Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Эпидемиология опухолей у человека. Экспериментальные подходы к изучению факторов риска и путей профилактики рака 11
1.2. Связь рака и старения. Пути профилактики преждевременного старения 16
1.3. Экспериментальные модели и методы изучения влияния модифицирующих факторов на канцерогенез и старение 24
1.4. Влияние гормонов, модификаторов гормонального статуса ипептидов на канцерогенез и старение 34
1.5. Энтеросорбенты как геропротекторы и модификаторы канцерогенеза 41
Глава 2. Материалы и методика 5 Г
2.1. Животные 51
2.2. Препараты » 52:
2.3. Схема экспериментов 53
2.3.1. Опыты с мелатонином 53
2.3.2. Опыты с э питало ном 56
2.3.3. Опыты сдельтараном 58
2.3.4. Опыты с диабенолом 5
2.3.5. Опыты сакваленом 60
2.4. Методы оценки регистрируемых параметров 61
Глава 3. Результаты собственных исследований 76
3.1. Исследование эффекта мелатонина 76
3.1.1. Результаты опытов на мышах SHR 76
3.1.2. Результаты опытов на мышах СВА 90
3.1.3. Результаты опытов на мышах HER-2/neu 101
3.1.4. Результаты опытов на мышах SAMP-1 112
3.1.5. Результаты опытов на мышах SAMR-1 118
3Л.6. Влияние мелатонина на канцерогенез кишечника у крыс, вызванный 1.2-дим етил гидр аз ином . І27
3.2. Исследование эффекта эпигалона 137
3.2Л. Результаты опытов на мышах SHR 137
3.2.2. Результаты опытов на мышах СВА 144
3.2.3. Результаты опытов на мышах HER-2/neu 153
3.2.4. Результаты опытов на мышах SAMP-1 159
3.2.5. Результаты опытов на мышах SAMR-1 164
3.2.5. Влияние эпигалона на канцерогенез кишечника у крыс, вызванный 1,2-диметилгидразином 171
3.3. Исследование эффекта дельтарана 178
З.ЗЛ. Результаты опытов на мышах SHR 178
3.3.2. Результаты опытов на мышах HER-2/neu 184
3.4. Исследование эффекта диабенола 188
3.4.1. Результаты опытов на мышах NMR1 188
3.4.2. Результаты опытов на мышах HER-2/neu 196
3.4.3. Влияние диабепола на канцерогенез кишечника у крыс, вызванный 1.2-диметилгидразином 201
3.5. Исследование эффекта аквалена 208
3.5.1. Результаты опытов на мышах SHR 208
3.5.2. Результаты опытов у крыс LIO 213
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 220
Заключение 260
Выводы 264
Список литературы 267
- Эпидемиология опухолей у человека. Экспериментальные подходы к изучению факторов риска и путей профилактики рака
- Экспериментальные модели и методы изучения влияния модифицирующих факторов на канцерогенез и старение
- Опыты с мелатонином
- Влияние мелатонина на канцерогенез кишечника у крыс, вызванный 1.2-дим етил гидр аз ином
Введение к работе
Актуальность проблемы
Заболеваемость злокачественными новообразованиями во всем мире неуклонно растет (Parkin D.M. et al., 2002), поэтому разработку способов профилактики злокачественных новообразований5!! поиск препаратов, препятствующих развитию рака, можно считать одной из основных задач противораковой борьбы. Для выявления факторов риска развития рака и разработки мер по предотвращению возникновения и развития опухолей, необходимо изучить эффект препаратов, способных модифицировать процесс канцерогенеза, поскольку это ключевая информация к пониманию процессов развития рака у человека (Bercnblum 1., 1980). Модифицирующие факторы способны влиять как па степень выраженности эффекта, вызванного канцерогенным агентом; так и на его качественное проявление (Bogovsky Р., 1983). Изучение влияния модифицирующих факторов является весьма важным в связи с тем, что многие из них находятся в окружающей человека среде, а также являются составляющими диеты (Boyland Е., 1981), и оказывают влияние непосредственно на человеческий организм. Некоторые га модифицирующих факторов действуют как кокапцерогены, усиливая влияние истинных канцерогенов, тогда как другие тормозят процесс возникновения и развития рака, играя роль антиканцерогенных агентов (Bogovsky Р., 1983).
Среди модифицирующих канцерогенез* факторов большое внимание уделяется лекарственным препаратам длительного применения, используемым для лечения и профилактики различных заболеваний. В их ряду особое место занимают геропротекторные препараты (вещества или средства), способные препятствовать преждевременному старению или увеличивать продолжительность жизни (Обухова Л.К., 1975; Emanuel N.M., Obu-chova L.K., 1978; Zs-Nagy I. (eti.) et al., 1994). Интерес к разработке и изучению геропро-текторных препаратов обусловлен наблюдаемым повсеместно увеличением продолжительности жизни людей и связанным с ним постарением населения в целом, т.е. увеличением в структуре населения доли пожилых, что является важным фактором роста онкологической заболеваемости (Напалков Н.П., 2004).
Применение геропротекторных препаратов, препятствующих старению и увеличивающих продолжительность жизни, подразумевает длительное их использование. В связи с этим остро стоит вопрос о безопасности этих средств, включая отсутствие риска развития онкологических заболеваний, поскольку показано, что увеличение продолжительности жизни у животных при использовании некоторых геропротекторов сопровождается
увеличением частоті.! опухолей (Aiiisimov V.N., 2001, Лиисимов В.Н., 2003). С лруїоіі стороны, известно, что ряд гсропротекторов обладает антиканцерогенными свойствами (Лиисимов В.Н., 2003). Поэтому актуальным является всестороннее шученис действия гсро протекторных препаратов в эксперименте, позволяющее оценить их влияние, как на процессы старения, так и на развитие новообразований.
Одним из подходов к решению этой задачи является изучение влияния геропротскторов на. спонтанный канцерогенез у мышей различных линий, что-при-длительном-наблюдении за животными позволяет оценить шменение динамики различных показателей биологического возраста и развития опухолей. В последнее время особое внимание уделяют исследованиям, проводимым на трансгенных или мутантііьіх линиях животных. Например, в опытах на линии транс генных мышей с инкорпорированным геном рака молочной железы HER-2/neu (Chan R. et al., 1999) можно одновременно оценить роль потенциальных геропротскторов как средств профилактики рака молочной--железы - наиболее распространенного онкологического заболевания у женщин, частота которого увеличивается с возрастом. Для-изучения эффекта и механизмов потенциальных геропротскторов и антиканцерогенов перспективными являются также исследования, проводимые на му-тантных линиях мышей SAM с ускоренным старением, обусловленным накоплением свободных радикалов (Takcda Т. et al., 1997; Юнева М.О. и др., 2000).
В плане изучения геропротекторов как антиканцерогенов, несомненно, важной является оценка нх влияния на моделях индуцированного канцерогенеза у животных. Од-ной из. них. являются карциномы толстой* кишки у крыс, индуцируемые 1,2-диметилтидразином (ДМГ) у крыс. Поскольку опухоли этой локализации относятся к .числу наиболее распространенных новообразований в разных странах мира (Coleman М,P. et al, 1993), то изучение геропротекторных препаратов на .такой модели позволяет изыскивать новые подходы к лечению и профилактике рака толстого кишечника.
Геропротекторы имеют разную природу и обладают различным механизмом дейст-вияна организм. В: последние годы большое внимание уделяется < изучению индольного гормона эпифиза мелатонина (МЛТ), поскольку при старении происходит снижение уровня МЛТ.в организме (Reiter R.J.:, 1995; Аниеимов В.Н.,1998). Изучение эффекта MJTT; свидетельствует о противоречивом характере его действия;.В некоторых работах отмечено-увеличение продолжительности жизни: подопытных мышей (Pierpaoli W., Maestroni-G.J.M;, 1987), тогда как в других экспериментах с MJTT эффект увеличеният продолжительности; жизни отсутствовал и г наблюдалось возрастание частоты опухолей (Романен-коВ.И., 1983; Pierpaoli W., Regelson W., 1994). Синтетический тетрапептид эпиталон, стимулирующий продукцию МЛТ, обладает способностью-увеличивать среднюю -и макси-
мальную продолжительность жшнн плодовых мух и замедлять теми их старения, активизируя антиоксидантную систему Dr.melanogastcr (Мыльников СВ., Любимова Н.Е., 2000). Изучение гер о протекторных свойств. МЛТ и эпигалона, а также их модифицирующего влияния на канцерогенез в сравнительном аспекте является весьма актуальным.
Известно, 'гго некоторые антиоксиданты и адантогены могут тормозить канцерогенез и старение (Ames B.N: et al., 1993; Balanskt R: et at, 1992; Bittles AH. et al,, 1979). Эндогенный нонапеїггид DSIP (дельта-сон-индуцирующий пептид) обладает адаггтогенной и аигистрессорной и адаптогенной активностью, также отмечены его антиметастатические свойства (Graf M.V., Kastin A.J.,t986; Судаков KB:, 1991; Прудченко И.А. и др., 1993). На основе синтетического нонапептида DSIP был разработан лекарственный препарат дель-тпран. Поэтому представляет интерес оценка влияния дельтарана на развитие опухолей и на показатели старения у животных.
Из многочисленных работ известно о способности некоторых антидиабетических іп)еплратов(буформина, фенформина) тормозить развитие опухолей в. эксперименте, а также увеличивать продолжительность жизни животных и нормализовать нарушения обмена у онкологических больных (Дильман В.М:, 1987; Берштейн Л.М. и др., 1992; Аниси-мов В.Н., 2000). В этой связи актуальным является анализ влияния нового антилиабетиче-ского препарата диабенол (Спасов А.А. и др., 1997) на продолжительность жилш и канцерогенез.
Втлитературе имеются эпидемиологические данные о способности:пищевых волокон, обладающих; свойствами энтеросорбентов, приводить к торможению развития, рака при добавлении их к диете (Moon Т.Е., MicozzrMS. (eds.) 1989), а также об увеличении> средней ПЖ крыс, получавших с кормом углеродный сорбент, по сравнению;с контрольной группой (Фролькис В.В;, Мурадян Х.К., 1988). Поэтому весьма обоснованным является изучение нового высокоэффективного волокнистого энтеросорбента аквален (Libermam A.I. et al., 1996) в качестве потенциалыюго< геропротекторного и антиканцерогенного средства.
Исследование іфоцессов старения и канцерогенеза на протяжении всей жизни животных в хронических экспериментах подразумевает: оценку билогических маркеров старения :и параметров канцерогенеза: Значение проблемы биомаркеров старения состоит вт выявлении факторов, способствующих преждевременному и/или ускоренному старению, а- также в опенке эффективности применения средств, профилактики раннего старения. Так, эпидемиологические наблюдения свидетельствуют об увеличении смертности и риска развития опухолей при^гоезмерно большом весе тела и ожирении (Lee I.M; et а!., 2001), поэтому вес тела животных может являться значимым биомаркером, Возрастное измене-
ппс потребления корма, также как и массы тела, может служить значимым критерием старения. Известно, "гто ограничение калорийности питания и связанное с этим снижение массы тела животных существенным образом замедляют старение и тормозят канцерогенез (Walford R.L., 1974; Weindruch R.,Wa!ford R.L.,1988). В механизме такого действия ограниченного по калорийности питания важное значение имеет угнетение свободноради-кпльных процессов (Walford R.L., 1974), которые играют существенную роль в процессах старения; и развития рака. Выяснение влияния изучаемых препаратов на интенсивность свобод нор адикальных процессов также является важным биологическим маркером. Интегральным показателем обменных процессов может являться температура тела, поскольку известно, что снижение температуры тела и связанное с ним замедление метаболических процессов в организме увеличивает продолжительность жизни животных (McCleani G.E., 1997). Поведенческие реакции, позволяющие оценить функциональное состояние нервной системы, а также оценка двигательной активности и утомляемости могут Сыть также важными биомаркерами старения.
С возрастом наблюдается угасание репродуктивной функции как у человека, так и у животных (Дильман В.М., 1987), поэтому оценка возрастного шменсния эстральиой функции (длительность астрального цикла, соотношение частоты коротких и длинных эстральных циклов, наличие нормальных и иррегулярных циклов) может быть значимым для анализа процессов старения репродуктивной системы животных. Имеются доказательства накопления с возрастом спонтанных мутаций в соматических и половых клетках (Vijg J., 2000; Розепфельд СВ., 2001), поэтому сравнительное изменение частоты хромосомных аберраций у животных с возрастом может служить биомаркером старения. Важнейшим интегральным показателем: старения является выживаемость и: ПЖ животных. При этом оценивают среднюю продолжительность жизни как всех, так и последних 10*3о животных, а также медиану и максимальную продолжительность жизни. Для оценки этих параметров исполыуют различные математические модели старения и смертности.
Одним из основных факторов, ограничивающих продолжительность жизни, является развитие новообразований. Поэтому изучение частоты развития опухолей, времени их появления, множественности, локализацией гистологической характеристики у животных - это важный критерий при изучении процессов старения и канцерогене;!а, а также возможных путей модификации этих процессов.
Анализ бимаркеров старения и канцерогенеза у животных при воздействии иїу-чаемых препаратов дает возможность оценить механизмы возможного' антиканцерогенного и геропротекторного действия этих средств.
Цель исследования
Целью диссертационной работы является экспериментальное изучение модифицирующего канцерогенез эффекта потенциальных геропротекторных препаратов различных фармакологических групп с помощью системы биотестироваиия, позволяющей оценить механизмы действия данных препаратов и включающей животных с различными генетическими характеристиками.
Задачи исследовании
Изучить влияние препаратов: мелатонина, эпиталона, дельтарана, диабенола и сорбента аквалсн на биомаркеры гомеостаза и старения, показатели продолжительности жизни и спонтанный канцерогенез у низкораковых линий мышей (SHR, СВА или NMRI), а также мутантных мышей SAM.
Оценить действие мелатонина, эпиталона, дельтарана и диабенола на продолжительность жизни, показатели гомеостаза и биологического возраста, а также развитие опухолей молочной железы у трансгенных мышей с инкорпорированным онкогеном HER-2/neu.
Изучить эффект мелатонина, эпиталона, диабенола и аквалсна на канцерогенез-толстой кишки у крыс, индуцированный ДМГ.
А. Провести сравнительный анализ эффективности и механизмов действия исследо-ванных препаратов и оцепить перспективы их дальнейшего изучения в качестве? средств профилактики рака и предупреждения преждевременного старения у человека.
Научная новизна
Впервые разработана и апробирована система комплексной сравнительной оценки эффекта препаратов различных фармакологических групп на показатели старения, продолжительности жизни и развитие спонтанных и индуцированных опухолей у экспериментальных животных.
На моделях спонтанного и икдуцироваїпюго канцерогенеза впервые изучен модифицирующий эффект новых химических препаратов, обладающих возможными геро-протекторными свойствами— эпиталона, дельтарана, диабенола и аквалсна.
Впервые проведено изучение механизмов антиканцерогенного влияния мелатонина на химически индуцированный канцерогенез толстой кишки у крыс.
Научно-практическое значение
Разработанный метод комплексной оценки влияния препаратов на KaHuqKireiie3 и старение позволяет решать широкий круг задач, связанных с биотестированием и предклиническим испытанием новых лекарственных средств.
Выявление геропротекторного эффекта и антиканцерогенных свойств эпиталона. дельтарана, диабенола и аквалена свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения этих химических препаратов в качестве средств профилактики рака и преждевременного старения.
Основные положения, выносимые на і л щиту
Разработанный метод комплексной оценки препаратов позволяет выявлять их модифицирующий эффект на моделях спонтанного и индуцировашюго канцерогенеза, а также охарактеризовать геропротекторные свойства этих препаратов в хронических опытах на мышах различных линий (аутбредных, инбредных, мутагггных и трансгенных).
Выявление антикаїщерогенньгх и геропротекторных свойств у некоторых гормональных препаратов (мелатонин), пептидных биорегуляторов (эпиталон), адаитогенов (дельтаран), антидиабетических средств (диабенол) и энтеросорбентов (аквален) свидетельствует о перспективности изучения представителей этих ірупи с целью разработки средств профилактики рака и преждевременного старения,
Действие исследованных препаратов на показатели старения (вес тела, поведенческие реакции, эстралыгую функцию, частоту хромосомных аберраций), а также канцерогенез может быть обусловлено их антиоксидантными свойствами, влиянием на экспрессию онкогенов, клеточную пролиферацию и апоптоз.
Эпидемиология опухолей у человека. Экспериментальные подходы к изучению факторов риска и путей профилактики рака
Рак является одним из наиболее распространенных заболеваний на планете. Заболеваемость злокачественными новообразованиями во всем мире неуклонно растет. По данным Международного агентства по изучению рака (МАИР), в 1990 году злокачественными опухолями заболело более 8 млн. человек. По сравнению с 1975 г количество заболевших возросло на 37%, что составляет 2,1% роста ежегодно (Parkin D.M., 1997). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2000 году в мире было зарегистрировано более 10 млн. человек, вновь заболевших раком (Parkin D.M. ct al., 2002). С учетом всех зарегистрированных случаев заболеваемости злокачественными новообразованиями за последние пять лет на планете в 2000 году проживало 22,4 млн. больных, а умерло от этих заболеваний 6,2 млн. человек (Parkin D.M. et al.,2002).
Россия no уровню заболеваемости злокачественными заболеваниями среди других стран мира занимает 16-е место. В 2О02 году в России было выявлено 453 256 новых случаев злокачественных новообразований. «Грубый» показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями на 100 000 населения России в 2002 году составил 317,2, а прирост за период 1900-2000 год - 16,4% (Чиссов В.И. (ред.) и др., 2004). В структуре смертности населения России злокачественные новообразования занимают 3-е место (12,5%) после болезней сердечно-сосудистой системы и травм. За период I992-200Z г смертность от злокачественных опухолей населения России возросла на 3,0% (Мераби-швили В.М., 2004).
В Санкт-Петербурге заболеваемость населения злокачественными новообразованиями за периоде 1990 по 2003 год увеличилась с 16,3 до 17,3 (абсолютное число в тыс.), причем у мужского населения за этот период увеличение количества заболевших.было несколько ниже (от 7,3 до 7,6), чем у женского населения (9,0 и 9,7) (Мерабишвили В.М., 2004а). Динамика смертности населения менялась таким образом: в 1990 году «грубый» показатель на 100 000 составил 266,1, а в 2002 - 278,6. У мужского населения смертность за этот период выросла с 285,0 до 291,8, у женского состава населения - с 250,5 до 267,8.
По данным на 2000 год, из общего количества населения, проживающего на планете, и у которого были обнаружены онкологические заболевания за последние 5 лет, 17,2% составляли больные с опухолями молочтгых желез, 10,6% - с заболеваниями рака толстой кишки (Parkin D.M. et al.,2002). Наиболее распространенным онкологическим заболеванием в мире является рак молочной железы у женщин, составляющий 21% по заболеваемости и 14% по смертности злокачественных опухолей. В 2000 голу это заболевание было обнаружено почти у 1млн человек, а в структуре злокачественных новообразований населения США, Западной Европы и России это заболевание составляет от 22% до 30% (Parkin-D.M.; et al.,2002). Прогнозируя рост заболеваемости раком молочной железы на планете к 2010 году, предполагается увеличение до 1,45 мл н.(Трапезников Н.Н., Аксель Е.М;, 2001). Лидирующее место по уровню заболеваемости раком молочной железы занимают США (9(},7%ооо,- мировой стандарт).и Уругвай (92,6%ооо), затем следуют страны Европы, а более низкие показатели характерны для сіран Азии. Большая распространенность этой локализации рака объясняется, возможно, тем, что показатели пятилетней выживаемости после установления диагноза весьма: высоки, а. в ряде стран величина этого показателя превышает 80% (Parkin D.M. et аЦ 2002).
Россня-по уровню заболеваемости раком молочной железы занимает в мире-промежуточное-ранговое место (38%ооо женского населения, мировой: стандарт) (Parkins D.M., 1997). За 20-летний период (1980-2000 гг.) заболеваемость повысилась почти на і 70% - с 22,6 до 38,3%ооо (Parkin D.M. et at., 2002). По данным на период до 2002 гада основной объем больных злокачественными новообразованиями в России формируется из пациентов, страдающих раком молочной железы (17,2%) (Старинский В;ВІ и др;, 2003). В структуре женской смертности от злокачественных новообразований также наибольший-удельный вес имеют злокачественные новообразования молочных желез - 16,7% (Чиссов-В: И.И лр.(ред. ),2004).
По структуре онкологической заболеваемости населения Санкт-Петербурга у мужчин первое место занимает рак легкого (19,2%), среди женского населения- рак молочной; железы (19,6%). В структуре смертности населения Санкт-Петербурга от злокачественных новообразований также, первое.: место занимает смертность, от рака легкого у мужчин-(25,4%), а у женщин - от рака;,молочной железы-(17,1%) (Мерабишвили В.М., 2004а). Помимо того, что в Санкт-Петербурге в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований рак молочной железы находится; на.первом;месте, по данным 1999 года отмечалась и высокая степень запущенности визуальной формы рака тгой; локализации (Ш: и IV стадии) - 44; 8% и 35,0% (Трапезников Н.Н., Аксель ЕМ;, 2001 ). Другим распространенным онкологическим заболеванием, частота которого: нарастает, является ракето лето й кишки (Coleman М.Р. et al., 1993). В 2000 году колоректаль-ным раком в мире заболело 945 тыс. человек, что составило 9% от общего числа всех за-региетрировашіьгх случаев заболевания злокачественными - новообразованиями,- а смертность составила 8% от числа всех умерших от онкологических заболеваний (Parkin IXM. et зі., 2002). В США по распространенности злокачественных заболеваний колоректальный-рак занимает в настоящее время іретье место по частоте развития новообразований и второе- после рака легкого, как основной причины смертности населения (Gwyn К., Sini-сгореКЛ.,2002).
В России в 1999 году рак толстой кишки (РТК) занимал четвертое, место по распространенности злокачественных новообразований у населения после рака, легко го, желудка и новообразований мочевыделительнои системы (Мартынкж В.В; и др., 2001), В: Санкт-Петербурге стандартизованный показатель смертности от РТК с 1070 г. по 1994 г. возрос более чем на 30% (Мсрабишвили В.М.., 1996), а в 2000 г. в: структу)е онкологических заболеваний колоректальпын рак составил 15% среди мужчин и 16% у женщин (Мартынюк В.В.- и др., 200 і). Необходимо отметить, что структура онкологической заболеваемости населения Санкт-Петербурга колоректальным раком в 2003 году по сравнению 2000 голому практически, не изменилась: у мужчин - 14,4%, у женщин - 16,2% (Мерабишвили В.Ml, 2004а).
Таким образом, наблюдаемая тенденция к увеличению частоты и распространенности заболеваемости злокачественными: новообразованиями, является; одной -из наиболее актуальных проблем в современной медицине, а разработка способовпрофилактики злокачественных новообразований и поиск препаратов, препятствующих развитию рака, можно считать однойкз основных задач противораковой борьбы. Подходы;к лечению и профилактике злокачественных заболеваний невозможны без понимания основных причин возникновения и развития опухолевого процесса.
К основным ттис логическим І факторам развития рака t относятся вредные факторы окружающей среды,, в г пер вую очередь, наличие канцерогенных агентов, ионизирующего излучения, вирусов; профессиональная деятельность человека, участие; в промышленном; производстве, где есть риск развития новообразований; образ жизни и особенности питания, вредные привычки, например, табакокурение, алкоголь и др: (Долл Р.\ Пито Р.1, 1984). Исследования по эпидемиологии рака, особенно те, которые разрабатываются под .эгидой. МАИР на І протяжении многих лет, свидетельствуют о том,- что,- большое значение имеют так называемые, факторы «стиля-жизни», в определение которых,входят известные мутагенные и канцерогенные вещества; а,также модифицирующие факторы (Turusov V, Мопesano R,, 1983).
Экспериментальные модели и методы изучения влияния модифицирующих факторов на канцерогенез и старение
Важный вклад в изучение механизмов развития рака внесли работы по модифицирующим факторам канцерогенеза, в том числе, антиканцерогенным.; Основой-для изучения эффекта антиканцерогенных веществ являются экспериментальные модели опухолей; индуцированных у животных химическими; канцерогенам и, поскольку они представляют собой мно го стадийный процесс развития новообразований: инициацию, промоцию и прогрессию (Александров В. А., Неспалов ВТ., 1997). В таких экспериментах обычно используют лабораторных грызунов — крыс, мышей, хомячков; реже - других животных. Модели экспериментальных опухолей, индуцируемых: у животных, отражают спектр тех новообразований, которые наиболее часто встречаются у человека - опухоли молочной железы, легких, толстой кишки и других органов:
Так, при использовании некоторых; полициклических ароматических; углеводородов— бенз(а)пирена (БП), MX; ДМБАбьшо показано, что одним из наиболее эффективных, методо в х индукции о пухол ей молочных желез; у мышей; может быть = введе ние МХ\ (Огт J.W., 1951; Squartiiii-F., Pingitore R., 1994).
В; опытах на крысах наиболее эффективной моделью я вилась, индукция рака молочной железы ДМ НА, в результате у животных развиваются злокачественные новообразования практически в 100% случаев (Welsch C.W., 1985; Турусов B.C., Кобляков, І986). Из различных линий крыс наиболее чувствительной к индукции опухолей молочных желе 1 (ОМЖ) являются животные линии Sprague-Dawley. Для индукции опухолей этой локализации также используют нитроюсоединения. Опухоли молочных желез, в основном, аденокарциномы развиваются уже через 12 мес, после введения;НММ (Russo J., Russo І.Н.,1987; Турусов B.C., Коблякон В.А.,1986). Инзрамаммарное введение НММ (5 введений 1 раз в неделю по 4 мг) вызывает развитие не только аденокарцином, но и фиброаденом молочных желе:) у крыс (Александров В. А., Беспалов В.Г., 1997),
Известным способом экспериментального получения опухолей молочных желез у мышей (Squartini К, Pingitore R:, 1994) и крыс (Noble RX., 1941; Furth J., Clifton K.H-, 1957) является систематическое введение в организм нормальных или кассированных животных больших доз гормональных препаратов.
Новообразования молочной железы вызывает также ионизирующее излучение, как у мышей (Squartini F., Pingitore R;, 1994), так и у крыс (Shellabarger C.J; et al., 1966).
Показана, и возможность индукции ОМЖ, биологическими агентами. Наиболее изучена роль вирусов в развитии опухолей молочтной железы у некоторых линий мышей. Так, при вскармливании мышат из нгакораковой линии самками из высокораковой линии по развитию ОМЖ наблюдалось резкое увеличение в последствии у выросших животных частоты опухолей молочных желез (Bittner J.J., 1936), Вызывавший этот феномен фактор получил название "фактор молока". Оказалось, что он обладает всеми свойствами вируса, который позже был назван "вирусом опухолей молочных желез мышей11 или MMTV (murine mammary tumor virus).
Среди новообразований других локализаций нужно отметить развитие у мышей линии А и в меньшей степени BALB/c с высокой частотой опухолей легких, возникающих под действием некоторых классов химических канцерогенных агентов (ПАУ, нитро-заминов, гидразинов) (Stewart B:W. et al., 1979).
Опухоли толстой кишки у крыс вызывали в 60-80% путем интраректальных введений НММ (5 введений 1 раз в педелю по 4 мг). Эта модель позволяет получить опухоли, в основном, аденокарциномы через 12 мес, (Александров В:А., Беспало» В.Г.,1997).
Другой известной моделью являются карциномы толстой кишки у крыс, индуцируемые 1,2-диметилгидразином (Pozharisski К.М. et al., 1979), Опухоли, возникающие у крыс, по своей морфологии сходны с аналогичными новообразованиями у человека (Poz-harissk К..М;, 1990). Однако, при использовании традиционного метода индукции рака толстой кишки (РТК) длительным подкожным (15 раз) введением ДМГ в дозе 21 мг/кг один раз в неделю, у крыс через 6 мес, опыта развиваются не только опухоли толстой кишки, но и новообразования тонкой кишки, наблюдаются патологические изменения печени.
Индуцированные модели опухолей хороши для шучения препаратов, обладающих потенциальными антиканцерогенными свойствами, поскольку в зависимости от поставленной задачи, их эффекты можно изучать на различных стадиях канцерогенеза. Для иіу-чения влияния искомого препарата на инициацию его можно вводить вместе с канцер ore--ном, если на стадию промоции, то после окончания введения канцерогена. Осуществляется введение препарата и на протяжении всего времени эксперимента; т.е. до, во время и после прекращения введения канцерогена; что позволит судить о его влиянии на весь процесс канцерогенеза;
Вес перечисленные модели шщуїшро ванно го канцерогенеза можно считать моноорганными, поскольку в результате введения І канцерогена происходит индукция раз вития -опухоли в основном одной локализации.
Преимуществом моделей индуцированных опухолей является стандартизация процесса канцерогенеза, возможность изучать эффект препарата на различные его стадии, а также.относительно небольшая длительность экспериментов на некоторых из них - 6-12 мес. Такие модели позволяют втечение короткого времени оценить изучаемый препзрат, в там числе геропротектор, на наличие у него антиканцерогенных или канцерогенных свойств. К имеющимся недостаткам подобных «быстрых» моделей относятся: во-первых, невозможность оценить отдаленный эффект изучаемого препарата;, во-вторых,нросле-дить его потенциальное влияние на продолжительность жизни;
Модели спонтанного канцерогенеза?или спонтанные опухоли животных; (Watten-berg U.W.,.1Q96) могут представлять собой, не которое преимущество перед индуцированными? моделями. Оценивая= все опухоли; которые развиваются у линейных животных, на протяжении всей жиши, принято называть их спонтанными; иными словами это новообразования, развившиеся без какого-либо специального воздействия экзогенного канцерогена (Лниснмов В.Н., 2003). Преимущество спонтанных моделей связано, прежде всего, с большей про до лжительностьш жиши животных. Введением исследуемого препарата наг протяжении всей жизни животных позволяет оценить его влияние не только на развитие -спонтанных опухолей; но-и оценить его эффект nas продолжительность жизни и/или на = время развития: опухолей; в первую очередь видимых (опухолей кожи; молочных желез, подкожных новообразований).
Среди таких моделей важноеместо занимают опухоли молочных желез у мышей, так называемых "высокораковых линий". Эти линии были созданы путем постоянного внутриродственного скрещивания мышей, у которых с высокой частотой возникали опу 27 холн молочных желез. Среди них наиболее часто исмолмуютея линии Л, СЗНЛ и др. В таких линиях опухоли молочных желеч вошикают в 70-90 % случаев, начиная с вочрастл 7-8 месяцев (Шабад Л.М. , 1967; Tunisov V.S., Mohr U.,1994). Из других вилов животных следует отметигь некоторые линии крыс, в частности, крыс линии Спрейг-Доули (TllniKOV V.S., Mohr U., 1990), а также собак некоторых пород, у которых часто возникают новообразования молочных желез (Znbezhinski М: Л. et al., 1997).
Опыты с мелатонином
Эффект мелатонина изучался на мышах SHR, СВА, HER-2/neu, SAM, а также на крысах L10.
Мелатонин мыши получали с питьевой водой в ночные часы в дозе 20 мг/л. Эта доза, и режим введения мелатонина были впервые предложены в работе Бартча и соавторов в 1992 r(Bartsch С. et al., 1992). Для сравнения в эксперименте нами была использована малая доза 2 мг/л. Мелатонин растворяли в нескольких каплях 96% этанола и добавляли в питьевую воду в соответствующих концентрациях. Все поилки, в которых находился мелатонин, сделаны из темного стекла. Свежий раствор мелатонина готовили каждые три дня. Все контрольные мыши получали питьевую воду с несколькими каплями этанола ( 0,004%). Все животные получали мелатонин курсами - 5 последовательных дней, один раз в месяц.
В опытах па мышах SHR самки в возрасте 3 мес. былирандомизировано разделены на зри группы: I) Контрольные мыши, получавшие водопроводную воду с растворенным этиловым спиртом (54 мыши). 2) Подопытные мыши, получавшие мелатонин в большой дозе 20 мг/л (54 мыши). 3) Подопытные мыши, получавшие мелатонин в малой дозе 2 мг/л (54 мыши). У мышей оценивали динамику массы тела, потребление корма, эстральный цикл, температуру тела, а также продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей.
По 4 мыши каждой группы были убиты в 12 мес. возрасте для опенки уровня хромосомных аббераций. С этой целью были убиты дополнительно также А интактныс мыши З мес. возраста. В опытах на мышах СВА самки в возрасте 6 мес. были рандомшировано разделены на две группы: 1) Контрольные мыши, получавшие 0,9% изотонический раствор натрия хлорида подкожно по 0,1 мл (60 мышей). 2) Подопытные мыши, получавшие мелатонин в дозе 20 мг/л (60 мышей).
У мышей оценивали динамику массы тела, потребление корма, эстралышй цикл, температуру тела, а также продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей. Кроме этих показателей, у мышей СВА изучали двигательную активность в тесте «открытое поле», мышечную силу и физическую утомляемость. В дополнительных опытах также изучали влияние мелатонина на интенсивность свободнорадикальных процессов. С этой целью использовали по 10 интактных животных и 10 мышей 6 мес, возраста, убитых через сутки после одного курса введения мелатонина в концентрации 20 мг/л.
Самки мышей HER.-2/neu в возрасте 2 мес. были рандомазировано разделены на две группы:
1) Контрольные мыши (интактные животные), получавшие водо про водную воду с растворенным этиловым спиртом (30 мышей).
2) Подопытные мыши, получавшие мелатонин в дозе 20 мг/л (30 мышей).
У мышей оценивали динамику массы тела, потребление корма, астральный никл, а также продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей.
Дополнительно была проведена оценка экспрессии онкогена HER.-2/neu в опухолях молочной железы у интактных мышей и животных, получавших мелатонин с питьевой водой с концешраиией 20 мг/л, убитых в возрасте 8 мес. (по 5 мышей).
В отдельном эксперименте у интактных животных, убитых в трехмесячном (7 мышей) и шестимесячном (10 мышей) возрасте, была проведена оценка интенсивности свободнорадикальных процессов в различных органах
В опытах с мелатонином у мышей SAM самки сублинии SAMP-1 в возрасте 1 мес. были рандомшировано разделены на 2 группы: 1) Интактный конгроль (3 1 мьпиь). 2) Подопытные мыши, получавшие мелатонин в дозе 20 мг/л (29 мышей).
Самки мышей сублинии SAMR-I в возрасте 2 мес. также были рандомизировано разделены на 2 группы: 1) Интактный контроль (М мышей).
2) Подопытные мыши, получавшие мелатонин в дозе 20 мг/л (15мышсй).
У мышей обеих сублиний оценивали динамику массы тела, ноіребление корма, эс-тральный цикл, температуру тела, а также продолжительность жшни и развигие спонтанных опухолей.
В опытах на крысах LIO исследовалось влияние мелатопина на канцерогенез толстой кишки, вызванный ДМГ. Были изучены различные схемы (Pozharisski К..М;, 1990; PozJiarisski К.М. et ai., 1979) еженедельного подкожного введения канцерогена ДМГ: 15 инъекций ДМГ в разовой дозе 21 мг/кг (в расчете на основание); 5 инъекций канцерогена в дозе 21 мг/кг.
Соответственно было проведено две серии экспериментов. В I серии 2 мес. самки крыс L10 были рандомгоировано разделены на две группы, каждой из которых ДМГ вводили 15-кратно один раз в неделю в дозе
21 мг/кг. 25 крыс 1-й группы дополнительным воздействиям не подвергались, а 23 крысы 2-й qiynnbt на следующий день после первой иньекции ДМГ качали получать мелатонин.
Во 11 серии 2 мес. самок крыс L10 рандомшированно разделили на две группы, каждой из которых ДМГ вводили 5-кратно один раз в неделю в дозе 21 мг/кг, 21 крыса 1-й группы дополнительным воздействиям не подвергалась, а 21 крыса 2-й группы на следующий день после первой инъекции ДМГ начала получать мелатонин.
Канцероген непосредственно перед введением растворяли в дистиллированной коде и нейтралиїовали бикарбонатом натрия до рН 7,0. Мелатонин крысы получали с питьевой водой в концентрации 20 мг/л в ночное время на протяжении всего эксперимента. У животных двух серий эксперимента оценивали динамику массы тела.
Все крысы были умерщвлены путем декапитации через 6 мес. после начала эксперимента для анализа интенсивности канцерогенеза.
В дополнительных опытах также изучали влияние мелатопина на интенсивность свободнорадикальных процессов. С этой целью использовали 30 крыс LIO 3 мес. возраста, которые были рандомизировано разделены на три группы. Крысы 1-й группы 5-кратно один раз в неделю получали подкожно по 0,5 мл 0,9% раствора NaCl (10 крыс). Животным 2-й и 3-й группы вводили 5-кратно ДМГ один раз в неделю в дозе 21 мг/кг. 10 крыс 2-й группы дополнительным воздействиям не подвергались, 10 крыс 3-й группы на следующий день после первой иньекции ДМГ начали получать мелатонин. Все животные были убиты через 6 мес, после начала эксперимента для изучения показателей свободі гора ди-кального окисления и ангиоксидакпюй системы.
Влияние мелатонина на канцерогенез кишечника у крыс, вызванный 1.2-дим етил гидр аз ином
Результаты опенки динамики массы тела мышей SAMP-1 в контрольной и пол-опытной группе представлены в таблице 25. Из таблицы видно, что у мышеи 1-й іруппьі с 2 мес. по 6 мес. возраст происходило постепенное нарастание массы тела, причем в 10 мес. возрасте этот.показатель резко увеличился (на 30%) по сравнению с 2 мес. возрастом, В 14 мес. вес тела был несколько меньше, чем в 10 мес, а по сравнению с 2 мес. мышами статистически достоверно больше. Ввозрасте 1,8 года масса тела животных была также достаточно высокой, по сравнению с молодыми мышами в начале эксперимента (р 0,001).
Аналогичная картина наблюдалась и у мышей 2-й группы: постепенное нарастание массы тела, начиная с 2 мес. возраста и до 6 мес, значительное увеличение - в 10 мсс. при сравнении с животными 2 мес. возраста и незначительное снижение веса тела в 14 мес. (табл. 25). В 22"мес. возрасте у подопытных самок отмечалась самая большая;масса тела, которая:при сравнениис молодыми мышами была статистически достоверно-больше. При сравнении массы тела контрольных и подопытных мышей видна.тенденция;в. увеличении этого показателя под воздействием мелатонина в 14-22 мес. возрасте.
Динамика количества поглощаемого корма животными обеих групп представлена в таблице 26, У мышей 1-й группы вплоть до 6 мес. возраста наблюдалось незначительное увеличение.количества потребляемого корма, в 10 мес. возрасте этот показатель увеличился при сравнении с 2 мес. мышами. В 14 мес. мъшш 1-й группы съедали столько же корма, сколько и в начале эксперимента, а к 22 мес. возрасту опять заметно увеличили потребление корма, по сравнению с 2 мес. возрастом (р 0,002).
У самок 2-й группы не удалось выявить какой-либо закономерности в возрастном потреблении корма, за исключением снижения этого показателя в 10 мес. возрасте, при сравнении с 2 мес. мышами. При сравнении животных 1-й и 2-й группы выявлены статистически достоверные различия в потреблении корма мышами в отдельные сроки экс не римента. Так, в 2 мес. и 14 мес. возрасте животные 2-й группы съедали больше корма, чем контрольные, а в 10 мес. и 22 мес. возрасте- меньше.
Таким образом, введение мелатонипа в различные возрастные периоды неоднозначно влияло на потребление корма самками мышей SAMP-1: увеличивая и уменьшая этот показатель.
Результаты исследования эстральной функции мышей 1-й и 2-й группы приведены в таблице 27, Длительность эстрального цикла (ЭЦ) мышей контрольной группы увеличивалась напротяжении от 5 до 11 мес. жизни, а затем - от 11 до 19 мес, несколько уменьшалась, практически до показателя длительности ЭЦ у 5 мес. животных. Статистически достоверно больше длительность ЭЦ бьша в 11 мес. и 14 мес. возрасте при сравнении с 5 мес. мышами. Относительное число коротких циклов ( 4 дней) с возрастом несколько уменьшалось: от 76% в 5 мес. возрасте до 56% в 14 мес. возрасте и 60% в 19 мес. При атом число длинньтх циклов с возрастом увеличивалось от 24% в 5 мес. до 40- 44% в 14-19 месяцев. С возрастом у контрольных мышей несколько снижалось количество животных с регулярными циклами от 100% до 86,7% (в 5 и 11 мес. соответственно), в 14 мес. этот показатель полностью восстанавливался до 100%, однако в 1,5 года мышей с регулярными циклами было всего 71%. Соответственно с возрастом изменялось количество мышей с нерегулярными циклами (с аюструсом): до 13% в 11 мес. и 28,6% в 19 мес.
У мышей, получавших МЛТ, в целом, наблюдалось возрастное увеличение длительности ЭЦ, за исключением только 14 мес. срока, когда этот показатель был практически равен таковому у 5 мес. животных. В П мес. и 19 мес. у мышей 2-й фуппы отмечались самые высокие показатели длительности ЭЦ, при сравнении с показателем у 5 мес. самок.
При сравнении длительности ЭЦ у животных 1-й и 2-й группы оказалось, что наблюдались статистически достоверные различия в 11 мес. и 19 мес, когда этот показатель был больше у подопытных животных.
Относительное число коротких циклов ( 4 дней) с возрастом у мышей 2-й группы колебалось, как в сторону уменьшения, так и увеличения: наибольшие показатели 64% и 70% отмечались в 5 мес. и 8 мес, а наименьшие 45% и 43% - в 11 мес. и 19 мсс. возрасте. При этом также неравномерно происходило возрастное изменение числа длинных циклов: наименьший показатель 30% был в 8 мес, а наибольший — 57% в 19 мес. При сравнении подопытных животных с мышами 1-й группы существенных различий в соотношении коротких и длинных ЭЦ не наблюдалось (табл.27).
До 14 мес. возраста у мышей 2-й іруппьі не наблюдалось значительного изменения частоты регулярных циклов (93-100%), однако, у старых мышей этот показатель снижался до 75%. Соответственно возрастала частота нерегулярных циклов: у мышей в 19 мес. возрасте этот показатель составил 25%. При сравнении подопытных животных с контрольными мышами не наблюдалось существенных различий по числу регулярных и нерегулярных циклов.
Таким-образом, если судить но длительности ЭЦ у мышей SAMP-і, получавших МЛТ, отмечалось ускорение возрастных изменений эстралыюй функции, хотя в целом значительных нарушений этой функции выявить не удалось.
У мышей 1-й группы с возрастом происходили волнообразные изменения температуры. Отмечено снижение средней темлературы тела в возрасте 11 и 19 мес. при сравнении с 8 мес. мышами (табл. 28), В 14 мес. этот показатель был таким же как и у 8 мес. животных. При изучении температуры тела в отдельные фазы ЭЦ оказалось, что тот показатель был значительно снижен в фазу диэструса в И и 19 мес. при сравнении с температурой тела мышей в фазу диэструса в 8 мес. Отмечено снижение средней температуры тела мышей контрольной группы в 11 мес. в фазы проэструса и метаэструса ігри сравнении с 8 мсс. животными.
