Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Введение 9
1.1 Онкогены и опухолевые супрессоры 11
1.2 р53 - центральный компонент сигнальных путей, ограничивающих злокачественный рост клеток
1.2.1 Последствия инактивации гена р53 12
1.2.2 Биологическая роль гена р53 13
1.2.3 Функции, строение молекулы и активация белка р53 15
1.2.4 Транскрипционные мишени белка р53 19
1.2.5 Латентное и активированное состояние белка р53 22
1.2.6 Активация р53 в ответ на стрессы 25
1.3 Белки, физически взаимодействующие с белком р53 и , модулирующие его функции
1.3.1 HIF-1-зависимый сигнальный путь 30
1.3.1.1 Структура белка HIF-la - главного регулятора кислородного 30 гомеостаза
1.3.1.2 Ог-зависимая регуляция активности HIF-la 32
1.3.1.3 Транскрипционные мишени HIF-1 33
1.3.1.4 Роль р53 в ответе клетки на действие гипоксии 35
1.3.1.5 Роль р53 в регуляции активности HIF-1 37
1.3.2 HSF-зависимый сигнальный путь и белки теплового шока 38
1.3.2.1 Регуляция экспрессии HSP 40
1.3.2.2 Локализация HSP 42
1.3.2.3 Экспрессия HSP в раковых клетках 42
1.3.2.4 HSP и р53 43
1.3.2.5 Возможные механизмы стабилизации белка р53 43
1.3.2.6 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с HSP90 44
1.3.2.7 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с HSP70 47
1.3.2.8 Взаимодействие р53 с морталинами 49
1.4 Репортерные конструкции для изучения динамики активности белков различных сигнальных путей
1.4.1 Технология репортерных генов 51
1.4.2 Репортерные гены 51
1.4.3 Применение репортерной технологии 55
1.4.3.1 Введение экзогенного генетического материала в клетки и экспрессия генов
1.4.3.1.1 Анализ промоторов 55
1.4.3.1.2 Мониторинг эффективности трансфекции (доставки трансгенов внутрь клеток)
1.4.3.1.3 Визуализация генной экспрессии 56
1.4.3.2 Биологические скрининги и открытие химических соединений 57
1.4.3.2.1 Характеристика рецепторов и их лигандов 58
1.4.3.2.2 Изучение сигнальных путей 58
1.4.3.2.3 Применение репортерной технологии в токсикологии 59
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61
II.1 Клеточные линии и их культивирование 61
П.2 Обработки клеточных линий химическими соединениями и тепловым шоком
11.3 Векторы и плазмидные конструкции 63
И.3.1 HIF-la-чувствительные репортерные плазмиды 63
Н.3.2 HSF-1-чувствительные репортерные плазмиды 65
Н.3.3 р53-чувствительные репортерные плазмиды 66
ІІ.3.4 Плазмиды, экспрессирующие siRNA 67
Н.3.5 Получение конструкций, экспрессирующих р53 с FLAG последовательностью аминокислот на С или N конце
11.4 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой, 69 щелочной фосфатазой и ферментом Кленова
11.5 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 69
11.6 Лигирование фрагментов ДНК 69
И.7 Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 69
ІІ.8 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 70
П.9 Получение ретровирусных и лентивирусных вирионов заражение ими клеток-мишеней и отбор инфицированных клеток на антибиотике
11.10 Окраска клеток на р-галактозидазу 71
11.10.1 X-gal окрашивание 71
11.10.2 ONPG окрашивание 71
11.11 Вестерн-анализ 72
11.12 Иммунопреципитация 75
11.13 Выделение ядерных и цитоплазматических экстрактов 75
11.14 Иммунофлуоресценция 76
11.15 Коиммунофлуоресценция 76
11.16 Определение субклеточной локализации белка 77
11.17 Норзерн-анализ 77
11.18 ОТ-ПЦР-анализ и секвенирование кДНК р53 78
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 80
Ш.1 Вирусные системы экспрессии генов в культивируемых клетках млекопитающих
Ш.2 Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белка р53
Ш.З Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белков HIF-1 и HSF-1
Ш.4 Определение субклеточной локализации и уровня экспрессии белка р53 в различных опухолевых линиях клеток
Ш.5 Выяснение природы гранулярного цитоплазматического окрашивания антителами DO-1 в некоторых меланомных клеточных линиях
Ш.6 Измерение транскрипционной активности белка р53 в различных клеточных линиях в ответ на обработку клеток рядом химических соединений
Ш.7 Определение степени р53-зависимости действия камптотецина на экспрессию генов-мишеней белка р53
IV. ВЫВОДЫ 117
V. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
БЛАГОДАРНОСТИ 149
Введение к работе
Ген р53 является центральным компонентом механизма, обеспечивающего удаление из организма патологических клеток. Многочисленные сигнальные пути отслеживают состояние клетки и в случае возникновения повреждений или сбоев, угрожающих приобретением наследуемых изменений генетического материала, вызывают активацию белка р53. В результате клетки либо временно задерживаются в сверочных точках клеточного цикла, где они имеют возможность исправить возникшие повреждения в процессе репарации ДНК, либо полностью выключаются из дальнейших делений, подвергаясь клеточной смерти по типу апоптоза или клеточному старению, ведущему в конечном итоге к смерти по типу некроза. Утрата гена р53 приводит к накоплению генетических повреждений, приводящих к потере контроля над отдельными клетками со стороны целого организма, злокачественному росту и смерти.
Интактность р53-зависимого сигнального пути важна при использовании химио- и радиотерапии для лечения раковых заболеваний. Многие химические соединения, используемые для предотвращения злокачественного роста опухолей, приводят к повреждениям ДНК, которые активируют белок р53. Известно, что р53 может активироваться в ответ на целый ряд стрессовых воздействий, включающих гипоксию (кислородное голодание) и тепловой шок. Также известна связь р53-зависимого сигнального пути с такими путями стрессового ответа как сигнальные пути, центральными компонентами которых являются индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1) и фактор теплового шока 1 (HSF-1). Таким образом, изучение взаимосвязей между р53, HIF-1 и HSF-1 активностями может пролить свет на многие аспекты клеточного реагирования на стресс, особенно в контексте опухолевого роста. Изучение механизмов клеточного реагирования на вышеперечисленные стрессы является областью активных научных исследований и обещает возникновение в будущем новых подходов к предотвращению и лечению рака и многих других патологических заболеваний.
Основной целью данной работы являлось исследование состояния р53-зависимого сигнального пути в клеточных линиях различного происхождения.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
1. Создание дизайна индивидуальных для каждого транскрипционного фактора (р53, HIF-1 и HSF-1) репортерных кассет, включающих в себя а) множественные палиндромные последовательности, узнаваемые и связываемые данными транскрипционными факторами; б) минимальный промотор гена белка теплового шока или минимальный ранний промотор из генома цитомегаловируса; в) репортерный ген зеленого флуоресцентного белка или р-галактозидазы.
2. Получение и оптимизация работы репортерных кассет в ретровирусной и лентивирусной системах доставки репортера. Проверка адекватности количественной оценки активностей белков р53 и HIF-1 по экспрессии репортерного белка в различных клеточных системах.
3. Анализ уровня экспрессии и локализации белка р53 в ряде опухолевых клеточных линий, большинство из которых характеризуется экспрессией гена р53 дикого типа.
4. Проверка гипотезы о заякоривании белка р53 в цитолазме ряда меланомных клеточных линий.
5. Изучение влияния различных стрессовых воздействий, главным образом обработок повреждающими ДНК агентами, на транскрипционную функцию белка р53 в меланомных клеточных линиях с различным статусом гена р53 по сравнению с нормальными меланоцитами.
