Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Традиционные и новые препараты в химиотерапии рака яичника 10
1.2. Становление вторичной химиорезистентности у больных раком яичников 24
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Объект исследования 33
2.2. Обработка материала 33
2.2.1. Выделение опухолевых клеток из асцитической жидкости 33
2.2.2. Очистка суспензии от эритроцитов 33
2.2.3. Выделение клеток из ткани рака яичников 34
2.3. Дозы препаратов 34
2.4. Оценка жизнеспособности опухолевых клеток (МТТ-тест). 35
2.4.1. Постановка теста 38
2.5. Статистическая обработка 39
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Сравнение чувствительности клеток рак яичников у первичных и леченых больных в МТТ-тесте . 40
3.2. Различия в чувствительности клеток рака яичников к цитостатикам у больных разных возрастных групп 60
3.3.Сравнение цитостатической активности препаратов одного класса в отношении клеток рака яичников человека в МТТ-тесте in vitro. 64
3.3.1. Сравнение цитостатической активности производных платины (цисплатина, карбоплатина и циклоплатама) in vitro в отношении клеток рака яичников человека 65
3.3.2. Сравнение эффективности препаратов таксанового ряда (таксола и таксотера) у больных раком яичников 72
3.3.3. Испытание новых препаратов в МТТ-тесте на клетках рака яичников человека. 75
3.3.3.1. Сравнительная оценка цитостатической эффективности препарата Вс-112 с другими препаратами платины на модели клеток рака яичников человека МТТ-методом. 76
3.3.3.2. Сравнительная оценка цитостатической эффективности препарата Рубоксил и фарморубицина на модели клеток рака яичников человека МТТ-методом 79
3.4.Исследование in vitro сочетанного действия цитостатиков на клетки рака яичников человека 81
3.4.1. Модель независимого действия препаратов 82
3.4.2. Анализ эффективности отдельных пар цитостатиков 86
Заключение 91
Выводы 98
Список литературы 100
- Становление вторичной химиорезистентности у больных раком яичников
- Сравнение чувствительности клеток рак яичников у первичных и леченых больных в МТТ-тесте
- Сравнение цитостатической активности производных платины (цисплатина, карбоплатина и циклоплатама) in vitro в отношении клеток рака яичников человека
- Модель независимого действия препаратов
Становление вторичной химиорезистентности у больных раком яичников
Около 80% злокачественных эпителиальных новообразований яичников первичных больных клинически расцениваются как чувствительные к противоопухолевой лекарственной терапии, но постепенно, в процессе лечения, этот процент уменьшается. Стандартный цикл химиотерапии включает 6-8 курсов. Его эффективность составляет 70% - 90%, однако, 5-летняя выживаемость этих больных по разным данным не превышает 10-20% [46,57,89]. В целом, клиницисты отмечают, что количество больных с химиорезистентными опухолями РЯ возрастает пропорционально числу проведенных курсов химиотерапии [183]. Особую остроту эта проблема приобретает в процессе второй и последующих линий химиотерапии. Отмечен также факт различной чувствительности к цитостатикам первичной опухоли и ее метастазов (диссеминатов), что затрудняет выбор адекватного лечения [98,118,131]. То есть резистентность (в основном приобретенная) опухолевых клеток к химиопрепаратам является одной из основных причин, существенно ограничивающих возможности лекарственной терапии злокачественных новообразований яичников.
Резистентность опухолей к воздействиям может быть обусловлена как внеклеточными факторами (активный ангиогенез с последующей васкуляриза-цией опухоли, обеспечивающий высокий пролиферативный потенциал ), так и экспрессией в опухолевых клетках ряда генов, продукты которых ответственны за механизмы химиорезистентности (Р-170, MRP, LRP, р53 и т.д.)[2,21,124].
Хорошо известно, что одним из основных свойств злокачественных новообразований является гетерогенность клеточных популяций, которая нарастает в процессе развития опухоли, как вследствие различий в микроокружении опухолевых клеток, так и вследствие несимметричных делений анеуплоидных клеток [78]. Это обуславливает, с одной стороны, присутствие в опухоли клеточных субпопуляций с различной чувствительностью к действию противоопухолевых агентов [118,168].С другой стороны это приводит к структурированности опухоли, т.е. к неравномерному распределению различных по чувствительности раковых клеток в пространстве опухолевой ткани. Ситуация усугубляется динамической природой самой опухоли, постоянно изменяющейся в процессе ее роста вследствие пролиферации опухолевых клеток, их взаимодействия, сложной и вариабельной природой взаимоотношений опухоли и организма [28,53,66].
Пролиферация клеток солидных опухолей является зависимой от ангио-генеза [125,166,175]. Клиническая значимость определения плотности сосудов в опухоли показана для опухолей разных типов: чем выше плотность сосудов, тем хуже прогноз для пациента [17,99,126,169]. С другой стороны, хорошая васкуляризация опухоли обеспечивает доступность опухолевых клеток для ци-тостатиков [95,131]. Исследования различных типов опухолей (рака легкого, рака молочной железы, рака яичника и т.д.), показывают, что количество сосудов в опухоли коррелирует с вероятностью прогрессирования процесса: наличием метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов [98,125,131, 164,169]. Возможна и обратная ситуация, когда формирование новых микрососудов в опухоли отстает от роста самой опухоли, таким образом, создавая в опухоли условия с очень низким содержанием кислорода и питательных веществ, и может лимитировать эффективность химиотерапии. Кроме того, гипоксия увеличивает экспрессию генов, связанных с лекарственной устойчивостью, что также делает химиотерапию неэффективной для достижения ремиссии [2,115].
Развитие лекарственной резистентности опухолей происходит как результат селекции противоопухолевыми препаратами вариантов клеток, устойчивых к их действию[17,20,54,66]. Достичь стойких и полных ремиссий у большинства пациенток не удается, так как в опухолях яичников уже исходно существуют клоны клеток, различающиеся по химиочувствительности, а химиотерапия дополнительно, в силу вышеуказанных причин, индуцирует развитие резистентности. Поэтому одним из путей повышения эффективности химиотерапии является применение в схемах лечения цитостатиков различающихся не только механизмами действия, но и не имеющих и не вызывающих перекрестной химиорезистентности. Поэтому рационализация подходов к лечению требует, с одной стороны, исследования химиорезистентности опухолевых субпопуляций к цитостатикам и механизмы этой резистентности.
Описано несколько механизмов возникновения клеточной резистентности к ксенобиотикам. К ним относятся:
а) мембранные насосы (плазматической мембраны, мембран цитоплазматиче-ских органелл и ядерной мембраны: Р-170, MRP, LRP и т.д.), ответственные за элиминацию цитостатиков из клеток; б) ферментные системы цитоплаз-матических органелл, обеспечивающие акцепцию свободных радикалов и биодеградацию цитостатиков (в частности система глутатиона); в) ферментные системы ядра, обеспечивающие репарацию повреждений ДНК ( в част-ности топоизомеразы); г) остановка разных этапов запрограммированной клеточной гибели клеток под воздействием химиопрепаратов вследствие мутаций или уменьшения активности генов, регулирующих апоптоз.
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - одна из наиболее изучаемых и часто наблюдаемых в экспериментальных исследованиях форм устойчивости опухолей к различным цитостатикам [20,65,135,161,165]. Фенотип МЛУ был впервые описан в 1970 г. J.L3redlei [79] в опухолевых клетках рака яичников китайского хомячка. Отличительной особенностью клеток с фенотипом МЛУ является перекрестная устойчивость к целому классу полшшк-лических, структурно не связанных и различных по механизму действия цитостатиков природного (винкристин, винбластин, адриамицин, доксорубицин, паклитаксел др.) и искусственного (цисплатин, карбоплатин и др.) происхождения [9,45]. Было установлено, что феномен МЛУ в перевивных клеточных линиях связан с функционирование в плазматических мембранах Р-гликопротеина (Р-170). Обладая АТФ-азной активностью, Р-170 осуществляет АТФ-зависимый выброс препаратов, приводя, таким образом, к уменьшению их накопления в клетке. Проявление Р-гликопротеин-зависимой МЛУ, в свою очередь, связано с функционированием генапкіг-1 [145,191]. Экспрессия Р-170 часто наблюдается в клетках опухолей, которые развиваются из органов и тканей, контактирующих с ксенобиотиками, и в которых в норме экспрессирован Р-170 (желудок, почки, легкие). Следовательно, при трансформации нормальной ткани в опухолевую часто экспрессия этого белка сохраняется, что может быть причиной первичной химиорезистентности таких опухолей [2]. Исследованиями in vitro по изучению экспрессии mdr-1 - гена в образцах РЯ человека, было показано, что при первичном РЯ человека исходно, до химиотерапии существуют опухолевые клетки с исходной множественной лекарственной резистентностью [67].
В опухолях больных РЯ, получавших химиотерапию были обнаружены экспрессия гена mdr-1 и Р-170 [62]. Р-170 считают ответственным за некоторую долю вторичной, приобретенной в процессе лечения химиорезистентности опухолей человека, однако, поскольку известно существование форм устойчивости, не связанных с Р-170, нельзя утверждать, что отсутствие экспрессии этого белка является показателем чувствительности опухоли к цитостатикам [43,45].
В последнее время были идентифицированы новые белки, ответственные за лекарственную резистентность - MRP (протеин, ассоциированный с множественной лекарственной резистентностью) и LRP (дословно - протеин резистентности легкого). Белок MRP является членом АТФ-связывающих транспортных систем [34,75]. В разных линиях опухолевых клеток MRP обнаруживается либо на плазматической мембране, либо на мембранах внутриклеточных органелл. В модельных клеточных системах экспрессия этого белка происходит при индукции резистентности к Цп, Эт и доксорубицину [181]. Клиническая значимость MRP также установлена. Так, было показано, что больные немелко-клеточным раком легкого, имеющие гиперэкспрессию MRP и мутантный р53, имели худший прогноз, чем больные без MRP и мутантного р53.
LRP относится к рибо/нуклеобелкам, которые локализуются в цитоплаз-матических везикулах и ядерных мембранах. Его функция заключается в перераспределении ксенобиотиков (в частности для LRP - доксорубипина) между ядром и цитоплазматическим ретикулумом. На клеточных линиях рака легкого была показана корреляция степени экспрессии этого белка с устойчивостью опухолевых клеток к Цп [197]. По некоторым данным только LRP показал себя статистичесіси значимым маркером резистентности клеток РЯ человека к препаратам платины [4,75,134]. В настоящее время проводится активное изучение роли экспрессии этих белков при различных злокачественных новообразованиях.
Сравнение чувствительности клеток рак яичников у первичных и леченых больных в МТТ-тесте
Рак яичников является наиболее частой формой злокачественных новообразований женских половых органов. Ранняя диагностика РЯ трудна, т.к. это заболевание длительное время протекает бессимптомно, и до настоящего времени не разработано специфических диагаостичесгсих тестов, позволяющих выявить опухоль на начальных этапах ее развития. Поэтому, более чем у половины пациенток РЯ диагностируется в III-IV стадиях, когда уже имеются поражения париетальной и висцеральной брюшины и асцит. Это обуславливает применение пред- и послеоперационной полихимиотерапии. Около 80% первичных больных РЯ чувствительны к химиотерапии, однако в процессе лечения неизбежно развивается вторичная химиорезистентность, причиной которой является как селекция устойчивых клонов опухолевых клеток, так и активация в клетках механизмов химиорезистентности. Поэтому, одним из путей повышения эффективности терапии этой группы больных является выбор индивидуальной тактики лечения с учетом результатов оценки степени чувствительности ОК к цитостатикам в МТТ-тесте.
Целью настоящего раздела работы было сравнение чувствительности in vitro опухолевых клеток РЯ, полученных от первичных и уже леченных больных к цитостатикам, наиболее часто применяемых в химиотерапии РЯ.
С помощью МТТ-теста исследован профиль чувствительности клеток РЯ 80 первичных больных (I группа), 58 пациенток, получивших от 1 до 5 курсов химиотерапии (II группа) и 38 - получивших более 5 курсов химиотерапии (III группа). В большинстве случаев в качестве терапии I линии больные получали препараты платины (Цп или Кпл) в составе схем САР. Источником опухолевых клеток была ткань РЯ (14 образцов от первичных больных, 17 - от больных II группы и 4 - от лациенток III группы), асцитическая жидкость (АЖ), полученная путем парацентеза 65 первичных оольных і группы, 37 - 11-ой группы и 33 - Ш-ей группы, а также плевральная жидкость, полученная от 1 первичной больной, 4 - из II группы и 1 - из III группы. В работе были использованы следующие цитостатики: Фр, Цп, Кпл, Цпл, Т-Т, 5-ФУ, Эт, Тх и Txt. По кривым «доза - эффект» в каждом конкретном случае для всех препаратов вычисляли значения ІСзо - дозы препарата, при которой по данным МТТ-теста погибало 50% опухолевых клеток. Для определения значения средней 1Сзо(сР) всей выборки строили усредненный график «доза - эффект» для каждого цитостатика, т.е. высчитывали средний процент выживших клеток для всех исследуемых концентраций данного терапевтического агента.
Для определения степени чувствительности клеток РЯ к каждому цитостатику по этой кривой определяли значения 1С45 ср и ICsscp, для разделения имеющихся образцов РЯ по профилю чувствительности на чувствительные, умеренно чувствительные и резистентные. Чувствительными считали те образ-цы, индивидуальные значения ІСзо которых было меньше ІС55 ср, полученной по средней кривой для данного препарата (Рис.1). Умеренно-чувствительными -случаи, индивидуальные значения ІСзо которых находились в диапазоне ІС55 сР -ІС45 ср, а резистентными - для значений ІС50, превышающих уровень значений ІС45 ср тестируемого агента.
Для изучения чувствительности клеток РЯ к Фр в МТТ-тесте были использованы опухолевые клетки 78 первичных больных, 58 больных, получивших до 5 курсов химиотерапии и 37 пациенток получивших более 5 курсов. Для I -ой группы больных минимальное значение ICso в выборке составило 0,01 мкг/мл, максимальное - 12 мкг/мл. Для II группы больных эти показатели составили 0,01 и 17,0 мкг/мл, для III группы - 0,01 и 25,0 мкг/мл, соответственно. У 12 первичных больных РЯ (15%) определить ICso не представлялось возможным, т.к. уже наименьшая концентрация Фр (0,2 мкг/мл) вызывала гибель более 50% клеток. Такая же картина наблюдалась во второй (11 случаев (19%)) и третьей (3 из 37 случаев) группах больных. В тоже время, во 11-ой группе пациенток в 2 случаях из 58 ICso препарата не удалось определить по другой причине: на максимальной концентрации Фр, используемой в эксперименте (2,0 мкг/мл) данный цитостатик вызывал гибель менее 50% клеток.
Среднее значение ІСзо сР для больных 1-ой группы составило 1,0±0,2 мкг/мл, для больных II группы оно практически не изменилось -1,1 ±0,6 мкг/мл, а для больных III группы это значение несколько увеличилось по сравнению с I и П-ой группами и составило 1,25±1,0мкг/мл (Табл.3).
Некоторый сдвиг ІСзо ср для образцов клеток РЯ III группы, а также расположение усредненной кривой выше для этой группы больных, чем таковой для группы первичных пациенток, свидетельствует в пользу предположения о становлении резистентности к Фр в процессе химиотерапии (Рис.2).
Действительно, анализ профиля чувствительности к Фр для этих групп пациенток подтверждает это высказывание. Количество случаев, чувствительных к фарморубицину для первичных больных составило 41%±5,6 против 40%±6,5 ВО П-ой группе и 30%±7,6 - в П1-ей. Доля резистентных образцов в процессе лечения увеличивалась (24%±4,9 против 36%±6,4 против 54%±8,2, соответственно) (р 0,05). Количество же умеренно чувствительных случаев уменьшалось от I - ой к Ш - ей группе (35%±5,4 против 24%±5,7 против 16%±6,0, соответственно) (Табл.4). Развитие резистентности к Фр начинается уже в течение 5-й первых курсов химиотерапии и нарастает с количеством курсов. Это находит свое отражение в постепенном увеличении ІСзоср и нарастании процента опухолей, резистентных к этому препарату. Это происходит сначала за счет перехода умеренно чувствительных опухолей в разряд резистентных, а после 5-й курсов химиотерапии и за счет перехода ряда исходно чувствительных опухолей в разряд резистентных. В целом, после 5 курсов терапии химиорезистентность развивается у Ул из исходно чувствительных опухолей. Дополнительным подтверждением вышесказанному является расположение кривой «доза-эффект» (Рис. 2а).
Для изучения чувствительности клеток РЛ к Цп в МТТ-тесте были использованы клетки 80 первичных больных, 58 больных, получивших до 5 курсов химиотерапии и 36 пациенток получивших более 5 курсов. Для группы первичных больных минимальное значение ІСзо в выборке составило 0,05 мкг/мл, максимальное - 16,5 мкг/мл. Для II группы больных эти показатели составили ОД и 15,0 мкг/мл, для III группы 1,0 и 22,0 мкг/мл, соответственно. У 1 первичной больной РЯ определить ІСзо не представлялось возможным, т.к. уже наименьшая концентрация Цп (0,5 мкг/мл) вызывала гибель более 50% клеток. Такая же картина наблюдалась во второй (4 случая из 58) и третьей (1 случай из 36) группах больных. Кроме того, во II и III группах имелось по 1 случаю, когда ІС50 препарата не удалось определить, т.к. на максимальной концентрации Цп, используемой в данном исследовании (25,0 мкг/мл), выживало более 50% клеток.
Среднее значение ІСзоср для первичных больных составило 3,5±0,4 мкг/мл, для больных II группы оно практически не изменилось и составило 3,2±0,4 мкг/мл, а для больных III группы ІСзо ср данного препарата увеличилась до 4,2±1,0 мкг/мл (Табл.3). Анализ усредненных кривых «доза - эффект» для больных 1-ой и Ш-ей групп показывает, что кривая для леченных больных располагается выше, чем кривая для первичных больных (Рис.2а), т.е. опухолевые клетки не леченых пациенток являются более чувствительными к Цп.
Далее, было определено количество случаев, чувствительных к данному препарату для каждой из исследуемых групп: для первичных больных оно составило 54%±5,6, для группы больных, получивших менее 5 курсов химиотерапии - 60%±6,5, а для больных с 5 и более курсами - 39%±8,1. Количество же резистентных к Цп образцов в этих группах составило 35%±5,4, 30%±6,1 и 50%±8,5, соответственно (р 0,2). Доля умеренно чувствительных случаев не менялась (11%±3,5 в 1-ой группе; 10%±4,0 - во П-ой и 11 %±5,3 - в Ш-ей) (Табл.4). Таким образом, в течение первых 5-й курсов химиотерапии степень чувствительности к Цп не изменяется, что подтверждается неизменным процентом чувствительных и резистентных опухолей. При дальнейшем лечении наблюдается развитие резистентности к Цп у 1/3 из исходно чувствительных и умеренно-чувствительных больных. На это указывает и увеличение значения ІС50 ср, нарастание доли резистентных и уменьшение процента чувствительных образцов, а также расположение усредненной кривой "доза-эффект", полученной для этой группы (Рис.2а).
Сравнение цитостатической активности производных платины (цисплатина, карбоплатина и циклоплатама) in vitro в отношении клеток рака яичников человека
С помощью МТТ-теста исследована чувствительность клеток РЯ 75 первичных и 28 леченых больных РЯ параллельно к Цп и к Цпл; 43 первичных и 22 леченых больных параллельно к Цп и Кпл, 40 первичных и 18 леченых больных к Цпл и Кпл.
Источником опухолевых клеток была ткань РЯ человека (13 образцов от первичных больных, 4 - от больных, получивших от 5 и более курсов химиотерапии, операционный материал), АЖ, полученная путем парацентеза больных РЯ (64 образца от первичных пациенток и 30 - от больных после химиотерапии (5 и более курсов)) и плевральная жидкость, полученная у 1 первичной и 1 леченой больных. Таким образом, исследованы опухолевые клетки 78 первичных пациенток и 35 леченых больных РЯ.
Для сравнения цитостатической активности производных платины были определены значения IC50 этих препаратов (см. Гл. 3.1.). Далее, на основании значений индивидуальных ICso были построены графики, отражающие взаимосвязь ICso Цп - IC50 Цпл, ICso Цп - ICso Кпл и ICso Цпл - ICso Кпл отдельно для первичных и уже леченных больных.
Для первичных больных РЯ установлено, что ІС50 Цп и Кпл связаны между собой линейной зависимостью и наблюдается прямая достоверная корреляция (г =+0,75) между чувствительностью опухолевых клеток РЯ к Цп и Кпл (Рис.5а). Действительно, доля опухолей, чувствительных к обоим этим препаратам была сравнительно велика и составляла 44%±7,7 (Табл.6). Кроме того, в 26%±6,8 случаев отмечалась параллельная резистентность к обоим цитостатикам. Таким образом, в доминирующем проценте случаев (70%) отмечено совпадение по профилю чувствительности опухолей к Цп и Кпл.
В охарактеризованной выборке обнаружена также незначительная доля опухолей, резистентных к Кпл, но чувствительных к Цп (9%±4,4) и доля РЯ, резистентная к Цп, но чувствительная к Кпл (21%±6,3). В целом же, по данным in vitro, при наличии исходной резистентности клеток РЯ к Цп в большинстве случаев, вероятно, нецелесообразно использовать в терапии I линии и Кпл. Сходные данные, касающиеся Кпл и Цп, получены и для группы больных РЯ после химиотерапии. Сохранение прямой линейной достоверной зависимости между ІСзо Цп и Кпл в процессе химиотерапии (г= +-0,72) означает, что развитие резистентности к этим цитостатикам идет параллельно и, вероятно, в целом обусловлено одними и теми же механизмами (Рис.5в). Доказательством этого является также увеличение доли опухолей, одновременно резистентных к этим препаратам по сравнению с группой первичных пациенток (50% ±11,0 против 26%±6,8) (Табл.6), и снижение числа случаев чувствительных к этой паре цито-статиков (32%=Ы0,2 против 44%±7,7).
Между ІС50 Цп и Цпл для клеток РЯ первичных больных обнаружена слабая взаимосвязь (г= +0,33), о чем свидетельствует и низкий наклон прямой к оси абсцисс (Рис. 6а). При этом, в целом, совпадение по профилю чувствительности обнаружено для этой пары препаратов в 57% случаев. Как и сама прямая, так и представленные на Рис.ба индивидуальные данные, свидетельствуют о том, что в 1/5 случаев (23%±4,4) опухолевые клетки резистентны к Цпл, но чувствительны к Цп. В то же время, среди образцов первичных больных в 20%±4,6 случаев встречаются опухоли, резистентные in vitro к Цп, но чувствительные к Цпл. Эти данные, полученные в экспериментах in vitro относительно сравнительной эффективности Цп и Цпл для клеток РЯ первичных больных, позволяют сделать предположение, что если нет клинического эффекта на Цп, то в 20%±4,6 случаев можно ожидать эффекта при назначении Цпл. Однако если при химиотерапии 1-ой линии был
В выборке уже леченных больных корреляционная зависимость между чувствительностью опухолевых клеток к этим препаратам также оказалась слабой (г= +0,26) (Рис.бв). Количество опухолей, чувствительных к обоим цитостатикам, уменьшилось по сравнению с группой первичных больных (23%±8,1 против 32%± 5,4), а процент резистентных опухолей как к Цп, так и к Цпл несколько увеличился (35%±9,2 против 25%±5,0). Совпадение по профилю чувствительности к Цп и Цпл у этой группы больных, как и у первичных пациенток не изменился и составил 58% (Табл.6). Соотношение опухолей, резистентных к Цп, но чувствительных к Цпл немного увеличилось (26%±8,4 против 20%±4,6), а резистентных к Цпл, но чувствительных к Цп несколько уменьшилось (16%±7Д против 23%±4,4). Таким образом, в опухолевых клетках РЯ наряду с общими механизмами, ответственными за резистентность к Цп и Цпл, существуют и различающиеся механизмы, ответственных за резистентность к каждому из этих цитостатикам.
При исследовании Кпл и Цпл in vitro было показано наличие слабой взаимосвязи между IC50 этих препаратов для клеток РЯ первичных больных (г=+0,27). Эти данные сходны с таковыми, полученными для ІСзо Цп и Цпл (Рис. 7а). Процент опухолей, чувствительных к обоим цитостатикам составил 38%±7Д а резистентных - 25%±б,9, т.е. профиль чувствительности этой пары препаратов совпадает в 63% случаев. В то же время, наши данные свидетельствуют и о том, что имеется почти треть случаев (29%±7,2) чувствительных к Кпд и резистентных к Цпл, и есть небольшой процент опухолей (8%±4,3) чувствительных к Цпл, но резистентных к Кпл (Табл.6).
Для группы больных РЯ, получавших ранее химиотерапию коэффициент корреляции между ІС50 Кпл и Цпл составил +0,51, что говорит о наличии достоверной, но умеренной взаимосвязи между ІСзо этих препаратов (Рис.7в). В этой выборке количество опухолей чувствительных к обоим препаратам уменьшилось по сравнению с группой первичных пациенток (28%±10,6 против 38%±7,8), при этом незначительно увеличилось количество случаев резистентности к этим цитостатикам (38%±11,4 против 25%±6,9) (Табл.6), что, вероятно, указывает на наличие сходных механизмов резистентности для этих препаратов. В целом, совпадение по профилю чувствительности к этой паре цитостати-ков в группе пациенток, получавших ранее химиотерапевтическое лечение, составило 66% случаев. В то же время обнаружено увеличение доли опухолей, резистентные к Кпл, но чувствительных к Цпл (17%±8,9 против 8%±4,3), и значительное уменьшение количества случаев резистентных к Цпл, но чувствительных к Кпл (17% ± 8,9 против 29% ± 7,2) что, возможно, свидетельствует о более быстром нарастании резистентности к Цпл, чем к Кпл.
Таким образом, сравнивая профиль чувствительности клеток РЯяервич-ных больных и пациенток, уже получавших химиотерапию к парам цитостати-ков - Цп -Кпл, Кпл - Дпл ж Дп - Цпл, можно заключить, что лаже в пределах цитостатических агентов одного класса процессы в опухолевых клетках, приводящие к формированию лекарственной устойчивости, вероятно, могут быть обусловлены как схожими, так и различающимися механизмами.
Совокупность данных, полученных в экспериментах in vitro, позволяет сделать ряд клинических предположений: 1) В случае развития резистентности к Цп в процессе химиотерапии, возможно применение Кпл и Цпл 2) при развитии резистентности к Кпл можно ожидать эффект от применения Цкл; 3) В случае развития вторичной резистентности к Цпл может быть целесообразна замена его на Цп или Кпл.
Модель независимого действия препаратов
При обсчете полученных экспериментальных данных была использована модель независимого действия цитостатиков на опухолевые клетки [52,183]. Согласно этой модели доля опухолевых клеток, выживших при действии препарата «А» отражает вероятность выживания клеток при действии препарата «А», а доля выживших при действии препарата «В» отражает вероятность выживания клеток при действии препарата «В». Реальная доля выживших клеток при совместном действии препаратов «А» и «В» отражает реальную вероятность выживания при сочетанном действии «А» и «В». Ожидаемую (при независимом действии «А» и «В») долю выживших клеток высчитывали как произведение вероятностей клеток выжить при действии «А» и действии «В». Если реальная и ожидаемая величины совпадали (с точностью до ± 0,1, т.е. ± 10%), это свидетельствовало об аддитивном эффекте «А» и «В» при сочетании в данных концентрациях. Превышение реальной величины над ожидаемой более, чем на 0,1 являлось свидетельством антагонизма в действии цитостатиков, а превышение ожидаемой величины над реальной более, чем на ОД, являлось свидетельством синергизма в действии препаратов. В модели независимого действия аддитивностью называется случай, когда часть популяции клеток, резистентных к «А», является частью популяции клеток, чувствительных к «В». Антагонизмом называется случай, когда популяция клеток, резистентных к менее эффективному цитостатику, полностью перекрывает популяцию клеток, резистентных к более эффективному цитостатику. Синергизмом (сверхаддитивностью) называется случай, когда популяции резистентных к «А» и «В» клеток не перекрываются (Рис.9). То есть, в используемой модели независимого действия цитостатиков термины «антагонизм» и «синергизм» не предполагают истинного усиления или ослабления действия одного цитостатика другим, а лишь перекрывание или не перекрывание чувствительных и резистентных к каждому из химиопрепаратов популяций опухолевых клеток. Если полученные данные будут укладываться в эту модель, то это будет подтверждать модель независимого действия цитостатиков. Если же результаты исследования не будут соответствовать использованной модели, то действие химиопрепаратов при соче-танном применении не является независимым. Все полученные данные были обсчитаны с использованием выкладок, представленных выше.
При анализе результатов прежде всего хотелось бы отметить, что тип реального эффекта пар цитостатиков при их одновременном внесении не зависел от величины эффекта каждого из химиопрепаратов в сочетании: антагонизм, аддитивность и синергизм наблюдались как для пар с низким, так и для таковых с высоким цитостатическим эффектом. Суммарные данные для всех пар цитостатиков представлены на Рис.10. Очевидно, что при сочетании препаратов в малых дозах (1+1) случаи антагонизма, аддитивности и синергизма наблюдаются приблизительно в равном количестве случаев (38%+ЗД, 35%±3,1 и 27%± 2,9, соответственно).
При сочетании цитостатиков в максимальных дозах (3+3) (Рис. 10) получены принципиально иные данные: в большинстве случаев (50%±3,5) установлена аддитивность в действии препаратов в парах, что свидетельствует о частичном перекрывании резистентных к каждому из цитостатиков популяций ОК. Количество же случаев синергизма и антагонизма выявлено в 37%±3,3 и 13%+ 2,3, соответственно.
При сочетании терапевтических агентов в средних концентрациях (2+2) доля случаев синергизма и аддитивности была равной и составляла 41 %±3,1 и 38%±3,0, соответственно. Антагонизм наблюдался в 21%+2,5 случаев.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что с увеличением концентрации каждого из цитостатиков в паре при их одновременном внесении, количество случаев антагонизма уменьшается, а аддитивности возрастает. Наибольший процент случаев синергизма был отмечен на средней и максимальной концентрациях.
Следует отметить, что представленные выше данные являются средними для 710 тестирований разных пар цитостатиков, однако они были характерными и для каждой пары химиотерапевтических агентов. Таким образом, выявленные закономерности являются общими для химиочувствительности клеток РЯ in vitro к парам цитостатиков при их одномоментном внесении.
Казалось бы, все представленные данные укладываются в модель независимого действия препаратов. Тем не менее, в ряде случаев, полученные результаты не согласуются с этой моделью. Так, согласно этой модели, при увеличении концентрации цитостатиков в паре невозможна замена антагонизма на аддитивность и антагонизма на синергизм (Рис.9). Однако в первичных материалах, при изучении влияния отдельных препаратов и их пар в разных концентрациях на выживаемость опухолевых клеток одного и того же больного было выявлено 59 случаев смены антагонизма на аддитивность и 46 случаев смены антагонизма на синергизм при увеличении концентрации цитостатиков. То есть, несогласование с моделью независимого действия цитостатических агентов обнаружено в 105 из 710 случаев (15%). В оставшихся 85% случаев воздействие препаратов на опухолевые клетки in vitro является независимым.
