Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Семейство Filoviridae: общие сведения и классификация 11
1.2 Клиническая и патогенетическая характеристика геморрагической лихорадки Эбола 12
1.3 Строение генома вируса Эбола 15
1.4 Генетическое разнообразие, происхождение и эволюция вируса Эбола 17
1.5 Структура вириона и свойства белков вируса Эбола 25
1.6 Эпидемиологическая характеристика геморрагической лихорадки Эбола. Природные резервуары и переносчики 43
1.7 Инфекция Эбола у лабораторных животных и получение адаптированных штаммов 46
Заключение по обзору литературы 50
2 Материалы и методы 52
2.1 Материалы 52
2.2 Методы 54
2.2.1 Определение биологического титра и клонирование вируса Эбола 54
2.2.2 Пассажи вируса Эбола на морских свинках 55
2.2.3 Гематологические тесты 56
2.2.4 Оценка фагоцитоза нейтрофилами крови 57
2.2.5 Статистическая обработка данных 58
2.2.6 Выделение суммарной РНК 58
2.2.7 Проведение реакции РНК-лигирования 59
2.2.8 Проведение реакции обратной транскрипции 59
2.2.9 Амплификация фрагментов генома вируса Эбола методом ПЦР 60
2.2.10 Определение содержания геномной РНК вируса Эбола в культуральной жидкости методом двухраундовой ОТ-ПЦР 60
2.2.11 Очистка продуктов амплификации после проведения ПЦР 61
2.2.12 Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК 62
2.2.13 Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 62
3 Результаты и обсуждение 65
3.1 Адаптация вируса Эбола к морским свинкам 65
3.1.1 Клонирование вируса Эбола 65
3.1.2 Пассажи клона вируса Эбола на морских свинках 67
3.2 Генетический анализ клона вируса Эбола preGPA-clone и варианта GPA-P7 79
3.2.1 Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения полноразмерных последовательностей генома вируса Эбола 79
3.2.2 Генетический анализ клона вируса Эбола preGPA-clone 83
3.2.2.1 Определение полной последовательности н.о. геномной РНК клона-
предшественника адаптированного к морским свинкам вируса Эбола
(preGPA-clone) 83
3.2.2.2 Анализ нуклеотидной последовательности генома клона preGPA-clone 84
3.2.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей белков клона preGPA-clone 89
3.2.3 Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7 98
3.2.3.1 Определение полной последовательности н.о. геномной РНК
адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола (GPA-P7) 98
3.2.3.2 Анализ нуклеотидной последовательности генома варианта GPA-P7 100
3.2.3.3 Анализ аминокислотных последовательностей белков варианта GPA-P7 102
3.3 Анализ генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам 116
4 Заключение 134
Выводы 138
Список литературы
- Клиническая и патогенетическая характеристика геморрагической лихорадки Эбола
- Определение биологического титра и клонирование вируса Эбола
- Пассажи клона вируса Эбола на морских свинках
- Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7
Введение к работе
Вирус Эбола (ВЭ) - это общее название группы вирусов, принадлежащих к роду Ebolavirus семейства Filoviridae. ВЭ бьш впервые выделен в 1976 году, когда одновременно на юге Судана и на севере Заира (Демократической Республики Конго) были зафиксированы первые эпидемические вспышки геморрагической лихорадки Эбола (Jonhson К.М., et al., 1977). На сегодняшний день род Ebolavirus, объединяет пять выделенных в различное время вида ВЭ: Zaire ebolavirus (ВЭ-Заир), Sudan ebolavirus (ВЭ-Судан), Ivory Coast ebolavirus (ВЭ-Берег Слоновой Кости), Reston ebolavirus (ВЭ-Рестон), Bundibugyo ebolavirus (ВЭ-Бундибугио).
В Центральноафриканском регионе периодически регистрируются вспышки лихорадки Эбола, уровни летальности при которых значительно варьируют ( 103/en/index 1 .html). Средства специфической терапии и профилактики лихорадки Эбола в настоящее время отсутствуют. Наиболее тяжелые случаи заболевания с высокой вероятностью летального исхода (до 88%), как правило, ассоциированы с ВЭ-Заир, в то время как заболевание, ассоциированное с ВЭ-Судан, характеризуется более низким процентом летальности (до 65%). ВЭ-Рестон, единственный азиатский вид ВЭ, будучи высоковирулентным для приматов, не проявляет патогенности для человека (Peters, С. et al., 1994; Feldmann, Н. et al., 1996).
Еще на начальных этапах изучения филовирусных геморрагических лихорадок возник вопрос о выявлении характерных особенностей (факторов), присущих вирусным штаммам, детерминирующих форму (от бессимптомной до острой) и клинический исход вызываемого ими заболевания. Знания о факторах патогенности позволило бы выявить ключевые стадии патогенеза, определяющие исход лихорадки Эбола, прогнозировать вероятный исход заболевания и с учетом данного прогноза выработать эффективные
методы лечения. Кроме того, знания о факторах патогенности применимы в работах по созданию вакцинных и терапевтических препаратов.
В результате первых работ, не включающих генетический анализ ВЭ, пониженную вирулентность для человека ВЭ-Судан по сравнению с ВЭ-Заир связывали с обнаружением большого количества дефектных вирусных частиц при его размножении в культуре клеток и в организме хозяина (Ellis D.S. et al., 1978; Ellis D.S. et al., 1979; Bowen E.T. et al., 1980; McCormick J.B. et al., 1983). Позже были определены нуклеотидные последовательности геномов ВЭ-Заир, ВЭ-Судан и ВЭ-Рестон. Высокие уровни различий между геномами ВЭ (межвидовые различия при попарном сравнении составляли около 40%) не позволили связать конкретные особенности генетической структуры с патогенными свойствами ВЭ. Дальнейшее изучение генетического разнообразия ВЭ, частичное определение нуклеотидных последовательностей геномов штаммов и изолятов, выделенных в течение одной вспышки (в Габоне в 1996 г.) от больных с различными формами лихорадки Эбола (от бессимптомной до тяжелой, в том числе, закончившейся летально), также не привели к выявлению специфических генетических характеристик вируса, ассоциированных с той или иной формой лихорадки Эбола (Leroy Е. et al., 2002).
Было отмечено, что природные высоковирулентные для человека изоляты ВЭ проявляют низкую вирулентность для мышей и морских свинок (van der Groen G. et al., 1979; Bowen E.T. et al., 1980). Наблюдения, сделанные при попытках создания лабораторной модели для изучения геморрагической лихорадки Эбола, показали, что в процессе последовательных пассажей ВЭ на животных его вирулентность может возрастать. Данное явление было названо адаптацией ВЭ к новому хозяину. Экспериментальный подход на основе адаптации создает удобную модель для изучения изменяющихся патогенных свойств ВЭ.
С использованием данного подхода в различных лабораториях на основе ВЭ
штамма Mayinga были получены несколько адаптированных к мышам и морским свинкам
вариантов и штаммов ВЭ (Чепурнов А.А., и др., 1995; Bray М. et al., 1996; Ryabchikova Е., et al. 1996; Conolly B.M et al., 1999). В результате определения нуклеотидных последовательностей геномов двух адаптированных штаммов ВЭ: для мышей (штамм MA) (Hart М.К., 2003) и морских свинок (штамм 8МС) (Volchkov V. et al., 2000), был выявлен ряд нуклеотидных замен (как значимых, так и синонимичных) по сравнению с геномом штамма Mayinga, которые затрагивали большую часть вирусных генов. Следовательно, для выявления генов и мутаций, потенциально ассоциированных с патогенностью, вновь потребовались более детальные эксперименты. С использованием методов обратной генетики было показано, что рост патогенности ВЭ для мышей обусловлен появлением пары точечных мутаций в генах NP и VP24 (Ebihara et al., 2006). Также было показано, что в сочетании с ними точечные мутации в генах VP35 и L могут усиливать патогенные свойства ВЭ (Ebihara et al., 2006).
Изучение изменчивости вирусного генома, сопровождающей его адаптацию к морским свинкам, и возможное выявление генов и мутаций, ассоциированных с ростом вирулентности ВЭ для данного вида лабораторных животных, позволило бы подтвердить значимость генов NP и VP24 для изменения патогенности ВЭ, либо выявить иные возможные механизмы изменения его вирулентности. С этой целью нами был выбран подход поэтапной генетической характеристики вариантов ВЭ, полученных при проведении последовательных селективных пассажей на морских свинках полученного на культуре клеток клона ВЭ.
Целью настоящего исследования являлось изучение генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам. Задачами настоящего исследования являлись:
1. Адаптация вируса Эбола к морским свинкам: получение клона ВЭ в культуре клеток;
проведение селективных пассажей полученного клона на морских свинках для
достижения им высоковирулентных для этих животных свойств; анализ изменения
основных гематологических показателей, возникающих у животных в результате инфекции Эбола при проведении пассажей.
Генетический анализ исходного клона вируса Эбола, полученного в результате клонирования " в культуре клеток: определение полной нуклеотидной последовательности генома клона, сравнение полученной последовательности с последовательностями геномов штаммов вируса Эбола, доступными в базе данных GenBank; теоретическая оценка значимости выявленных нуклеотидных замен.
Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола: определение полной последовательности генома адаптированного варианта, сравнение полученной последовательности с последовательностями геномов клона-предшественника и штаммов вируса Эбола, доступными в базе данных GenBank; теоретическая оценка значимости выявленных нуклеотидных замен.
Анализ генетической изменчивости вируса Эбола в процессе его адаптации к морским свинкам: частичное определение нуклеотидных последовательностей геномов вариантов вируса Эбола, полученных на каждом пассаже; выявление корреляции возникновения нуклеотидных замен с ростом вирулентности ВЭ для морских свинок.
Теоретический анализ потенциального влияния аминокислотных замен, на структуру, термодинамическую стабильность и участки посттрансляционных модификаций вирусных белков. Теоретическая оценка влияния отбора на отдельные вирусные гены при проведении пассажей ВЭ на морских свинках.
Научная новизна работы. Впервые проведен поэтапный генетический и фенотипнческий анализ вариантов вируса Эбола, полученных в процессе адаптации его индивидуального клона к морским свинкам. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках NP (Asn^Ser566) и VP24 (Leu-^Pro147), возникновение которых сопровождалось проявлением
вирусом Эбола способности вызывать летальное заболевание у морских свинок. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках VP24 (Met~>Ile71 и Arg-^Leu ) и L (Val-Mle236), сопутствующие дальнейшему росту патогенности вируса Эбола для морских свинок. Впервые проведен теоретический анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков NP, VP24 и L, вариантов вируса Эбола, полученных при пассажах, сопровождающихся ростом вирулентности вируса для морских свинок.
Практическая значимость работы. Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков штаммов ВЭ-Заир. Последовательность нуклеотидных остатков полноразмерного адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7 задепонирована в базе данных GenBank под номером EU224440. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках, сопутствующие росту вирулентности вируса Эбола для морских свинок (гены VP24, NP и L). Результаты настоящего исследования вносят вклад как в изучение молекулярных основ патогенных свойств вируса Эбола, так и в определение роли белков VP24, NP и L в патогенезе лихорадки Эбола. Гены VP24 и NP, содержащие аминокислотные остатки, определяющие вирулентность вируса Эбола для морских свинок, могут служить мишенями для генной терапии, а также использоваться в разработке вакцин против лихорадки Эбола.
Положения, выносимые на защиту.
В результате селективных пассажей индивидуального клона вируса Эбола на морских свинках вирус приобрел способность вызывать летальное заболевание у данного вида животных.
Охарактеризован процесс поэтапного возникновения мутаций в геноме вируса Эбола в ходе пассажей на морских свинках.
Выявлены аминокислотные замены в структуре вирусных белков NP, VP24 и L, сопутствующие росту уровня вирулентности вируса Эбола для морских свинок.
В результате теоретического анализа были выявлены аминокислотные замены, оказывающие потенциальное влияние на структуру и участки посттрансляционных модификаций вирусных белков.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Joint Meeting of the 3 Divisions of the International Union of Microbiological Societies" (Сан-Франциско, 2005), "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемом издании (журнал «Вопросы вирусологии») и 5 сообщениях в сборниках трудов конференций.
Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением проведения пассажей ВЭ на морских свинках, получены непосредственно автором. Клонирование вируса на культуре клеток и пассажи на животных проведены при участии автора в режиме «под руководством».
Клиническая и патогенетическая характеристика геморрагической лихорадки Эбола
Филовирусы (ВЭ и ВМ) способны вызывать у человека и других приматов тяжелую геморрагическую лихорадку, для которой характерно неконтролируемое размножение вируса в организме, сопровождающееся широким спектром возможных синдромов, включающих лихорадку, слабость, диарею и тошноту, тяжелые поражения печени и нарушения коагуляционного гемостаза. Наиболее тяжелые симптомы, включающие геморрагический синдром и гипотензивный шок (Bwaka М. A. et. al., 1999; Slenczka W. G. et al., 1999), по всей видимости, являются следствием резкого выброса большого количества провоспалительных цитокинов (Baize S. et al., 2002). Причинами массивных кровотечений помимо действия цитокинов, повышающих проницаемость стенок кровеносных сосудов, может являться прямое цитопатическое действие филовирусных гликопротеинов на клетки эндотелия кровеносных сосудов (Takada A. et al., 2000; Chan S.Y. 2000, Baiter M. 2000), разрушение большого количества тромбоцитов, тяжелые повреждения печени и активация продукции тканевого фактора (procoagulant protein tissue factor) клетками системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) (Geisbert T.W. et al., 2003).
Типичное течение геморрагической лихорадки Эбола длится от 14 до 21 суток. Развитие заболевания начинается с неспецифических гриппоподобных симптомов таких, как лихорадка, миалгия и общее недомогание. По мере прогрессирования инфекции у пациентов проявляются тяжелые кровотечения и нарушения коагуляционного гемостаза, включающие желудочно-кишечные кровотечения, а также сыпь и ряд гематологических сдвигов таких, как лимфопения и нейтрофилия. После того, как ретикулоэндотелиальные клетки встречаются с вирусом, начинается выброс цитокинов, что может вносить вклад в чрезмерное развитие непротективных воспалительных реакций. Развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания при лихорадке Эбола сопутствует наличие серьезных повреждений печени в сочетании с высокими показателями вирусемии. На поздних стадиях заболевания вирус заражает практически все типы клеток, включая клетки сосудистого эндотелия, что приводят к нарушению целостности сосудов. На терминальных стадиях инфекции Эбола у пациентов, как правило, проявляются множественные диффузные кровотечения и гипотензивный шок, что во многих случаях приводят к летальному исходу (подробное описание патогенеза геморрагической лихорадки Эбола представлено в обзорах Colebunders, R et al., 2000, и Sanchez, A. et al., 2001 (Fields virology)).
Первичными мишенями для филовирусов являются дендритные клетки, моноциты и макрофаги (Ryabchikova Е. I. et al., 1999; Geisbert Т. W. et al., 2003). На поздних стадиях болезни спектр клеточных мишеней филовирусов расширяется, и вирус обнаруживается практически во всех типах клеток, за исключением клеток лимфатического происхождения (Geisbert Т. W. et al., 2003; Feldmann Н. et al., 2003). Рецепторы, используемые филовирусами для проникновения в клетки-мишени, не принадлежат к какому-либо одному типу и не являются специфичными для филовирусов - это Са2+-зависимые лектины (лектины С-типа), такие как DC-SIGN (также известный как CD209) (dendritic cell-), L-SIGN (также известный как CLEC4M) (liver/lymph node-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin), асиалогликопротеиновый рецептор; hMGL (human macrophage Cype lectine specific for galactose/N-acetylgalactosamine), экспрессируемый на поверхности клеток моноцитарного ростка и дендритных клеток; триггерные рецепторы, относящиеся к классу TREM (Becker S. et al., 1995; Simmons G. et al., 2003; Takada A. et al., 2004; Mohamadzadeh M. et al., 2006). Существуют типы клеток, не экспрессирующие лектины С-типа или TREM-рецепторы, и в то же время восприимчивые к филовирусной инфекции (например, эпителиальные и эндотелиальные клетки). По всей вероятности, данное явление объясняется тем, что такие экспрессируемые широким спектром клеток, молекулы, как гепарин-сульфан протеогликан (также известный как SDC2), и фолатный рецептор-а, принимают участие в рецептор-опосредованном проникновении вируса, что было продемонстрировано в некоторых экспериментальных работах (Bobardt М. D. et al. , 2003).
Важную роль в патогенезе геморрагической лихорадки Эбола играет способность вируса избегать иммунного ответа хозяина или оказывать ингибирующее воздействие на некоторые его стадии. Например, филовирусный белок VP35 предотвращает продукцию ИФН типа I (ИФН-а/р) (Bosio С. М. et al., 2003; Cardenas W. В. et al., 2006), a белок VP24 оказывает негативное влияние на способность как ИФН-а/р, так и ИФН-у, индуцировать противовирусное состояние клетки (Reid S. P. et al., 2006). Инфекция Эбола приводит к нарушению функций дендритных клеток, являющихся ключевым звеном в развитии адаптивного иммунного ответа (Bosio С. М. et al., 2003; Mahanty S. et al., 2003), а также к индукции апоптоза лимфоцитов в периферической крови и лимфотических узлах (Hevey, М. et al., 1998; Ignatyev, G. M. 1999; Baize S. et al., 1999; Geisbert, T. W. et al., 2000; Leroy, E. et al., 2000; Reed, D. et al., 2004; Haring J. S. et al., 2006;).
Ссуществуют данные, указывающие на возможные нарушения гуморального иммунного ответа при филовирусных инфекциях, приводящего к негативным эффектам, способствующим развитию геморрагического синдрома. В одной из работ описана концепция образования агрессивных аутоантител при инфекции Эбола (Chepurnov А.А. et al., 1996). По данным авторов сыворотка морских свинок, инфицированных ВЭ, содержала антитела, способные образовывать нерастворимые комплексы. Поскольку в иммуноферментном анализе антитела, содержащиеся в этой сыворотке, не проявляли сродства к ВЭ, авторы предполагают, что этими антителами могут быть аутоантитела, способные связываться с клетками эндотелия кровеносных сосудов, вызывая их повреждение и запуск коагуляционного каскада.
Определение биологического титра и клонирование вируса Эбола
После прохождения адаптационного периода к условиям Р-4 6 морских свинок были внутрибрюшинно инфицированы клоном ВЭ, полученным как описано в п. 2.2.1, в объеме 0,5 мл с титром 104 БОЕ/мл. Данное инфицирование считали первым пассажем. У морских свинок ежедневно измеряли ректальную температуру. На пятые - седьмые сутки (пик температурной реакции) морскую свинку, проявившую самое выраженное повышение температуры за весь период наблюдения, усыпляли, вскрывали, готовили 10%-ный печеночный гомогенат (на среде RPMI1640 с антибиотиками (стрептомицин 100 МЕ/мл, пеницилин 200 МЕ/мл)) и инфицировали (0,5 мл внутрибрюшинно) этим гомогенатом (разведенным в 10 раз той средой RPMI1640) следующих б интактных морских свинок, также прошедших к этому времени адаптацию к условиям Р-4. Данное инфицирование считалось вторым пассажем. Пассажи продолжали до появления и стабилизации уровня летальных исходов.
Подсчет лейкоцитарной формулы крови, определение количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови животных проводили на седьмые сутки п.и. вирусным препаратом, используя общепринятые клинические методы (Балуда В.П. и др. 1980). Для подсчета лейкоцитарной формулы готовили тонкие мазки крови с 0,2% содержанием ЭДТА, фиксировали парами формалина и окрашивали азур II - эозином по Романовскому-Гимзы(КостЕ.А., 1975).
Определение количества лейкоцитов
В стерильный стеклянный капилляр набирали 8 мкл крови и переносили в лунку планшета, содержащую 100 мкл 10%-ного раствора уксусной кислоты, вызывающей гемолиз эритроцитов, и тщательно перемешивали. Подсчет общего количества лейкоцитов проводили под световым микроскопом в камере Горяева с применением объектива 20х и окуляра 7х. Абсолютное содержание клеток віл крови вычисляли по формуле: L=K х а/1000, где L - содержание лейкоцитов віл крови , К - коэффициент пересчета (К=169), а- количество лейкоцитов, найденных в 20 больших квадратах камеры Горяева.
Определение количества эритроцитов
Для подсчета эритроцитов 20 мкл крови тщательно перемешивали с 4 мл 3%-ного раствора NaCl. Подсчет проводили под световым микроскопом в камере Горяева спустя 2 мин (для осаждения эритроцитов на дно камеры), пользуясь объективом 40х и окуляром 7х. Подсчет эритроцитов, содержащихся віл крови, проводили по формуле, исходя из разведения крови (1:200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000мкл), по следующей формуле: Le = а 107, где Le- количество эритроцитов віл крови, а - количество эритроцитов, подсчитанное в 80-ти малых квадратах.
Приготовление мазков крови и подсчет лейкоцитарной формулы Лейкограмму (процентное соотношение отдельных форм лейкоцитов крови) определяли в мазке крови. Каплю крови наносили на предметное стекло, затем шлифованным предметным стеклом делали мазок. Высохший на воздухе мазок фиксировали 98%-ным этанолом в течение 10 мин и обрабатывали парами формалина. Фиксированный мазок окрашивали азур-П-эозином по Романовскому-Гимзы (Кост Е.А., 1975). Мазки просматривали в световом микроскопе при иммерсионном увеличении объектива 90х. На каждом стекле просчитывали не менее 200 лейкоцитов.
Определение количества тромбоцитов
В мазке крови подсчитывали количество тромбоцитов по отношению к 1000 эритроцитов. Зная абсолютное число эритроцитов віл крови, вычисляли количество кровяных пластинок віл крови.
Общее число тромбоцитов определяли подсчетом их в тонких мазках, зафиксированных в парах формалина и окрашенных по Нохту, с последующим пересчетом на 1 л крови. Макроформы (более 4 мкм) и мегаформы (более 5,5 мкм) тромбоцитов объединяли в одну группу (молодые тромбоциты) и выражали в процентах от общего числа тромбоцитов.
Фагоцитарную способность нейтрофилов крови оценивали по Новикову Д.К. и Новиковой К.Н. (Белокриницкий Б.В. и др., 1989) в собственной модификации. В реакции фагоцитоза использовали полиакроленовый латекс АТ-20 (диаметр частиц 1,8 мкм) трижды отмытый физиологическим раствором и доведенный до концентрации 5x104 частиц/мкл. Равные объемы цельной крови с 0,2% содержанием ЭДТА и суспензии латекса инкубировали в течение 1 ч при 37С. Мазки, приготовленные из инкубационной смеси, фиксировали парами формалина, окрашивали по Нохту и просматривали на них 100 нейтрофилов. Подсчитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов и суммарное число латексных частиц в них, определяли фагоцитарное число (среднее число латексных частиц в фагоците). Показатель фагоцитарной способности (ПФС) находили путем умножения числа фагоцитирующих макрофагов на число латексных частиц.
Пассажи клона вируса Эбола на морских свинках
Анализ флуоресцентных электрофореграмм проводили, используя приложение ContigExpress программного пакета Vector NTI Advance 10. Множественное выравнивание последовательностей осуществляли, используя приложение AlignX программного пакета Vector NTI Advance 10. Расчет профилей гидрофобности белков проводили по методу Kyte и Doolittle (Kyte J. et al, 1982) с использованием приложения BioAnnotator рограммного пакета Vector NTI Advance 10 Для расчета потенциальной глобулярной укладки белков использовали программу Findex (Prilusky J. et al., 2005; http://bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex).
Выявления потенциальных сайтов О-, N-гликозилиования белков проводили с использованием сервисов «NetOGlyk 3.1 Serven (Julenius К. et al., 2005), «NetNGlyk 1.0 Server» (Gupta R. et al., 2002). Расчет вероятных сайтов фосфорилирования белков проводили при помощи «NetPhos 2.0 Serven (Blom N. et al., 1999) и сайтов фосфорилирования специфическими протеинкиназами при помощи «NetPhosK 1.0 Serven (Blom N. et al., 2004) (http://www.cbs.dtu.dk/services/). Для расчета вероятной вторичной структуры белков использовали программу «NNPREDICT» (http://www.cmpharm.ucsf.edu/ nomi/nnpredict.htm 1) (McClelland J. L.et al., 1988; Kneller D. G.. et al., 1990) и сервиса «PSIPRED» (http://tMoinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) (Jones, D.T. 1999; McGuffin, L.J. et al., 2000).
Моделирование вторичной структуры РНК проводили при помощи сервисов «GeneBee service» (http://www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html) (Brodsky L.I. et al., 1992; Brodsky L.I. et al., 1995) и «RNAalifold Webserver» (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAalifold.cgi) (Gruber A.R. et al., 2008; Hofacker I.L. et al., 2002).
Для расчета свойств олигонуклеотидных праймеров использовали программу «калькулятор свойств олигонуклеотидов» (http://www. basic, northwestern.edu/biotools/oligocalc. html). Для построения дендрограмм и расчета генетических расстояний использовали программу Mega версии 4.0 (Tamura et al., 2007). При построении использовали метод попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (Unweighted pair-group method using arithmetic averages - UPGMA) (Sneath P.H.A. et al., 1973), на основе алгоритма Кимура с двумя параметрами при этом учитывались как транзиций, так и трансверсий (Kimura М., 1980). Каждую замену или делецию рассматривали по отдельности. Длины ветвей дендрограмм были выровнены на основе предположения об одинаковой частоте накопления замен во времени (Takezaki N., 2004). Надежность дендрограммы определяли перестановочным анализом статистической значимости (бутстреп-тест) с использованием 1000 повторов (Felsenstein J., 1985). Остальные параметры принимали по умолчанию.
Tajima тест равенства скорости эволюции (Tajima, 1993) проводили при помощи программы Mega версии 4.0 (Tamura et al., 2007). Тест на позитивную селекцию проводили, рассчитывая отношение частот несинонимичных мутаций к синонимичным по модифицированному методу Nei-Gojobori (p-distance) (Zhang J. et al., 1998). Наличие позитивной селекции выявляли, если значение данного соотношения между двумя эволюционно более близкими штаммами превышало значения данного параметра при сравнении эволюционно более отдаленных штаммов. Если между парой последовательностей существуют только значимые различия, значение не вычисляли, считая его высоким (Sheridan I. et al., 2004; Shackelton L.A. et al., 2005)
Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7
Было проведено множественное выравнивание последовательностей н.о. геномных РНК preGPA-clone й GPA-P7 с полноразмерными геномными РНК эталонных штаммов представителей трех видов рода Ebolavirus, а также адаптированных к морским свинкам и мышам штаммов ВЭ (8МС и МА), доступных в базе данных GenBank (номера в базе данных GenBank NC_002549, NC_004161, NC_006432, AF499101, AF272001), с использованием приложения AlignX программного пакета Vector NTI Advance 10 (Informax ink., USA). Фрагменты, множественного выравнивания, соответствующие районам гена NP GPA-P7, содержащим мутации, представлены на рисунке 14.
Анализ выровненных последовательностей н.о. выявил, что синонимичные мутации в последовательности н.о. гена NP, за исключением мутации U-C 2092, расположены в вариабельных среди представителей рода Ebolavirus районах генома. Остаток уридина (на рисунке 14 - тимидина) в позиции 2092 является консервативным среди представителей рода Ebolavirus.
Две из четырех несинонимичных нуклеотидные замены (U-C 2100, U-C 2261) располагаются в вариабельных районах генома ВЭ, в то время как две другие (A-G 2166 и A-G 2456) выявлены в районах консервативных среди представителей рода Ebolavirus. Интересно отметить, что несинонимичная нуклеотидная замена G-A 2456 в геноме полученного в результате пассажей на морских свинках варианта GPA-P7 является реверс-мутацией, восстанавливающей в данной позиции кодон, присутствующий в геноме природного штамма Mayinga.
В последовательности н.о. гена VP24 GPA-P7 были обнаружены три мутации G-A 10557, U-C 10784 и G-A 10805, приводящие к заменам а. о. в кодируемом белке. Фрагменты множественного выравнивания последовательностей и.о., включающие районы, содержащие указанные мутации представлены на рисунке 14. Подвергшиеся мутации н.о. являются консервативными для представителей рода Ebolavirus. Важно отметить, что две из трех рассматриваемых мутаций (G-A 10557, U-C 10784) гена VP24 присутствуют также и в геноме адаптированного к морским свинкам штамма 8МС (Volchkov et al., 2000).
Ген L GPA-P7 содержал две нуклеотидные замены: синонимичную G-A 16821 и несинонимичную мутацию G-A 12286. Полученный в результате семи последовательных пассажей на морских свинках вариант GPA-P7, не являлся генетически однородным и содержал генетические варианты, различающиеся по мисенс мутации в последовательности гена L G-A 12286.
Детализация участков, содержащих мутации гена L GPA-P7, выровненных последовательностей геномных РНК представителей рода Ebolavims приведена на рисунке 14. В позиции 16821 геномной РНК всех рассматриваемых представителей рода содержится остаток гуанина, лишь у ВЭ-Рестон в указанной позиции содержится остаток аденина, так же как и у характеризуемого нами варианта ВЭ GPA-P7. Пара остатков гуанина в позициях 12286-12287, один из которых претерпел в геноме GPA-P7 замену на остаток аденина, делегирована в геноме ВЭ-Судан и ВЭ-Рестон, но сохраняется в геноме всех штаммов ВЭ-Заир.
Анализ аминокислотных последовательностей белков варианта GPA-P7 Белок NP адаптированного к морским свинкам варианта ВЭ GPA-P7 содержит четыре аминокислотные замены Leu- Pro544, Asn- Ser566, Ser- Pro598 и Asn Asp663 по сравнению с белком NP preGPA-clone (таблица 17).
Множественное выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей белков NP различных видов ВЭ, последовательности н.о. которых доступны в базе данных GenBank (номера в базе данных GenBank NC002549, NC_004161, NC_006432, AF499101, AF272001), проводили с использованием приложения AlignX программного пакета Vector NTI Advance 10 (Informax ink., USA). Детализация участков выровненных последовательностей содержащих описываемые мутации, представлена на рисунке 16.
Анализ выровненных последовательностей а. о. показал, что аминокислотные замены Leu- Pro544, Asn- Ser566, Ser- Pro598 затрагивают центральную вариабельную часть белка NP. Рассматриваемые аминокислотные замены не сопровождаются сменой класса кодируемых а.о. А.о. в позиции 566 видоспецифичен (Asn - для штаммов и изолятов ВЭ-Заир, His - для ВЭ-Рестон и Gin - для ВЭ-Судан). Мутация в консервативной позиции Asn- Asp бз является реверс-мутацией, восстанавливающей в указанной позиции остаток аспарагина, свойственный эталонному штамму ВЭ-Заир Mayinga, и характерный для всех представителей рода отрицательный заряд а.о. в указанной позиции
Согласно предсказанной модели глобулярной укладки, рассчитанной на основе профиля гидрофобности белка NP (рисунок 17), все четыре указанные мутации входят в состав обширной гидрофильной С-концевой части белка NP и, вероятно, занимают положение на поверхности белковой глобулы.
