Содержание к диссертации
Введение
2. Результаты 31
2.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов путем вычитательной гибридизации и ее анализ 31
2.1.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов путем вычитательной гибридизации 31
2.1.2. Анализ полученных последовательностей 32
2.1.3. Проверка качества вычитательной кДНК-библиотеки путем RT ПЦР 37
2.1.4. Примеры генов с известными гомологами 39
2.2. HyEED-1 - консервативный регуляторныи ген, участвующий в эмбриогенезе 43
2.2.1. Клонирование HyEED-1 43
2.2.2. Анализ экспрессии HyEED 49
2.3 НуЕМВ-1 - ген без известных гомологов, задействованный в эмбриогенезе 54
2.3.1. Клонирование и анализ НуЕМВ-1 54
2.3.2. Анализ экспрессии НуЕМВ-1 методом гибридизации in situ 58
3. Обсуждение 63
3.1. Эмбриональное развитие: что происходит на молекулярном уровне 63
3.2. Преимущества и недостатки подавляющей вычитательной гибридизации 66
3.3. Проверка качества библиотеки: необходимо ли это? 68
3.4. Анализ последовательностей кластеров и синглетов библиотеки Kiel 3 70
3.4.1. Общая информация 70
3.4.2. Не имеющие гомологов гены в библиотеке Kiel 3 71
3.5. НуЕМВ-1 - не имеющий гомологов, неизвестный ранее ген 73
3.6. Ген Hydra Embryonic Ectoderm Development эпигенетика и происхождение интерстициальных клеток 75
3.6.1. Функции белков группы Polycomb 75
3.6.2. Hydra EED - самый ранний генетический маркер интерстициальных клеток 77
3.7. Заключительные соображения 80
4. Резюме 83
5. Материалы 85
5.1. Используемые животные 85
5.2. Среды 85
5.3. Растворы 86
5.3.1. Растворы общего назначения 86
5.3.2. Растворы для гибридизации in situ и окрашивания антителами и методом TUNEL 88
5.4. Наборы реагентов 90
5.5. Ферменты (не из наборов реагентов) 90
5.6. Химические реагенты 91
5.7. Радиоактивные нуклеотиды 93
5.8. Векторы 93
5.9. Антитела 93
5.10. Праймеры и олигонуклеотиды 94
5.11. Приборы 37
5.12. Прочие материалы 99
5.13. Компьютерные программы 99
6. Методы 102
6.1. Животные и условия культивирования 102
6.2. Выделение геномной ДНК 103
6.3. Выделение тотальной и матричной РНК 104
6.4. Синтез кДНК путем обратной транскрипции 104
6.5. Лигирование сплинкеретт 105
6.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 106
6.6.1. Амплификация фрагментов ДНК 107
6.6.2. RT ПЦР 107
6.6.3. 3' RACE ПЦР 108
6.6.4. 5' RACE ПЦР 109
6.6.5. ПЦР с вырожденным праймером 110
6.7. Гибридизация по Саузерну 110
6.8. Гибридизация по Ноэерну 112
6.9. Клонирование и сєквенирование 113
6.9.1. АТ-лигирование продуктов ПЦР 113
6.9.2. Компетентные клетки 114
6.9.3. Электропорация и проверка на наличие вставки 115
6.9.4. Выделение плазмид 115
6.9.5. Сєквенирование с использованием системы Li-COR 115
6.9.6. Сєквенирование с использованием системы MEGABACE 500 116
6.10. Подавляющая вычитательная гибридизация 117
6.11. Выращивание библиотеки в бактериях и приготовление макроэррэев 119
6.11.1. Выращивание библиотеки в бактериях, репликация и хранение клонов 119
6.11.2. Упорядоченное нанесение клонов библиотеки на
нейлоновую мембрану и обработка фильтров 120
6.11.3. Гибридизация макроэррэев 121
6.12. Гибридизация in situ 121
6.12.1. Приготовление меченных дигоксигенином проб 121
6.12.2. Гибридизация in situ на целых зародышах 122
6.12.3. Гибридизация in situ на целых полипах 123
6.12.4. Гибридизация in situ на замороженных срезах эмбрионов 124
6.13. Окрашивание антителами 125
6.13.1. Окрашивание антителами взрослых полипов 125
6.13.2. Окрашивание антителами замороженных срезов 126
6.14. Окраска по методу TUNEL 126
Литература 128
Благодарности 141
Официальное заявление 142
- Проверка качества вычитательной кДНК-библиотеки путем RT ПЦР
- Преимущества и недостатки подавляющей вычитательной гибридизации
- Растворы для гибридизации in situ и окрашивания антителами и методом TUNEL
- Синтез кДНК путем обратной транскрипции
Введение к работе
Программа развития многоклеточного животного включает в себя формирование самой сложной клетки организма, яйцеклетки, ее оплодотворение и быстрое, но при этом безошибочное, развитие исключительно сложно устроенного тела животного. Самое очевидное и, в то же время, важнейшее свойство орогенеза и эмбрионального развития заключается в том, что эти процессы происходят с каждым живым существом только один раз за всю их жизнь. В ходе орогенеза или раннего развития происходит детерминация осей тела, затем специфицируются обширные области зародыша, клетки пролиферируют и дифференцируются, образуя, в конечном счете, части тела. Общепринятым считается то, что закладка осей, формирование паттерна, морфогенетические движения, зависимая от положения в зародыше спецификация судьбы клетки, активные и всеохватывающие процессы пролиферации и дифференциации клеток являются характерными особенностями орогенеза и эмбрионального развития. Все эти процессы требуют жесткого контроля за экспрессией генов, что возможно только в строго организованной среде из структурных белков, желтка, мембранных компонентов и специфически распределенных в пространстве материнских мРНК. После того как формирование паттерна завершается, а части тела и органы уже сформированы, задачей организма становится, в первую очередь, поддержание гомеостаза, обновление клеточных популяций, борьба с патогенами и, наконец, репродукция. Эта смена задачи отражается в наличии значительного числа структурных и регуляторных генов (и материнских, и зиготических), которые необходимы для построения организма животного, но не для его поддержания. Эти гены экспрессируются кратковременно в ходе оогенеза (если это гены материнского эффекта) и эмбриогенеза. Например, материнская мРНК bicoid запасается на переднем полюсе яйца Drosophila, белок, транслированный с этой мРНК, образует градиент, и, после того как передне-задняя ось плодовой мушки специфицирована, bicoid больше не экспрессируется до тех пор, пока не приходит время сформировать новое яйцо (Bereleth et al., 1988; FlyBase http://flybase.bio.indiana.edu/). Hunchback экспрессируется в яичниках Drosophila; его РНК имеется во всех частях эмбриона, но в передней части, где белок bicoid связывается с энхансерами hunchback в зиготических ядрах, дополнительно транскрибируется еще некоторое количество hunchback. Hunchback работает вместе с bicoid, регулируя формирование передней части зародыша, и также не экспрессируется во взрослой дрозофиле до тех пор, пока не начинается оогенез (FlyBase http://flybase.bio. indiana.edu/). Зиготический ген serendipity-a кодирует компонент цитоскелета, необходимый для целлюляризации. Этот ген начинает экспрессироваться во время двенадцатого клеточного цикла, достигает максимальной интенсивности экспрессии в начале четырнадцатого цикла, а к концу его полностью исчезает (см. обзор Mazumdar and Mazumdar, 2002). Эти данные свидетельствуют о том, что существуют процессы, специфичные для эмбрионального развития, и они требуют определенного генетического контекста.
В то же время существуют животные, у которых формирование паттерна, пролиферация и дифференциация клеток происходят постоянно или случаются периодически и во взрослом состоянии. За их необычную природу эти процессы даже получили название «соматических эмбриогенезов» (Tokin, 1969). Соматические эмбриогенезы типичны для животных, стоящих по обе стороны эволюционной границы Eumetazoa: для губок и книдарий.
Проверка качества вычитательной кДНК-библиотеки путем RT ПЦР
В результате ошибок вычитательной гибридизации возможно получение некоторого числа клонов, несущих фрагменты кДНК генов, которые не являются дифференциально экспрессирующимися на интересующих нас стадиях развития. Эффективность вычитания может варьировать от 95% (Diatchenko et al., 1996) до 5% (Diatchenko et al., 1998). Чтобы определить, насколько качественно сработала процедура вычитательной гибридизации в моем случае, я оценил уровень экспрессии пятнадцати из восьмидесяти восьми кластеров и синглетов в ходе эмбриогенеза и во взрослых почкующихся полипах при помощи RT ПЦР. Для этого эксперимента были проведены независимые выделения матричной РНК из эмбрионов тех же стадий (зигота - поздняя гаструла), которые использовались для приготовления кДНК тестера, и из почкующихся бесполых гидр. На матрице мРНК были синтезированы од но цепочечные кДНК, и концентрация кДНК в пробах была эквилибрирована при помощи RT ПЦР с праймерами против Р-актина (fi-actiri) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). В качестве контрольного гена, экспрессирующегося только во взрослых животных, использовался HyDkk3, транскрипт которого присутствует в предшественниках стрекательных клеток (Fedders et al., 2004). Результаты RT ПЦР представлены на Рис. 2.4А и В. Ни один из проверенных кластеров не оказался более сильно экспрессирующимся во взрослых бесполых полипах, чем в эмбрионах. Следует заметить, однако, что уровень экспрессии некоторых кластеров (например, кластер 001, кластер 029, кластер 061) возрастал в эмбрионах очень слабо. Полученные данные позволяют заключить, что вычитательная гибридизация прошла успешно и что общеечисло кластеров, возникших в результате ошибок гибридизации, мало. В то же время стало ясно, что, основываясь на силе экспрессии протестированных кластеров, их можно разделить на две группы: а) кластеры, уровень экспрессии которых повышается в эмбрионах, однако, также, высок и во взрослых бесполых животных (Рис. 2.4А), и б) кластеры, экспрессирующиеся исключительно в эмбрионах (Рис. 2.4В). Кластеры из второй группы были дополнительно проверены при помощи RT ПЦР с целью установить, является ли их экспрессия материнской или зиготической. Для этого сравнивались одноцепочечные кДНК-пробы из бесполых почкующихся гидр и из женских полипов с развивающимися яйцевыми бугорками. Все три кластера второй группы оказались материнскими транскриптами (Рис. 2.4С).
Среди кластеров вычитательной библиотеки Kiel 3 был обнаружен гомолог гена бистина (bystiri) Danio rerio и мыши (кластер 043, значение Е = Зе-46). Кластер 043 соответствует 5 части транскрипта. Он содержит старт-кодон, которому предшествует стоп-кодон, и, согласно анализу с помощью алгоритма SMART, бистиновый домен (Рис. 2.5). Открытая рамка считывания идет далее в 3 направлении. Причина, почему гомолог бистина из пресноводной гидры может быть интересен, заключается в том, что у мыши бистин является одной из молекул, которые, вместе с трофинином, тастином и цитокератином обусловливает адгезию бластоцисты к клеткам эндометрия матки молекулы клеточной адгезии млекопитающих в эмбрионах гидры может быть не случайным совпадением.
Другой интересный ген с вероятной функцией в развитии - это гомолог гена mesoderm development candidate 2 (mesdc2) мыши (кластер 056, значение Е = 1е-29). Так же как и в случае гомолога бистина, кластер 056 содержит 5 участок кодирующей последовательности (Рис. 2.6). Как и гомологичный белок из мыши, mesodermdevelopment candidate 2 гидры содержит N-концевой сигнальный пептид и не имеет более никаких консервативных доменов. Анализ при помощи программы SignalP выявил сайт предполагаемого отрезания сигнального пептида после двадцать пятого аминокислотного остатка (Рис. 2.7). У мыши гены mesdcl и mesdc2 были обнаружены на седьмой хромосоме в локусе, делеция которого, как было показано путем «спасения» летальных мутантов при помощи ВАС-трансгена с этим локусом, является критической для образования мезодермы зародышей (Wines et al., 2001). То, какимименно образом действует белок mesdc2 у мыши, остается невыясненным. Функция гомолога этого белка из гидры тем более не известна. Однако и в этом случае мы встречаем ген, существующий раньше, чем обслуживаемая им у высших животных функция: ведь гидра имеет ген, являющийся, видимо, необходимым для образования мезодермы, но не имеет самой мезодермы.
Третий интересный и исключительно сильно экспрессирующийся в эмбрионах, в отличие от взрослых бесполых животных, ген - это гомолог эквинатоксина II {equinatoxin II) из Actinia equina (кластер 011, значение Е = 4е-8). Этот ген, получил рабочее название Hydra Toxin 1 (НуТох-1). Кластер, полученный в ходе вычитательной гибридизации, содержит полноразмерную кодирующую последовательность с открытой рамкой считывания длиной 186 аминокислот, консервативную лидерную последовательность для сплайсинга (Stover and Steele, 2001) в 5 -нетранслируемой области и З -нетранслируемую область (Рис. 2.8А). Различные программы для предсказания предполагаемой доменной структуры белка дают различные результаты. НуТох-1 содержит С-терминальный цитотоксический домен (аминокислотные остатки 45-182 согласно BLAST или 18 - 186, согласно SMART) и трансмембранный домен (аминокислотные остатки 5-27 согласно SMART или 1-19 согласно TMpred), который также может быть сигнальным пептидом (аминокислотные остатки 1-18 согласно
Преимущества и недостатки подавляющей вычитательной гибридизации
Выбор подавляющей вычитательной гибридизации, как метода, который позволяет искать различия между пулами транскриптов на разных исследуемых стадиях, представляется естественным. В данной работе вычитательная гибридизация использовалась с целью поиска генов, уровень экспрессии которых увеличивался в ранних эмбрионах по сравнению с бесполыми почкующимися полипами гидры. Самое серьезное и, в случае моей работы, решающее преимущество вычитательной гибридизации заключается в том, что она позволяет непредвзятый поиск генов, не основывающийся на известных гомологи ях. Это ведет к нахождению большого числа ранее неизвестных и неохарактеризованных генов - вещи невозможной, в случае поиска гомологов известных генов. В то же время, процедура вычитательной гибридизации имеет несколько присущих ей дефектов, главный из которых коренится в необходимости ферментативного разрезания двуцепочечной кДНК тестера перед лигированием адаптеров. В результате, получаемая библиотека состоит не из полноразмерных кДНК, а из фрагментов кДНК генов, сильнее экспрессирующихся на интересующей нас стадии развития. Кроме того, возможна неоднозначная интерпретация получаемых последовательностей, особенно в случае кластеров, не имеющих гомологичных последовательностей среди известных генов. Ситуации, ведущие к возможной ложной интерпретации, продемонстрированы на Рис. 3.2. Гипотетическая дифференциально экспрессирующаяся мРНК, кодирующая белок с консервативным доменом и содержащая два сайта рестрикции для эндонуклеазы, с помощью которой производилось переваривание кДНК тестера, даст, в конечном счете, три рестрикционных фрагмента: Кластер 1, Кластер 2 и короткий фрагмент (Короткий-1). Предроложим, Короткий-1 будет исключен из анализа, так как он меньше установленного порогового значения длины кластера; таким образом, останутся только того же транскрипта, кодирующего G-белок. Более того, если в гене есть консервативный участок, например, как в случае Кластера 1, кодирующий ДНК-связывающий домен транскрипционного фактора, то в ходе поиска гомологов при помощи алгоритма BLAST обнаружится гомологичный ген, и Кластер 1 будет аннотирован как гомолог этого гена. Кластер 2, напротив, если два гомолога в достаточной степени дивергировали, не найдет гомологичной последовательности и будет аннотирован как раннее неизвестный ген. Таким образом очевидно, что отсутствие результата поиска BLAST не обязательно означает, что обнаружен ранее неизвестный и не имеющий гомологов ген. Подобное заключение может быть сделано только в том случае, если получена полноразмерная кодирующая последовательность.
Другая техническая проблема - это размер фрагмента, полученного в результате подавляющей вычитательной гибридизации. Во-первых, длинные матрицы без сайтов рестрикции для используемой при приготовлении тестера эндонуклеазы не будут эффективно амплифицированы в ходе ПЦР и потеряются из конечной библиотеки. Во-вторых, поскольку в процедуре вычитания нет шага, когда происходит отбор фрагментов в зависимости от размера, то длина фрагментов зависит исключительно от используемой рестриктазы. У млекопитающих средний размер рестрикционных фрагментов, полученных при обработке кДНК Rsa I, составляет примерно 600 пар оснований (Diatchenko et al., 1996), в то время как библиотека Kiel 3 имеет средний размер кластера, равный 379 парам нуклеотидов. Ну а чем короче кластер, тем затруднительней последующий его анализ. В перспективе было бы уместно протестировать различные рестриктазы, режущие с образованием тупых концов, чтобы выбрать тот фермент, который бы давал средний размер рестрикционного фрагмента в промежутке между 0.6 - 1 kb, а также включить в процедуру шаг селекции по размеру фрагмента перед лигированием адаптеров и гибридизацией с кДНК драйвера.
Как указывалось ранее, вычитательная гибридизация - это процедура, в процессе которой могут быть случайно отобраны матрицы, не являющиеся дифференциально экспрессирующимися на исследуемой стадии. Эффективность вычитательной гибридизации может варьировать от 95% содержания дифференциально экспрессирующихся последовательностей до 5% (Diatchenko et al., 1996; Diatchenko et al., 1998). Поэтому оказывается необходимым проверять результат вычитательной гибридизации. Наиболее практичным подходом для проверки библиотеки и нахождения клонов, несущих вставки с фрагментами дифференциально экспрессирующихся генов, является анализ микро- или макроэррэев. Клоны библиотеки Kiel 3 с шести 384-луночных микротитровальных плат (2304 клона) были нанесены на нейлоновые мембраны, лизированы и прогибридизованы сначала с радиоактивной пробой, приготовленной на основе эмбриональной одноце почечной кДНК, а затем, после полной отмывки мембраны от связавшегося зонда, повторно прогибридизованы с пробой, приготовленной на основе одноцепочечной кДНК из бесполых почкующихся полипов. В предварительном эксперименте мной было отобрано и просеквенировано ПО клонов, дающих дифференциальный гибридизационный сигнал, и 42 клона, не дающих гибридизационного сигнала ни с эмбриональной пробой, ни с пробой из бесполых почкующихся полипов. Несмотря на то, что секвенирование всей библиотеки в рамках EST-проекта гидры сделало результаты этого предварительного секвенирования в кильской лаборатории избыточными, имеется несколько моментов, требующих обсуждения. Последовательности просеквенированных дифференциально гибридизующихся клонов были собраны в кластеры, и несколько из них были проверены при помощи RT ПЦР. Все проверенные кластеры действительно оказались дифференциальнокспрессирующимися (то есть они сильнее экспрессируются в эмбрионах, чем во взрослых бесполых гидрах). В то же время ни один из трех проверенных RT ПЦР клонов, из тех 78 обнаруженных на фильтре, которые давали более сильный гибридизационный сигнал с пробой из взрослых бесполых полипов, чем с пробой из зародышей, не оказался действительно ошибкой вычитательной гибридизации. Эти клоны соответствовали кластерам 002, 042 и 061 (см. Рис. 2.4). Таким образом, анализ макроэррэя дает ценные указания на то, какие ооны являются дифференциально экспрессирующимися, а также предоставляет примерные данные об экспрессии гена, поскольку интенсивность гибридизационного сигнала должна быть пропорциональна количеству одноцепочечной кДНК этого транскрипта в пробе для гибридизации. Однако процедура приготовления и гибридизации макроэррэя в случае библиотеки Kiel 3 оказалась более подвержена ошибкам, чем сама процедура вычитательной гибридизации, в первую очередь, вследствие неспецифической гибридизации сложной кДНК-пробы с некоторыми клонами на мембране.
Анализ результатов RT ПЦР и данных секвенирования позволяет сделать следующие выводы: 1. В результате проверки путем RT ПЦР 15 из 78 кластеров, не было обнаружено ни одной ошибки вычитательной гибридизации. Это позволяет утверждать, что общее количество ошибок вычитания мало. 2. Процедура подавляющей вычитательной гибридизации привела к получению двух типов дифференциально экспрессирующихся фрагментов. Фрагменты первого типа в эмбриональных клетках экспрессируются сильнее, чем во взрослых животных, однако уровень их экспрессии во взрослых гидрах также значителен (Рис. 2.4А). Фрагменты второго типа (Рис. 2.4В) экспрессируются исключительно или почти исключительно в эмбрионах, 3. Все три обнаруженных дифференциально экспрессирующихся фрагмента второго типа оказались материнскими транскриптами, которые, скорее всего, накапливаются в ооците в ходе оогенеза (Рис, 2.4С). 4. Несмотря на то, что подавляющая вычитательная гибридизация действительно оказалась очень надежным способом получения кДНК генов, экспрессия которых возрастает на определенных стадия развития, количество EST, составляющих кластер, никак не отражает ни силы экспрессии гена, ни степени дифференциальности его экспрессии на сравниваемых стадиях. Например, кластер 001, представляющий бетаин-гомоцистеин метилтрансферазу, составлен из 505 EST. Макроэррэй и RT ПЦР, тем не менее, показали, что этот ген не является ни сильно экспрессирующимся, ни высоко дифференциальным по уровню своей экспрессии на двух сравниваемых стадиях. Экспрессия кластера 052, напротив, исключительно высоко дифференциальна на двух сравниваемых стадиях, несмотря на то, что сам кластер представлен только десятью EST. 5. BLAST-анализ кластера против EST из бесполых гидр может давать результаты, и, тем не менее, исследуемый ген может быть очень высоко дифференциальным по уровню своей экспрессии (например, кластеры 005, 011 и 052).
Растворы для гибридизации in situ и окрашивания антителами и методом TUNEL
Реакция мечения продолжительностью 30-60 проводилась при 37 ; затем продукт разбавлялся 1:1 буфером ТЕ и очищался на колонке, заполненной сорбентом "Sephadex G-50 medium". Колонка приготавливалась из пластикового шприца на 1 мл, который заполнялся автоклавированным в ТЕ сефадексом. Эффективность мечения измерялась на жидкостном сцинтилляционном счетчике по методу Черенкова. Полученная проба денатурировалась и добавлялась в гибридизационный раствор из расчета 2x106 Срт/мл. Мембраны гибридизовались в течение 12 часов, а затем отмывались при 60 . Сначала мембраны ополаскивались 2х SSC/0.1% SDS, а после этого отмывались 2х 30 в 0.2х SSC/0.1% SDS. Влажные мембраны затем запаивались в полиэтиленовые пакеты и экспонировались с экраном для сканера Phospholmager или с рентгеновской пленкой (на время экспозиции с рентгеновской пленкой кассета содержалась при -80). Для гибридизации по Нозерну на каждую дорожку геля наносилось 30 мкг тотальной РНК или 0.5-1 мкг поли-А+ матричной РНК. Перед электрофорезом камера сначала обрабатывалась в течение 30 0.5% SDS, затем споласкивалась 1 М NaOH и промывалась водой. Содержащий формальдегид гель приготавливался по стандартной методике {Sambrook et al., 1989) путем смешивания 0.5 г агарозы, растопленных в 31.5 мл воды, с 9 мл 37% формальдегида и 10 мл 5х буфера для электрофореза РНК (0.1 М MOPS рН 7, 40 тМ ацетат натрия, 5 тМ ЭДТА рН 8). По окончании полимеризации проводился пятиминутный предварительный прогон геля в 1х буфере для электрофореза РНК, а затем на гель наносились денатурированные и смешанные с загрузочным буфером образцы РНК и маркер. Перед денатурацией к образцу РНК добавлялись следующие компоненты: Смесь денатурировалась десятиминутным нагреванием до 70, быстро охлаждалась на льду, смешивалась с 10х загрузочным буфером (50% глицерин, 1 тМ ЭДТА рН 8, 0.25% бром феноловый синий, 0.25% ксилолцианол) и наносилась на гель. Разделение производилось в поле ЗВ/см в 1х буфере для электрофореза РНК. Затем дорожка с маркером отрезалась от геля, окрашивалась в 0.5 мкг/мл бромистом этидии в 0.1 М растворе ацетата аммония, отмывалась в воде и фотографировалась. Капиллярный перенос РНК из геля осуществлялся в течение ночи в 20х SSC. Затем РНК иммобилизовывалась ультрафиолетом на предварительно высушенной мембране, мембрана смачивалась в 2х SSC и предгибридизовывалась в гибридизационном растворе (50% формами д, 4.8х SSC, 10 mM Tris-HCl рН 7.5, 1% SDS, lx Denhardt s, 10% дексгрансульфат, 20 мкг/мл обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося) при 42 . Мечение радиоактивной пробы производилось так же, как было описано в разделе 6.7. Гибридизация проводилась при 42 в течение 12 часов.
Несвязавшаяся проба отмывалась при 60 так же, как было описано для случая гибридизации по Саузерну, а затем мембрана экспонировалась с экраном для сканера Phospholmager или с рентгеновской пленкой. Размер РНК, дающих гибридизационные сигналы определялся, исходя из положения в геле полос, соответствующих 28S и 18S рибосомальным РНК, или полос РНК-маркера, с использованием калибровочной кривой. 7ін/-полимераза, используемая в полимеразной цепной реакции, добавляет на 3 -конец продукта ПЦР один лишний аденин. Это делает возможным лигирование полученного фрагмента по липким концам в линеаризованный вектор, имеющий на 3 -концах лишний тимин. Половина амплифицированного при помощи ПЦР продукта анализировалась на агарозном геле, затем, в случае если была получена сильная единичная полоса, то оставшаяся половина ПЦР-смеси очищалась от оставшихся нуклеотидов и праймеров с использованием "PCR Purification Kit" (Qiagen) согласно инструкциям производителя, и 1 мкл элюированной ДНК использовался для лигирования. Если в результате ПЦР было получено несколько продуктов, то фрагменты нужного размера вырезались из агарозного геля и выделялись из агарозы при помощи "Gel Extraction Kit" (Qiagen) согласно имеющейся инструкции. После выделения из геля образец инкубировался в течение 5 при 72 в 1х буфере для ПЦР с Taq-полимеразой и dNTP для того, чтобы заново присоединить адснины на концы фрагментов. Эта процедура оказалась необходимой, так как, видимо, при выделении из геля большая часть липких концов отваливалась, что приводило к очень низкой эффективности трансформации. После присоединения аденинов образец еще раз очищался с использованием "PCR Purification Kit" и 1 мкл элюированной ДНК брался для лигирования. В данном исследовании для АТ-клонирования использовалась векторная система pGEM (Promega). Лигирование осуществлялось, в основном, согласно протоколу производителя вектора. Изменения заключались в том, что объем реакции лигирования был уменьшен вдвое, и, соответственно, были пропорционально уменьшены объемы добавляемых компонентов реакции. После лигирования Т4-лигаза инактивировалась нагреванием до 65 на 10 . Этот шаг оказался исключительно полезным - эффективность трансформации при электропорации бактерий лигазной смесью с инактивированным ферментом значительно возрастала. Для трансформации использовались клетки Escherichia coli линий XLl-blue и DH5-a. Для приготовления электрокомпетентных клеток из отдельной колонии Е. coli в 3 мл среды SOB, содержащей 12 мкг/мл тетрациклина, при 37 выращивалась ночная культура. Эта ночная культура использовалась для заражения 50 мл SOB. Бактерии выращивалась при интенсивном перемешивании еще несколько часов до достижения оптической плотности ООбоо = 0.5-0.6. и осаждались центрифугированием в течение 10 на 3000 g. Затем осадок ресуспендировался в 50 мл холодной (0) стерильной бидистиллированной воды, еще раз центрифугировался, отмывался в 25 мл сЮНгО, а затем в 2 мл 10% стерильного глицерина. После заключительного центрифугирования клетки ресуспендировались в 200 мкл 10% стерильного глицерина и замораживались при -80 в аликвотах по 40 мкл. Клетки Е. coli размораживались на льду, затем к клеточной суспензии добавлялся 1 мкл инактивированной нагреванием лигазной смеси, и через перемешанную смесь пропускался электрический разряд (25 мкФ, 200 Ом, 1.8 кВ).
Электропорироваиные клетки смешивались с 960 мкл среды SOC и инкубировались без антибиотика в течение одного часа на качалке при 37. Затем 100 мкл жидкой бактериальной культуры высеивались на чашку Петри со средой LB-arap, содержащей 50 мг/мл ампициллина, и чашка инкубировались при 37 в течение ночи. Для проведения бело-голубой селекции клонов, содержащих вставки, в среду на чашке перед высеиванием клеток втиралось 40 мкл 50 мг/мл раствора X-Gal и 4 мкл 200 мг/мл раствора IPTG. Выросшие белые колонии накалывались стерильными наконечниками для пипеток и высеивались на новые чашки. Те же наконечники использовались для заражения ПЦР смесей, приготовленных для проверки наличия вставки путем ПЦР. Такая ПЦР является, по сути, стандартной ПЦР для амплификации фрагмента, в которой вместо раствора ДНК в качестве матриц добавляются бактериальные клетки, несущие плазмиды. Обычно а такой ПЦР используются пары праймеров, распознающие последовательность вектора, фланкирующую вставку (SP67; М13 forward-M 13reverse).
Синтез кДНК путем обратной транскрипции
Синтез одноцепочечной кДНК проводился при помощи "First Strand cDNA Synthesis Kit" (Amersham) с использование олиго-dT праймера, согласно протоколу изготовителя. Одноцепочечная кДНК использовалась для RT ПЦР и 3 RACE ПЦР. Для 5 RACE ПЦР синтезировалась двуцепочечная кДНК описанным ниже способом: Компоненты реакции аккуратно перемешивались и инкубировались при 16 в течение двух часов. Затем в раствор добавлялось 2 мкл Т4-ДНК полимеразы (5 ед/мкл), чтобы затупить концы полученных двуцепочечных молекул, и инкубация при 16 продолжалась еще 5 минут. Затем пробирка помещалась на лед, и реакция останавливалась путем добавления в раствор 10 мкл 0.5 М ЭДТА рН 8. Затем в пробирку добавлялось 160 мкл смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирита (25:24:1), содержимое интенсивно перемешивалось и центрифугировалось при комнатной температуре со скоростью 14000 g в течение пяти минут.
После разделения фаз 140 мкл водного супернатанта отбирались в отдельную пробирку, туда добавлялось 70 мкл 7.5 М ацетата аммония, и ДНК осаждалась из раствора 500 мкл холодного абсолютного этилового спирта. Осадок центрифугировался со скоростью 14000 g в течение 20 минут при комнатной температуре, промывался 70% этанолом, высушивался на воздухе и перерастворялся в 50 мкл воды или 10 mM Tris-HCl рН 8. Для использования двуцепочечной кДНК в качестве матрицы при 5 RACE ГЩР, к ней необходимо прилигировать адапторные последовательности. В данной работе мной использовались так называемые сплинкеретты (Devon et al., 1995). Сплинкеретта (Рис, 6.1)- это двуцепочечная молекула ДНК, состоящая из «верхней» цепи и «нижней» цепи, которая в своей 5 области комплементарна верхней цепи, а в своей 3 части формирует шпильку. Такой адаптер увеличивает специфичность 5 RACE ПЦР, поскольку внешний гнездовой праймер к сплинкеретте (голубой треугольник на Рис. 6.1В) не имеет сайта отжига до тех пор, пока в первом цикле ПЦР, в котором работает только внешний гнездовой специфический праймер (черный треугольник на Рис. 6.1В), не будет построена полностью комплементарная верхней цепи сплинкеретты цепь ДНК. Отжиг цепей адаптера проводился так: верхняя и нижняя цепи сплинкеретты смешивались в экв и молярных количествах, нагревались в ПЦР-машине до 94 в течение трех минут, затем инкубировались пять минут на 50 и потом медленно остывали вместе с блоком ПЦР-машины до комнатной температуры. Реакция лигирования осуществлялась по следующей схеме: при температуре 16 . Затем лигаза инактивировалась десяти минутным нагреванием до 65, а неприлигировавшиеся сплинкеретты удалялись из раствора путем фильтрации через колонку "Microcon YM 50" согласно инструкции производителя.
В ходе данной работы ПЦР (Saiki et al., 1985) использовалась во множестве приложений. В каждом индивидуальном случае метод модифицировался, в зависимости от цели эксперимента. Этот полуколичественный метод применялся для сравнительной оценки уровня экспрессии генов на разных стадиях развития. Сначала концентрации двух или более 107 образцов кДНК уравнивались. Это проверялось путем контрольных ПЦР с праймерами против Р-актина (fi-actin; 19 циклов ПЦР) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH; 27 циклов ПЦР). Затем кДНК с одинаковыми концентрациями использовались в ПЦР с праймерами против исследуемых генов. Водный контроль (без добавления матричной кДНК) и контроль выравнивания концентраций (праймеры против GAPDH или актина) ставились в каждом случае. Результаты ПЦР анализировались на 1-2% агарозном геле. Чтобы получить фрагменты последовательности, лежащие 3 относительно известного участка гена, применялась 3 RACE ПЦР. В этом случае синтезировалась пара гнездовых специфических праймеров, распознающих известный участок. В качестве обратного использовался праймер, распознающий адапторную последовательность на олиго-dT праймере (см. Рис. 6.1), применявшемся для обратной транскрипции. Затем проводилась полугнездовая ПЦР. В первой реакции использовались внешний специфический праймер и праймер против адаптера, затем продукт реакции разбавлялся 1:100, и 1 мкл его использовался во второй ПЦР, в которой брались внутренний специфический праймер и праймер против адаптора. Для увеличения специфичности в RACE ПЦР использовалась "Platinum Taq DNA Polymerase" (Invitrogen), которая работает по принципу «горячего старта». Фермент в этом случае связан с антителом, которое отсоединяется от активного центра полимеразы только при нагревании до определенной температуры и не позволяет неспецифической активности до первого цикла ПЦР. Схема реакции представлена ниже: Здесь был использован принцип "touch-down". Та первого цикла выбиралась равной Tm+4 . Затем, в каждом последующем цикле температура отжига понижалась на 0.5 (ДТ—0.50), покрывая за 10 циклов промежуток в 5. Это позволяет использовать наиболее жесткие условия отжига праймера для того, чтобы создать статистическое предпочтение в пользу специфических продуктов ПЦР относительно неспецифических продуктов. Вторая часть ПЦР-программы была такой же, как и для стандартной амплификации фрагмента ДНК. Во второй реакции использовался разведенный 1:100 продукт первой реакции. С ним проводилась ПЦР из 40 циклов, согласно схеме для амплификации фрагмента ДНК.
Чтобы получить фрагменты последовательности, расположенные 5 относительно известного участка, применялась 5 RACE ПЦР. В качестве матрицы бралась двуцепочечная кДНК со сплин кереттами, и с ней проводилась ПЦР с гнездовыми праймерами. В первой реакции, проводимой по принципу "touch-down", использовались внешний специфический праймер и внешний праймер против сплинкеретты. Схема реакции, в сущности, совпадала со схемой первой реакции 3 RACE ПЦР, за исключением использования "Expand Long Template polymerase mix" (Roche), в тех случаях, когда при использовании "Platinum Tag DNA Polymerase" (Invitrogen) не было получено отчетливых ПЦР-фрагментов. Продукт первой реакции разводился 1:100, и 1 мкл использовался во второй ПЦР, в которую брались внутренний специфический праймер и внутренний сплинкереттный праймер. Как и в случае 3 RACE ПЦР, вторая реакция представляет собой простую амплификацию фрагмента.
