Содержание к диссертации
Введение
Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
I.I. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА 8
I.I.I. Основные компоненты эукариотического хроматина 8
1. 1.2. Нуклеосомная организация хроматина 12
1,1.3. Нуклеомерный, или супербидный уровень организации хроматина 14
1.1.4. Высшие уровни организации хроматина 16
I.I.5. Структура транскршщионно-активного хроматина 22
1.2. СТРУКТУРА ТРАНСКРИПЦИОННЫХ КОЖЛЕКСОВ АКТИВНЫХ ГЕ
НОВ ЭУКАРИОТ 25
1.2.1. Строение транскрипционных комплексов рибосом-ных и нерибосомных генов эукариот 25
1.2.2. Структура боковых РНП-фибрилл 30
1.2.3. Регуляция активности синтеза в рибосомных генах эукариот...ЗІ
1.3. СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ПРОСТЕЙШИХ 32
1.4. БИОЛОГИЯ ИНФУЗОРИИ BUKSARIA TEUNCATELLA 36
1.5. ДАННЫЕ О СТРУКТУРЕ ХРОМАТИНА ХРОНУКЛЕУСА ИНФУЗОРИИ BUKSARIA TEUNCATELLA 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
Глава III ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ХРОМАТИНА В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И РОСТА ИНФУЗОРИЙ ПОСЛЕ ДЕЛЕНИЯ
3.1. Структурная организация хроматина макронуклеуса Bursaria truncatella в разные сроки после деления. ..48
3.2. Особенности строения транскрипционных комплексов нерибосомных генов и необычных транскрипционных комплексов 65
Глава ІV СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЛЬЮОК НЕАКТИВНОГО ХРОМАТИНА МАКРОНУКЛЕУСА BUKSARIA TEUNCATELLA 79
Глава V СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ХРОНУКЛЕУСА В ЦИСТАХ ПОКОЯ И
В ПРОЦЕССЕ ЭКСЦИСТИРОВАНИЯ 95
5.1. Организация хроматина макронуклеуса цист покоя 95
5.2. Структурные изменения хроматина макронуклеуса Bursaria truncatella при эксцистировании 109
ВЫВОДЫ 119
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122
- Основные компоненты эукариотического хроматина
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Структурная организация хроматина макронуклеуса Bursaria truncatella в разные сроки после деления.
- СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЛЬЮОК НЕАКТИВНОГО ХРОМАТИНА МАКРОНУКЛЕУСА BUKSARIA TEUNCATELLA
- Организация хроматина макронуклеуса цист покоя
Введение к работе
Строение, организация и функционирование хромосомного аппарата эукариот является одной из наиболее актуальных проблем молекулярной биологии. Основная структура наследственного аппарата клетки - хромосома - представляет собой сложный нуклеопротеидный комплекс, в котором ДНК взаимодействует со специальными белками, обеспечивающими её компактиза-цию. Высокая степень компактизации ДНК вызвана необходимостью хранения большого количества генетической информации, часть которой в данный момент в клетке может не реализоваться. Одним из основных направлений в изучении организации и функционирования хроматина, привлекающих внимание многих исследователей, является выяснение способов хранения генетической информации и изучение пространственной и структурной организации генетического материала. Тем не менее остаётся невыясненным ряд вопросов, касающихся механизмов перехода хроматина от неактивного компактного к активному диспергированному состоянию.
Изучение структуры хроматина на высших уровнях организации в различных функциональных состояниях является весьма сложной экспериментальной задачей, в решении которой немаловажную роль играет выбор объекта. Bursaria truncatella как объект для таких исследований имеет ряд важных преимуществ. Во-первых, её соматическое ядро - макронуклеус - имеет большие размеры /до 2 мм в длину/ и содержит достаточное количество материала для обеспечения оптимальной концентрации хроматина на электронномикроскопическом препарате, приготовленном по методу Миллера, что позволяет изучать структуру хроматина выделенного из одиночного ядра. Во-вторых, изменения, которые претерпевает макронуклеус бурсарии в процессе жизнедеятельности летки достаточно растянуты во времени, что даёт возможность выделить и исследовать ядро на любой стадии жизненного цикла. Изучение индивидуальных ядер позволяет избежать проблем, связанных с синхронизацией ядерного материала. Благодаря этому, удаётся выявить характерные структурные особенности хроматина макронуклеуса бурсарии для каждой стадии и оценить соотношение тех или иных структур на разных стадиях жизненного цикла.
Одна из задач настоящей работы состояла в изучении структурных изменений хроматина в процессе жизнедеятельности клеток. Для этой цели электронномикроскопическими и авторадиографическими методами изучали структурную организацию хроматина макронуклеуса В. truncatella в разные сроки после деления, на стадии цисты покоя и при эксцистировании. Все эти чётко идентифицируемые стадии характеризуются различными соотношениями диспергированного транскрипционно-активного и компактного неактивного хроматина.
Большое внимание уделено изучению структуры транскрипционно-активного хроматина, а именно изучению транскрипционных комплексов работающих генов разных типов на разных этапах роста и дифференцировки инфузории после деления и в процессе эксцистирования.
Важная задача настоящей работы состояла в выяснении принципа упаковки нуклеосомной и наднуклеосомной фибрилл хроматина в компактные структуры более высокого порядка. Проведённые исследования позволили установить, что хромати-новые глыбки неактивного хроматина макронуклеуса цист покоя и инфузорий, закончивших рост и дифференцировку, имеют пе- тельную организацию, обеспечивающую возможность избирательной декомпактизации отдельных участков генома при его функционировании.
Важное место в проводившихся исследованиях занимало решение методических задач, таких как разработка методов выделения индивидуального ядра, выявление внутренней структуры хроматиновых глыбок методом негативного контрастирования и разработка приёмов диспергирования генетического материала для приготовления препаратов по методу Миллера. Разработанные при выполнении настоящей работы методические подходы могут быть использованы в исследованиях структурной организации хроматина.
Список сокращений, используемых в диссертации
Ма - макронуклеус
Ми - микронуклеус
ТК - транскрипционный комплекс
НТК - необычный транскрипционный комплекс
НЕБ - негистоновые белки
НМС-белки - белки группы высокой подвижности
ДНП - дезоксирибонуклеопротеид
РНП - рибонуклеопротеид
РНП-фибриллы - рибонуклеопротеидные фибриллы
Основные компоненты эукариотического хроматина
Биохимические исследования показали, что основными компонентами хроматина являются ДНК, гистоны, негистоновые белки, РНК и липиды, находящиеся в весовом соотношении 1:1:(0,2-1,5): (0,1-0,15):(0,01-0,03) /58, 61, 180/.
ДНК хроматина. ДНК является непосредственным носителем генетической информации в клетке. Её содержание в очищенных препаратах интерфазных хромосом /хроматине/ составляет 30-40% . Многочисленные данные рентгеновского анализа, тепловой денатурации, оптических методов и другие свидетельствуют о том, что ДНК в составе хроматина представляет собой двуспиральную молекулу /6, 27, 62, 73/. В настоящее время общепризнано, что в каждой хромосоме содержится одна молекула ДНК /43/, хотя некоторые исследователи предполагают существование внутрихромосом-ных сшивок молекул ДНК белковой илилипидной природы /67, 26/.
В геноме эукариот содержится значительно больше ДНК, чем необходимо для кодирования аминокислотной последовательности всех белков, которые способна синтезировать клетка. Значительная часть ДНК генома эукариот представлена повторяющимися нук-леотидными последовательностями. Часть этих последовательностей кодирует, например, рРНК,tPHK, мРНК гистонов /46/, функции других в настоящее время до конца не выяснены.
Значительно большее количество ДНК в клетке эукариот, по сравнению с прокариотами, предполагает существование сложной специфической организации её внутри ядра. В основе этой организации лежит взаимодействие ДНК с внутриядерными белками.
Белки хроматина можно разделить на две большие группы, отличающиеся по своим физико-химическим свойствам и функциям:
Гистоны - это группа сильноосновных низкомолекулярных белков, экстрагируемых из хроматина разбавленными кислотами при рН 0,3-0,9. Гистоны являются главными структурными белками хроматина /73, 134/. Взаимодействие гистонов с ДНК обеспечивает образование упорядоченной цепи хромосомных субъединиц-нуклеосом. Обычно различают 5 основных фракций гистонов, отличающихся по аминокислотному составу и молекулярному весу: HI, Н2а, Н2в, НЗ, Н4. Все эти фракции за исключением гистона HI, содержание которого примерно вдвое меньше, чем других гистонов, содержатся в хроматине в эквимолярном количестве /61, 91/.
Гистоны обнаружены практически во всех эукариотических клетках /61, 91/. Лишь в половых клетках позвоночных часть гистонов замещена на сильно основные белки-протамины /61/, а также дополнительные гистоновые фракции /119/.
Материалы и методы исследований
Исследование проводили на штамме Bursaria truncate11а , полученном из Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии АН СССР. Клетки выращивали в кипячёной водопроводной воде при температуре 8-ЮС в чашках Коха. Кормом для бурса-рий служили Paramecium aurelia , выращенные на салатной среде, заражённой Aerobacter aerogenes . Перед внесением в культуру бурсарий парамеций отмывали от среды / 22, 23, 25/
Индивидуальные делящиеся клетки бурсарий отсаживали в микроаквариумы, фиксировали время расхождения дочерних клеток, после чего выделяли из них макронуклеусы через 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; ... 20-24 час. после деления.
Цисты бурсарий получали при перенесении голодающих вегетативных особей в более низкие температуры / 4С/. Эксцис-тирование стимулировали добавлением 3-4 капель аминопептида на 10 мл культуральной среды /23/. Макронуклеусы из эксцисти-рованных особей выделяли сразу после выхода клеток из оболочки цист, когда клетки ещё имеют неправильную форму.
Выделение ядер и хроматина. Макронуклеусы из клеток и эксцистированных особей выделяли под бинокулярной лупой вручную в растворе, содержащем 0,5/Ь Нонидет КР-40 или 0,5$ Тритон Х-100 / Serva" , ФРГ/. Макронуклеусы из цист выделяли в 1% Нонидете КР-40 или 1% Тритоне Х-100 / "Serva" , ФРГ/. рН всех растворов доводили с помощью 0,1 М боратного буфера /рН 8,7-9,0/. Выделенное ядро промывали несколько раз в 0,1 мМ боратном буфере для удаления остатков цитоплазмы и переносили в каплю того же буфера для лизиса ядер. После разрушения ядерной оболочки либо сразу готовили электронномикроскопичес-кий препарат по методу Миллера /130, 131/, либо предварительно материал диспергировали в 0,1 мМ боратном буфере /рН 8,7/ в течение 5; 10; 30 мин; I; 1,5; 2; 2,5; 5 час; ночи при 0-4С, как описано у Центграфа с соавт./201/.
Метод Миллера /130, 131/. Исследуемый материал наслаивали на раствор, содержащий 4% формальдегид и 0,1 М сахарозу /рН 8,7/, и центрифугировали 10 мин. при 5 000 об/мин. в микроячейке, на дно которой помещали сеточку, покрытую свежеионизи-рованной угольно-формваровой плёнкой-подложкой. Сеточки промывали 0,4$ раствором Photoflo-Kodak / Коdak-Pathe , Франция/, рН 7-8, и высушивали на воздухе.
Структурная организация хроматина макронуклеуса Bursaria truncatella в разные сроки после деления
Ранее рядом авторов при исследованиях Ма в.truncatella на светооптическом уровне и при электронномикроскопических исследованиях ультратонких срезов было показано, что структура хроматина Ма значительно изменяется не только на разных стадиях клеточного цикла, но и во время интерфазы /22, 23, 146, 159/. Во время дифференцировки и роста клеток В. truncatella на протяжении нескольких часов после вегетативного деления Ма имеет диффузную окраску по Фёльгену, а на ультратонких срезах значительная часть хроматина представлена фибриллярным материалом, тогда как у особей, закончивших рост и дифференцировку, по всей площади Ма выявляется характерная для Ма инфузории глыбчатая структура хроматина.
Наши исследования показали, что в период от 0,5 до 1,5 часа после деления, т. е. во время интенсивного роста и диф-ференцировки клеток инфузорий, основная часть хроматина Ма находится в декомпактизованном состоянии и имеет вид рыхлых скоплений переплетающихся нитей хроматина, от которых отходят о боковые фибриллы толщиной 200-250 А /Рис. 5/. По строению боковых фибрилл, а также по характеру и плотности расположения их вдоль осевой фибриллы хроматина такие структуры напоминают ТК нерибосомных генов у других видов эукариот /71, 129/. Нити хроматина с отходящими от них боковыми фибриллами могут располагаться как поодиночке, так и в виде пучков, состоящих из нескольких параллельно идущих нитей / Рис. 6/.
class3 СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ХРОНУКЛЕУСА В ЦИСТАХ ПОКОЯ И
В ПРОЦЕССЕ ЭКСЦИСТИРОВАНИЯ class3
Структурная организация гльюок неактивного хроматина макронуклеуса buksaria teuncatella
Как было ранее показано с помощью световой микроскопии и на ультратонких срезах целых инфузорий, организация хроматина Ма в хроматиновые глыбки размером 50-200 нм характерна для многих инфузорий / 17, 21-23/.
На рисунке 27 представлен ультратонкий срез выделенного Ма в. truncateНа . Как на препаратах, фиксированных глютар-альдегидом, так и на препаратах, фиксированных тетраокисью осмия, видно, что хроматин Ма организован в электронно-плотные хроматиновые глыбки размером 100-200 нм, соединённые фибриллами, что совпадает с данными, полученными ранее на ультратонких срезах целых клеток В. truncatella /23/.
Авторадиографические исследования /глава III/ показали, что такая глыбчатая организация типична только для хроматина Ма, находящегося в неактивном состоянии. В связи с этим следует отметить, что в неактивном хроматине из ядер спермы морского ежа /201/ и ядер ооцитов тритона /165, 166/ также были обнаружены хроматиновые гранулы размером 40-60 юл.
Таким образом, организация хроматина в хроматиновые глыбки /или хроматиновые гранулы/ размером 40-200 нм, по-видимому, представляет достаточно распространённый тип организации неактивного хроматина.
Организация хроматина макронуклеуса цист покоя
При изучении структуры хроматина Ма цист покоя в. trun-catelia методом Миллера /Рис.38/ обнаружено, что практически весь хроматин Ма организован в плотные хроматиновые глыбки размером 100-300 нм /Рис. 39/. В таких препаратах не удавалось обнаружить ни декомпактизованного хроматина, ни структур, напоминающих транскрипционные комплексы работающих, генов, описанных в главе III.
На рисунке 38 хорошо видно, что хроматиновые глыбки, представляющие собой плотные к электронам структуры, обычно располагаются близко друг к другу, но иногда можно видеть, что они соединены хроматиновыми тяжами. На препаратах хроматина, контрастированных напылением металлом, поверхность хроматиновых глыбок выглядит бугристой, но внутреннее строение их не выявляется. Внутреннюю структуру хроматиновых глыбок удалось разрешить только с применением метода негативного контрастирования 1% раствором фосфорновольфрамовой кислоты, доведённым 1N йаОН до рН 7,0. На рисунке 40 хорошо видно, что хроматиновая глыбка состоит из плотно упакованных субъ о единиц диаметром 70-80 А, соответствующих по размерам нук леосомам при негативном контрастировании /194/.
