Введение к работе
Применение методов молекулярного маркирования объектов исследования позволяет существенно повысить точность и достоверность классификационных построений в биологии. Это очень хорошо заметно на примере микробиологических исследований. Наряду с классическими биохимическими методами (определение состава жирных кислот, сравнительное исследование профилей экспрессируемых белков и проч.), в последнее время широко применяются методы, основанные на анализе разнообразных ДНК-маркеров. Например, таксономию прокариот уже невозможно представить без филогенетического анализа генов рибосомных РНК, а селекционную работу в животноводстве - без ведения молекулярного паспорта родительских особей и их потомства. Из широкого множества методов, предлагаемых современной молекулярной биологией, исследователю остается только выбрать тот, который способен обеспечить необходимую точность ответа на поставленные вопросы. И здесь в первую очередь принимается во внимание разрешающая способность метода. Так, например, методы случайного фингерпринтинга (АР-ПЦР), основанные на применении неспецифичных праймеров, дают информацию о полиморфизме сразу многих генетических локусов одновременно, поэтому такие методы, как RFLP- или AFLP-ПЦР, несмотря на их относительно высокую трудоемкость, до сих пор считаются одними из наиболее перспективных маркерных систем для подробного генетического картирования, в особености, для идентификации индивидуумов. В то же время информация, касающаяся отдельно взятого генетического локуса, при применении указанных методов существенно более ограничена, чем получаемая в результате, к примеру, SSR-маркирования, которое ориентировано на выявление определенных нуклеотидных последовательностей и предоставляет обширную информацию об ограниченном числе молекулярных мишеней. Такого рода информация, как правило, используется для эволюционных построений и таксономических построений. Самым типичным молекулярным монолокусным маркером является ген, кодирующий малую субъединицу рибосомной РНК - 16S рДНК у прокариотических организмов, и в то же время для филогенетических построений у прокариот все чаще и чаще используют и альтернативные маркеры, разрабатываемые на основании последовательностей некоторых функциональных генов. Методы фингерпринтинга и анализа сходства конкретных последовательностей не исключают, а взаимно дополняют друг друга - методы сравнительного анализа конкретных последовательностей недостаточно достоверно работают на внутривидовом уровне, а методы фингерпринтинга - на межвидовом. При окончательном выборе конкретного молекулярного маркера в качестве инструмента исследования в первую очередь принимаются в расчет вопросы доступности технологических ресурсов для его осуществления, а также стоимости получаемых данных. Следует оговориться, что это не всегда возможно. Так, например, для описания нового вида прокариот необходимым является проведение анализа первичной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих 16S рРНК, и этот молекулярный маркер, согласно решению Международного таксономического комитета, не может быть заменен никаким альтернативным, хотя при окончательном решении вопроса о таксономической принадлежности нового организма в спорных случаях во внимание могут быть приняты и данные геномного фингерпринтинга, и данные по другим альтернативным молекулярным маркерам.
Помимо широкого применения в области фундаментальной науки, методы молекулярного маркирования имеют и вполне конкретную практическую востребованность. К примеру, известный метод установления отцовства/материнства, основанный на применении ПЦР для одновременного выявления молекулярных маркеров, относящихся к десятку и более генетических локусов. Точность этого метода настолько высока, что он принят для практического использования практически во всем мире. Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, широко применяемые в медицинской практике, также основаны на применении молекулярных маркеров, в данном случае высокоспецифичных по отношению к конкретным мишеням - уникальным участкам геномной ДНК патогенных микроорганизмов определенной штаммовой и видовой принадлежности. Не менее актуальной в настоящее время является проблема идентификации конкретных генно-инженерных модификаций в растительном сырье и полученных на его основе продуктах питания, когда только высокоспецифичные молекулярные маркеры способны различать абсолютно одинаковые по всем остальным параметрам (в том числе и по уровню экспрессии чужеродного белка) линии трансгенных растений и только их применение позволяет отделять проверенные на биобезопасность разрешенные линии трансгенных растений от трансформационных событий, не прошедших столь подробную проверку и не допущенных к практическому применению. Так, в 2000 году в США произошло случайное попадание кормовой кукурузы StarLink в пищевые продукты, а в 2005 году на поля по ошибке была выпущена трансгенная кукуруза несертифицированной линии BtlO вместо разрешенной к применению линии Btl 1. Убытки из-за этих ошибок превысили миллиард долларов (Macilwain, 2005).
