток и антител у пациентов с опухолью;
выделение cDNA с использованием различных RDA- и PCR-методов;
DNA-секвенция, CGH, DNA-чип/микро выстраивание и SAGE;
индукция антиген-специфических Т-клеток in vitro и иммунизация HLA трансгенных животных.
Основываясь на образцах, экспрессирующих родственные белки, выделяют 6 групп антигенов, связанных с опухолевыми клетками (Ribas A. et al., 2004):
1) опухолевые антигены — антигены, которые специфичны для определенных тканевых ростков, например меланоцитные антигены MART-1/Melan-A (MART-1), gplOO, gp75, mda-7, тирозиназа и связанные с этим ферментом белки, простатический мембранный антиген и простатический антиген. Эти антигены эксперссируются как в опухолевых, так и в нормальных клетках того же ростка;
2) мутированные антигены - эпитопы антигенов, возникающие вследствие опухолеспецифических мутаций в онкогенах или супрессорных генах или вследствие увеличения экспрессии того или иного генетического элемента (мутации в гене ras, перестройки в гене Ъсг/аЫ, суперэкспрессия гена Her-2/neu, мутация в гене р53 и т.д.);
3) немутированные антигены — антигены, которые экспрессируются в опухолевых клетках различного гистогенеза — MAGE, BAGE, RAGE и NY-ESO;
4) антигены, связанные с клональной перестройкой генов иммуноглобулинов и ассоциированные с индивидуальным иммунологическим портретом миелом и В-клеточных лимфом;
5) антигены вирусного происхождения, например онкобелки Е6 и Е7 папилломавирусов;
6) немутированные эмбриональные белки, экспрессируемые опухолями (альфа-фетопротеин, раковоэмбриональный антиген и т.д.).
В действительности, наиболее иммуногенными ОАА являются не опухолевые антигены, а вирусные белки, экспрессированные в вирус-индуцированных опухолей (Cadman L., 2006; Schiller J.T., Lowy D.R., 2006). Показательными являются Е6 и Е7 онкогенные белки папилломавирусов. Изменения в последовательностях аминокислотных остатков или слияние генов таких антигенов приводят к увеличению иммуногенности по сравнению с их нормальной белковой копией (Disis M.L., Cheever М.А., 1996; Kuehn В.М., 2006; Siddiqui M.A., Perry СМ., 2006; Villa L.L. et al., 2006). Эти антигены составляют большую часть ОАА вирусиндуцированных опухолей. Установлено, что ряд антигенов может выполнять роль опухолеассоциированных, так как их экспрессия чрезвычайно ограничена в нормальных тканях. Такими ОАА являются антигены из семейств MAGE, GAGE и BAGE (Boon Т., van der Bruggen P., 1996; Segal N.H. et al., 2005). Эти антигены в сочетании со слабой экспрессией МНС-антигенов выявляются в эмбриональных и опухолевых клетках.
Поствакцинальные противоопухолевые клоны ЦТЛ обнаружены в периферической крови больных диссеминированной меланомой кожи после их ре-активации in vitro аутологичными опухолевыми клетками. Было установлено, что иммунный ответ стимулировали антигены, кодируемые семейством «cancer-germline» генов, таких как MAGE, BAGE, GAGE или LAGE (Samija M. et al., 2001; Strohal R. et al., 2001; Bodey В., 2002; Bolli M. et al., 2005; Godelaine D. et al., 2007). «Cancer-germline» гены экспрессированы в опухолях различных гистологических типов и кодируют отдельные строго опухолеспецифичные антигены. Обычно они определяются в «молчащем» состоянии в нормальных тканях взрослых и экспрессируются в зародышевых клетках яичка мужчин.
В опухолях выявлены три семейства MAGE: MAGE-A, кодирующее большинство антигенов, идентифицированных в последнее время, MAGE-B и MAGE-C (Lucas S. et al., 2000; Yang В. et al., 2007).
Вторая группа антигенов — это антигены генов мутированных опухолевых клеток. Эти антигены также строго специфичны, но они выявляются только в отдельных случаях и наиболее известным является мутантный CDK4 (Wolfel Т. et al., 1995; Steitz J. et al., 2006; Huang X. et al., 2007). Третий класс антигенов, кодируемый меланоцитарными дифференцировочными генами — это tyrosinase, Melan-A и gplOO me (Seiter S. et al., 2002; Urosevic M. et al., 2005).
В наименьшей степени специфичность ОАА представлена в так называемых дифференцировочных антигенах. Дифференцировочные антигены — это антигены, которые появляются на определенном типе клеток и экспрессия которых указывает на путь их дифференцировки. Кроме того, эти антигены могут характеризовать отдельную стадию дифференцировки клеток и экспрессироваться на опухолевых клетках (Барышников А.Ю. и соавт., 1989). Дифференцировочными антигенами, выявляемыми на меланоцитах и злокачественных клетках меланомы кожи, являются тирозиназа и Melan-A (Topalian S. et al., 1994; Kawakami Y. et al., 1994; Seiter S. et al., 2002; Urosevic M. et al., 2005).
В литературе дискутируется вопрос о том, какие антигены лучше использовать при создании противоопухолевых вакцин. Наибольший интерес (в этом отношении) представляют аутологичные «опухолеспецифические» антигены: во-первых, они обладают индивидуальной специфичностью, во-вторых, ограничивают развитие аутоиммунной токсичности (Berd D., 1998; Sensi М., Anichini А., 2006; Parmiani G. et al., 2007). Вместе с тем, вакцинация против таких антигенов приводит к индивидуализации вакцин, получению опухолевого материала, наращиванию клеточной массы, увеличению времени до вакцинации. Кроме того, стоимость таких вакцин может оказаться значительно выше предполагаемой аутоиммунной токсичности..
Обсуждаются теоретические ограничения в использовании дифференцировочньгх антигенов в составе противоопухолевых вакцин. Это связано с возможным аутоиммунным «осложнением» в виде витилиго. Однако проявление витилиго у больных диссеминированнои меланомои кожи свидетельствовало о хорошем прогнозе среди таких пациентов (Duhra P., Ilchyhyn А., 1991; Cui J., Bystrtn J.C., 1995; Cavallari V. et al., 1996; Luiten R.M. et al., 2005; Boasberg P.D. et al., 2006).
Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG
До начала лечения иммунологические показатели больных, получавших вакцинотерапию с адъювантом BCG с лечебной (1-я группа) и адъювантной целью (2-я группа), имели статистически недостоверные различия за исключением увеличенного абсолютного содержания в периферической крови моноцитов у больных 1-й группы [0,66±0,42 по сравнению с 0,39±0,20 (р 0,01)] (рис. 22). Функциональная активность этих клеток была выше у больных после полной.циторедукции (рис.23), что свидетельствует о способности моноцитов («профессиональных» АПК) быстро активироваться в самом начале иммунного ответа уже на относительно ранних этапах опухолевого процесса и запускать иммунный ответ.
В то же время иммунная система больных с диссеминированным заболеванием отвечает на злокачественный процесс неоднозначно. С одной стороны, как показывает наше исследование, увеличивается содержание АПК в периферической крови, а с другой, в результате нарушений гомеостатических механизмов наблюдается снижение их функциональной активности, которое, однако, устраняется в процессе лечения.
Процесс иммунизации начинается в местах внутрикожной инъекции аутологичных опухолевых клеток, которые распознаются, фагоцитируются и процессируются АПК, а также представляются лимфоцитам. АПК, примированные ОАА, могут проникать через лимфатические сосуды в грудной проток, а оттуда — в кровь. Они могут оседать в других лимфоидных и нелимфоидных органах, обеспечивая развитие системного противоопухолевого иммунитета. При внутрикожном способе вакцинации создаются благоприятные условия для создания депо и проникновения примированных АПК в регионарные и отдаленные лимфатические узлы.
Установлено, что различным стадиям созревания Т-клеток соответствуют выраженные изменения их мембранных характеристик, позволяющих с помощью моноклональных антител высокой специфичности идентифицировать эти стадии поверхностным маркером. Среди субпопуляций Т-лимфоцитов в соответствии с функциональными особенностями выделяют клетки, проявляющие хелперную, супрессорную и киллерную активность. Субпопуляции лимфоцитов идентифицируются по их способности экспрессировать различные типы Fc-рецепторов: Т-лимфоциты, имеющие рецептор к IgM, обнаруживали хелперную активность, а обладающие Fc-рецепторами к IgG - супрессорную. Клетки-хелперы идентифицируются благодаря экспрессии на их поверхности дифференцировочных антигенов, определяемых моноклональными антителами CD4+25", супрессоры (Treg) - CD4+25+, киллеры (ЦТЛ) -CD8+25".
Необходимо отметить, что изучение этих субпопуляций только по маркерам имеет большие сложности. Известно, что субпопуляции Т-лимфоцитов отличаются по морфологической и гистологической характеристикам, чувствительности к конканавалину А (Кон А), фитогемагглютинину (ФГА), продукции цитокинов и т.п. С другой стороны, показано, что не все Т-клетки, экспрессирующие Fc-рецептор к IgG, являются супрессорами: описано, что эта популяция обладает активностью естественных киллеров (NK-клеток) и активностью антитело-зависимой клеточной цитотоксичности. Описан также переход Т-клеток с Fc-рецептором для IgG в Т-клетки с Fc-рецептором для IgM при инкубации или взаимодействии с иммунными комплексами.
У больных, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, усиление иммунного ответа зарегистрировано через 14 дней после 1-й вакцинации. Оно проявлялось в росте функциональной активности эффекторных клеток (усиление спонтанной миграции лейкоцитов, увеличение содержания клеток, экспрессирующих маркер активации HLA DR) (рис. 24 и 25), что сочеталось с достоверным увеличением CD3+ (73,05 ±5,9) и CD8+ (29,35±5,9) Т-клеток по сравнению с аналогичным показателем у больных с адъювантной вакцинотерапией [64,4±10,0 (р 0,001) и 24,27±6,3 (р 0,01) соответственно] (рис. 26 и 28).
После 2-й вакцинации, через 5 нед от начала лечения, указанные различия не наблюдались. Второй пик усиления активности эффекторных клеток у этой категории больных наблюдался после 5-й вакцинации (увеличение содержания CD3+ Т-клеток, усиление спонтанной миграции лейкоцитов и их ответ на митоген КонА) (рис. 29).
Иммунный ответ организма на опухоль, по-видимому, мало чем отличается от реакции на какие-либо другие антигены, то есть основными во всех случаях являются процессы регуляции иммунного ответа. В то же время, процесс регуляции — положительный или отрицательный по отношению к опухолевому росту — зависит от комплекса взаимодействующих эффекторных и регуляторных клеток. Очевидно, что для обеспечения максимальной эффективности контроля регуляторные механизмы должны воздействовать на различные субпопуляции клеток-эффекторов, вовлекаемых в иммунный ответ. Особое значение в этой регуляции играют NK-клетки.
Большинство проведенных исследований у онкологических больных показали снижение NK-активности в исследуемых группах по сравнению со здоровыми донорами, причем, по данным различных авторов, они выявлялись как на ранних стадиях, так и при диссеминации опухолевого процесса. С другой стороны, имеются данные об отсутствии подавления NK-активности у онкологических больных, а также данные, связывающие низкие показатели NK с плохим прогнозом заболевания.
Наши исследования показали, что у больных, получавших вакцину на основе аутологичных опухолевых клеток с адъювантом BCG с лечебной целью, содержание CD16+ NK-клеток было сниженным по сравнению с больными, вакцинированными с адъювантной целью, как до начала вакцинотерапии, так и после окончания лечения (рис. 30). Тенденция к увеличению этого показателя наблюдалась после 1-й, 2-й, 3-й и 6-й вакцинации со статистически значимым снижением р 0,01 после 4-й вакцинации и через 3 нед после 6-й вакцинации.
Разнонаправленность данных связана, по-видимому, с функциональной гетерогенностью NK-популяции, а именно, с существованием известных в настоящее время пяти клеточных субтипов и блокадой созревания NK-клеток в костном мозге онкологических больных (Richards J.О. et al., 2006).
Теория регуляции иммунитета, предложенная N.K. Jerne (1974), предполагает, что иммунный ответ - это тонко сбалансированный процесс, включающий гуморальные и клеточно-опосредованные реакции, которые развиваются в момент индукции иммунного ответа или временно возникшей иммунной недостаточности и с помощью системы обратной связи контролируют и восстанавливают в организме исходное состояние. Хотя такая гипотеза из-за огромного количества иммунологической информации, появившейся в последнее время, возможно, представляется слишком упрощенной схемой истинных событий, вместе с тем, остается важным рассматривать иммунный ответ с позиций теории, предложенной N.K. Jeme. Одним из многочисленных примеров, подтверждающих теорию N.K. Jerne, является продукция антител к опухолевым антигенам.
Противоопухолевые антитела, или иммуноглобулины, реагируют с разными типами ОАА. Есть антитела, которые направлены против поверхностной мембраны опухолевых клеток. Они обладают узкой специфичностью. Однако есть антитела, которые направлены против внутрицитоплазматических ОАА. Им присуща большая степень перекрестной реактивности. В клетках меланомы человека оба типа антигенов присутствуют в период ранней фазы первичного опухолевого роста, но при появлении метастазов и диссеминации опухолевого процесса антитела к мембранам исчезают из сыворотки, а к внутрицитоплазматическим компонентам остаются. Одним из объяснений этого факта может быть появление специфических антител к мембранным антителам. Анти-антитела могут быть специфически направлены против разных участков молекулы иммуноглобулинов в зависимости от того, какой из них действовал как антиген.
Антиидиотипические антитела направлены против специфических антител к опухолевым мембранам и реагируют с вариабельной областью опухолеспецифических антител. Антицитоплазматические антитела, как было установлено, соединяются с F(ab)2-фрагментами в шарнирном участке молекулы IgG. AHTH-Fc-антитела (подобные ревматоидному фактору) были идентифицированы в сыворотке больных меланомой и специфически направлены против Fc-фрагмента молекул IgM и IgG. Уровень анти-Fc-антител возрастает по мере прогрессирования опухоли. Антитела-мишени, к которым направлены aHTH-Fc-антитела, пока не идентифицированы, но, по-видимому, они отличаются от анти-Р(аЬ)г-специфичностей.
Образование анти-антител может отчасти объясняться контактом новых антигенных детерминант, образующихся при расщеплении молекулы IgG некоторыми ферментами, например, катепсином, который освобождается из опухолевых клеток. Данная реакция осуществляется in vitro при условии, что в субстрате присутствуют клетки хозяина. Это согласуется с представлением о том, что инфильтрирующие опухоль клетки хозяина совершенно необходимы для образования анти-антител. Приведенная концепция подтверждается еще и тем, что сходное расщепление молекул лейкоцитами наблюдается в жидкости абсцесса.
Роль анти-антител в регуляции опухолевого роста является в настоящее время предметом обсуждений. Антиидиотипические антитела могут регулировать клеточные иммунные механизмы, но какие факторы усиливают их продукцию и по какой причине, не известно.
Появление анти-Р(аЬ)2-антител может представлять собой попытку поддержать слабеющий иммунный ответ в период хронической иммунной стимуляции, как было установлено в отношении подъема уровня антицитоплазматических антител, происходящего по мере прогрессирования опухоли.
Еще одним доводом в пользу благоприятного эффекта анти-Р(аЬ)2-антител является их высокий уровень у больных с локализированными или стабильными опухолями, имеющих при этом низкий уровень антицитоплазматических антител. И, напротив, у больных с диссеминированными или прогрессирующими опухолями наблюдается обратная ситуация.
Как благоприятный, так и повреждающий эффект антител к противоопухолевым антителам можно объяснить расстройством регуляции и контроля в свете теории, выдвинутой N.K. Jerne.
В нашем исследовании снижение абсолютного числа CD20+ В-лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (доноры) наблюдалось как у больных, получавших вакцинотерапию с лечебной (1-я группа), так и с адъювантной целью (2-я группа), в отличие от увеличенного содержания антител IgM у больных с диссеминированным опухолевым процессом и IgG в обеих группах (рис. 31—33).
Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7
В местах инъекции модифицированных геном tagl аутологичных опухолевых клеток в течение 48 ч регистрировалась местная реакция в виде участков гиперемии, которая расценивалась как реакция ГЗТ при размере этих участков не менее 5—10 мм.
Реакция ГЗТ в ответ на введение вакцины развилась у 74% (31 из 42) больных меланомой кожи и 93% (13 из 14) больных раком почки. При этом размер гиперемированного участка увеличился в среднем на 3-4 мм в процессе лечения. У 3 больных (5%) меланомой кожи во время проведения половины цикла вакцинотерапии зарегистрирована реакция ГЗТ в контрольной точке - в месте введения аутологичных немодифицированных опухолевых клеток («bystander effect»). Результаты представлены на рис. 85 и 86.
В большинстве случаев выявляли корреляцию между интенсивностью местной иммунной реакции в месте введения вакцины (ГЗТ) и наблюдаемыми клиническими эффектами (рис. 87 А и Б).
Установлена взаимосвязь между размером, выраженностью выявляемых гиперемированных участков и течением заболевания. Так, у пациентов со стабилизацией процесса наблюдали реакцию ГЗТ в среднем 15-20 мм, причем, имела место тенденция к их увеличению. Больные с прогрессированием заболевания отвечали недостаточно на вводимый вакцинный препарат, реакция ГЗТ была невыраженной или отсутствовала.
Для более детального изучения иммунологической эффективности данного вида терапии проводили биопсии места введения вакцины и в качестве контроля участков неизмененных кожных покровов пациентов. На гистологических срезах был обнаружен лимфоидный инфильтрат, который развивал положительное окрашивание при выполнении иммуногистохимических тестов с помощью моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD 14, CD la, CD83 (рис. 88). Это свидетельствовало о присутствии Т-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток разной степени зрелости в месте появления реакции ГЗТ. В контрольных участках (неизмененные кожные покровы) подобную картину не наблюдали.
В течение первого курса вакцинации размер реакции ГЗТ значительно увеличился, и максимальное значение составило 40 мм. Также наблюдали значительное увеличение количества CD8+ Т-клеток и некоторое увеличение содержания NK (CD 16+) клеток. В последующем у больной выявили рецедив, иссекли новообразование и приготовили новую культуру опухолевых клеток. Прогрессирование заболевания в данном случае коррелирует с уменьшением активности иммунной системы, что проявляется в исчезновении реакции ГЗТ на введение вакцины и значимом уменьшении в периферической крови содержания CD8+ Т-клеток. Далее больная получала новую вакцину в виде смеси культур клеток меланомы, выделенных из первичного очага и рецидива и модифицированных геном tag7. К настоящему моменту время безрецидивного периода от момента иссечения новообразования составило 19 мес+. На вакцину, состоящую из смешанного пула опухолевых клеток, снова развивается иммунный ответ, что выражается в увеличении размеров реакции ГЗТ и абсолютного количества CD8+- и СО!6+-клеток(рис. 89).
Практически у всех пациентов с положительной клинической динамикой нарастало в процессе вакцинации абсолютное содержание в периферической крови CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD 16+-лимфоцитов. К концу каждого курса вакцинотерапии увеличивалась функциональная активность преимущественно CD8+ Т-клеток. Одновременно наблюдали увеличение размеров реакции ГЗТ. У пациентов, не ответивших на проводимое лечение, показатели содержания Т-лимфоцитов, NK-клеток, активированных Т- и В-лимфоцитов менялись незначительно, скачкообразно или падали.
Сравнительный анализ усредненных иммунологических показателей в группах больных, получавших вакцинотерапию с лечебной и адъювантной целью, позволил выявить их различный ответ на иммуностимуляцию в процессе вакцинотерапии (рис. 90 -101). Анализ динамики изменения содержания моноцитов, фагоцитарной активности моноцитов (фагоцитарный индекс) представлен на рис. 90-91.
Для больных, получавших вакцинотерапию с адъювантной целью (1-я группа) до лечения было типичным увеличенное содержание моноцитов, их высокая фагоцитарная активность по сравнению со здоровыми лицами (доноры) и пациентами, получавшими лечебную вакцинотерапию (2-я группа) [соответственно 3,73±0,72, 3,22±0,23 и 3,23±0,74 (р 0,05)]. В процессе иммунотерапии у больных с диссеминированным опухолевым процессом эти показатели увеличились и отражали выраженную активность антигенпрезентирующего моноцитарно/макрофагального звена иммунной системы.
Анализ содержания основных иммунорегуляторных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток подтвердил это предположение (рис. 92-93).
Так, у больных, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, абсолютное содержание вышеуказанных клеток увеличилось после вакцинотерапии с 0,67±0,28 до 0,89±0,38 и с 0,45± до 0,57±0,47 соответственно. Вместе с тем, в процессе лечения содержание иммунорегуляторных субпопуляций у этой категории больных и у пациентов, получавших вакцинотерапию с адъювантной целью, неоднократно подвергалось снижению, что, по нашему мнению, предполагает отнесение таких больных в группу повышенного риска, требующего увеличения курса вакцинотерапии.
Анализ динамики изменения функциональной активности Т-клеток в ответ на стимуляцию ФГА и КонА, эксперессии HLA DR-антигена у изучаемого контингента больных не выявил значительных статистически значимых различий (рис. 94-96). Вместе с тем, положительная динамика касалась в большей степени пациентов 2-й группы и функционального состояния КонА активированных CD8+ ЦТЛ.
Так, исходное количество CD16+ NK-клеток было повышенным у больных, получавших адъювантную вакцинотерапию по сравнению с группой здоровых лиц (доноры) и больных 2-й группы (0,31±0,15 соответственно с 0,16±0,11 и 0,24±0,11). В дальнейшем зарегистрировано повышение содержания NK-клеток в процессе иммунотерапии у пациентов 1-й группы и выраженное увеличение этого показателя у пациентов обеих групп после курса вакцинотерапии.
Учитывая важное значение в обеспечении противоопухолевой резистентности организма снижения количества и функциональной активности NK-клеток при распространении опухолевого процесса и депрессивное влияние на их функции общепринятых методов лечения рака, представляется важным изыскание средств для восстановления количественных и функциональных характеристик NK-клеток в организме пациента с опухолью. Одним из таких подходов может быть использование активной специфической иммунотерапии (вакцинотерапии).
Динамика показателей гуморального иммунитета (CD20+ В-лимфоциты, иммуноглобулины IgM, IgG и IgA) у больных, получавших вакцинотерапию с адъювантной или лечебной целью, свидетельствует об увеличенной их продукции у этой категории больных. Наметившаяся тенденция к снижению содержания IgG и IgA после курса вакцинотерапии сочеталась с выраженной активацией гуморального иммунитета, зарегистрированного в росте CD20+ В-клеток и продукции IgM (рис. 98-101).
Оценка иммунологической активности вакцины на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток
В местах инъекции вакцины в течение 48 ч регистрировалась местная реакция в виде участков гиперемии, которая расценивалась как ГЗТ при размере этих участков не менее 10 мм (рис. 107). У 9 (82%) из 11 вакцинированных пациентов, у которых проводили оценку реакции ГЗТ, на 2-е введение вакцины развилась реакция ГЗТ, у 3 (75%) из 4 пациентов - «bystander effect» в контрольной точке (месте введения лизата аутологичных опухолевых клеток) (рис. 108-110).
Уровень иммунологической реактивности больных с диссеминированными солидными опухолями, получавших данный вид вакцинотерапии, до начала лечения, как это было показано в предыдущих разделах настоящего исследования, в значительной мере индивидуален, а все последующие изменения иммунологических показателей под влиянием активной специфической иммунотерапии происходят, естественно, исходя из первоначальных величин. Последнее, поэтому, имеет принципиальное значение для иммунологического мониторинга, если иметь в виду под этим термином оценку эффективности лечения и прогноза диссеминированной солидной опухоли на основании результатов анализа тех или иных параметров иммунитета в динамике паллиативной вакцинотеарпии.
В этом разделе работы исследование иммунологических показателей у больных с диссеминированными опухолями проводили до начала вакцинотерапии, в процессе специфической иммунотерапии и через 3 нед после завершения лечения (рис. 111-117).
До лечения установлено снижение абсолютного содержания лимфоцитов, CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеток, снижение их функциональной активности в нагрузочных тестах с митогеном ФГА и КонА и увеличенное содержание IgM, IgG, IgA, ЦИК по сравнению со здоровыми лицами. Однако уже после 1-й вакцинации у этой категории больных выявлена тенденция к увеличению содержания CD3+ Т-лимфоцитов и клеток, экспрессирующих маркеры активации: HLA DR, CD25, CD38, CD71, маркер апоптоза CD95. Одновременно у этих же больных наблюдалась тенденция к увеличению функциональной активности Т-клеток в нагрузочных тестах с митогеном ФГА и КонА и снижение содержания основных классов Ig в периферической крови. Несомненно, это является хорошим прогностическим фактором, так как свидетельствует об иммуногенности приготовленной ex vivo вакцины и отсутствии у больных глубокого Т-клеточного иммунодефицита.
Анализ иммунорегуляторных субпопуляций у больных с диссеминированными солидными опухолями выявил рост CD3+ Т-клеток, CD8+ ЦТЛ и клеток, экспрессирующих маркеры активации (HLA DR, CD25, CD38, CD71, CD95) после 2-й, 4-й и 6-й вакцинации, что свидетельствует о рестимуляции иммунного ответа под воздействием аутологичнои ДК-вакцинотерапии. Вместе с тем, указанные изменения сочетались с увеличенной продукцией IgG и IgA, которая, тем не менее, может пойти на убыль в связи со снижением CD20+ В-клеток и IgM после курса вакцинотерапии.
В этой связи показательны результаты исследования индивидуальных показателей клеточного и гуморального иммунитета с учетом объема опухолевой массы и клинической эффективности ДК-вакцинотерапии, которые представлены на примере четырех пациентов, рис. 118-133.
1-й пациент М., 52 года, метастазы в головной мозг (15 х 12 мм), мягкие ткани (4 х 2,5 см и 2,5 х 2,3 см), лимфатические узлы брюшной полости до 3,5 см, стенку тонкой кишки до 4 см, поджелудочную железу до 2 см, левые аксилярные лимфоузлы до 2 см; прогрессирование заболевания.
2-й пациент К., 52 года, инфильтрат в левой аксилярной области (5 х 4,5 см), множественные метастазы в обеих легких до 3,5 см, плеврит; прогрессирование заболевания.
3-й пациент Г., 50 лет, метастазы в паратрахеальные лимфатические узлы до 12 мм, лимфатические узлы средостения до 24 мм, 3 очага в легких 8-20 мм; минимальный регресс метастазов в легких после 5-го введения ДК-вакцины (рис. 103).
4-й пациент С, 70 л. два метастаза в легких 5 и 7 мм, минимальный регресс после 6-го введения ДК-вакцины (рис. 104).
В результате у больного с большой опухолевой массой (М., 52 года) было выявлено снижение абсолютного содержания CD3+ Т-клеток, основных иммунорегуляторных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов до вакцинотерапии, снижение после 1-й вакцинации и выраженный рост после 2-го и 6-го введения (рис. 118-120). Эти показатели коррелировали с увеличением содержания CD14+-MOHOUHTOB (рис. 121), HLA DR+-ioieTOK (рис.124), продукцией IgG (рис. 132), реакцией ГЗТ от 18 до 26 мм, «bystander effect s» до 16 мм, стабилизацией опухолевого процесса в мягких тканях (рис. 102), отсутствием метастазов в висцеральных органах (легкие, печень), но прогрессированием заболевания в лимфатических узлах брюшной полости и стенке тонкой кишки в процессе лечения.
Анализ иммунологических показателей больной с множественными висцеральными метастазами (К., 52 года), выявил снижение абсолютного содержания CD3+, CD4+ и CD8+ Т-клеток до лечения, выраженный рост (40%) после 1-й вакцинации и тенденцию к снижению после 3-й вакцинации (рис. 118-120). Эти показатели коррелировали с увеличением более чем в 3 раза содержания CD16+ NK-клеток (рис. 122), HLA DR+-, CD25+-, CD38+-, CD71+-, С095+-клеток ( 50%) от начала лечения (рис. 124-128), реакцией ГЗТ (16-20 мм), «bystander s effect» 16 мм (рис. 108), что, несомненно, свидетельствует о выраженной активации NK/T-клеточного звена иммунитета. Показатели В-клеточного звена иммунной системы были не изменены (рис. 123, 131-133). Вместе с тем у больной наблюдалось дальнейшее прогрессирование заболевания -плеврит на фоне множественных метастазов в легких.
Исследование иммунологических показателей больного (Г., 50 лет) с диссеминированным опухолевым процессом в легких и средостении выявило характерное для здоровых лиц содержание CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеток до начала лечения и в процессе активной специфической иммунотерапии (рис. 118-120). Количество вакцинаций коррелировало:
1) с ростом CD16+ NK-клеток более чем в 3 раза (рис. 122),
2) CD20+ В-лимфоцитов и HLA DR+-ioieTOK ( 40%) (рис. 123 и 124),
3) появлением и ростом в периферической крови клеток, экспрессирующих рецептор к IL-2 (CD25+), трансферрину (CD71+), маркер апоптоза (CD95+) (рис. 125, 127 и 128),
4) реакцией ГЗТ (20 мм после 1-й вакцинации, 22 мм и «bystander s effect» 20 мм после 2-й вакцинации, 24 мм и «bystander s effect» 22 мм после 3-й вакцинации) (рис. 110).
В настоящее время зарегистрирован минимальный регресс метастазов меланомы кожи в легких 5 мес+ (рис. 103).
