Содержание к диссертации
Введение
Глава I. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРО
ВАНИЯ ЦИСТАТИОНАЗА 8
1. Пересульфирование - основа метаболизма серу-содержащих аминокислот 8
2. Цистатионаза из различных источников 12
3. Методы выделения и очистки /-цистатионазы из печени крыс 16
4. Спектральные свойства препаратов, их молекулярная масса и содержание пиридоксальфосфата 20
5. Макромолекулярная структура 24
6. Ферментативные реакции, катализируемые у-циста тионазой.
Механизм десульфирования ь-цистеина и расщепления % -замещенных L -аминокислот 25
7. Строение активного центра Y -цистатионазы 32
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава II. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛЫ 40
Глава Ш. ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА 52
1. Выделение и очистка У -цистатионазы 52
2. Кристаллизация фермента 59
3. Характеристика препаратов фермента 61
Глава ІV. ИССЛЕДОВАНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДИСТАТИОНАЗЫ 72
1. Вторичная структура фермента 72
2. Влияние додецилсульфата натрия на конформа-ционные изменения молекулы фермента 78
Глава V. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ЦИСТАТИОНАЗЫ 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92
ВЫВОДЫ 98
ЛИТЕРАТУРА 100
- Пересульфирование - основа метаболизма серу-содержащих аминокислот
- МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛЫ
- Выделение и очистка У -цистатионазы
- Вторичная структура фермента
- ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ЦИСТАТИОНАЗЫ
class1 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРО
ВАНИЯ ЦИСТАТИОНАЗА class1
Пересульфирование - основа метаболизма серу-содержащих аминокислот
Пересульфирование - процесс переноса серы между гомоцистеи ном и цистеином - играет большую роль в метаболизме живых орга низмов. Оба направления переноса серы и ферментативные механизмы их осуществления различны в различных таксономических группах организмов. У животных (рис. 1в) процесс пересульфирования необ ратимо протекает в одном направлении: гомоцистеин -цистеин. В этом процессе принимают участие два различных пиридоксалъфос-фат-зависимых фермента. Один из них - цистатионинсинтаза (К.Ф. 4.2.1.22),синтезирующая тиоэфир L -цистатионина из L-го-моцистеина и L -серина, осуществляет реакцию по типу j3 -замещения, в то время как второй Jf-цистатионаза (К.Ф. 4ЖІ.І),катализирует реакцию -расщепления L -цистатионина с образованием цистеина, ot -кетомасляной кислоты и аммиака. Рассматриваемая ферментативная система многие годы привлекает внимание исследователей.
Методы исследования и материалы
Диок-электроФорез проводили по методу Вебера-Осборна ГI28J в 7,5 % и 10 %-ноы полиакрилаыидном геле в 0,005 II К-фосфатном буфере, рН 7,3, в цилиндрических трубочках о внутренним диаметром б мм и длиной 100 мм. В каждую трубочку вносили по 0,01 мл раствора, содержащего от 20 до 100 мкг фермента, денатурированного X %-ным додецилсульфатом натрия. Электрофорез проводили при силе тока 5-7 та на трубочку и напряжении 120-200 В. По окончании фореза столбики геля переносили в 0,25 %-ный раствор кумаси-бриллиант синего R-250 и окрашивали в течение 2 часов. Краситель отмывали в водяной бане при температуре 60 смесью 7,5 %-то раствора уксусной кислоты и 5 %-ного раствора метанола. Гели хранили в 7,5 %-ном растворе уксусной кислоты.
Определение активности. Активность -цистатионазы определяли по реакции дезаминирования ь-гомосерина, путем измерения скорости образования о -кетомасляной кислоты - одного из конечних продуктов реакции. Определение оС -кетомасляной кислоты проводили двумя методами.
Колориметрический метод [ 93 J основан на измерении оптической плотности при 515 нм тёмнокрасного раствора, содержащего 2,4-динитрофенилгидразон - продукт реакции Ы -кетомасляной кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-динитрофенилгидразиновый реактив готовят, растворяя 50 мг 2,4-динитрофенилгидразина в 10 мл концентрированной соляной кислоты и добавляя к полученному раствору 40 мл воды).
Для определения ферментативной активности пробы (объем -2 мл), содержащие Ю"2 М ь-гомосерина, 5»Ю""5 М ЭДТА, 5» 10" М ПЛФ, I0""1 М калий-фосфатного буфера при рН 8,0 и 10-20 мкг фермента, инкубировали при 37 в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 25 % ЕСУ. После центрифугирования отбирали из надосадочной жидкости аликвоту объемом 0,5 мл, к ней прибавляли 1,5 мл воды и I мл 2,4-дшштрофенилгидразинового реактива. Прлученную смесь выдерживали при температуре порядка 25 в течение 20 мин. Затем к пробе добавляли 5 мл 1,5кг шон и через 10 мин измеряли оптическую плотность. При определении оптической плотности в качестве раствора сравнения использовали контрольную пробу, в которой раствор фермента был заменен Ю"1 М К-фосфатным буфером, рН 8,0.
За единицу активности (Е) фермента принимали такое количество его, которое в указанных условиях образует I мкмоль кетомасляной кислоты за I час. При построении калибровочной кривой (рис. 4) стандартом служил Жа-кетобутират.
Выделение и очистка У -цистатионазы
Были разработаны и использованы два варианта метода выделения и очистки )С -цистатионазы.
В варианте А этот процесс состоит из пяти стадий: получение гомогената, прогревание раствора фермента, осаждение белка сульфатом аммония, осаждение белка этанолом и ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефацеле. В варианте Б отсутствует стадия прогревания и вместо хроматографии на ДЭАЭ-сефацеле использовали хроматографию на гидроксиапатите и гель-фильтрацию на сефадексе Q-I50.
Получение гомогената. Для получения фермента использовали печень 3-4-месячных крыс-самцов, выращенных в стандартных условиях вивария. Установлено, что печень крыс в этом возрасте наиболее богата -цистатионазой. Показано, что для получения исследуемого фермента можно использовать не только свежевыделенную, но и замороженную печень крыс со сроком хранения при -50 до б месяцев. При этом удельная активность гомогената составляет 3,4-3,6 мкмоль ч"1 на мг белка, что лежит в пределах ВОЗМОЖНЕЙ погрешностей эксперимента. Как показали анализы гомогенатов, на активность у-цистатионазы не оказывает влияния предварительное оттаивание печени в теплой воде (37-40), а также 12-часовое хранение при температуре 8.
Подготовленную печень промывали холодной дистиллированной водой и гомогенизировали с двумя объемами 1,2 $-ного раствора КС1, содержащего Ю"4 М ПЛФ, Ю"4 М ДТТ и 5«I0 3 М ЭДТА. Гомогенизацию проводили в течение трех минут при скорости 8000 об/мин. Экстракт отделяли центрифугированием в рефрижераторной центрифуге (I час при I2000g ). Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость использовали для дальнейшей обработки.
Фракционная денатурация нагреванием. V-Цистатионаза является относительно термостабильным ферментом, что позволило при очистке использовать для освобождения от баластных белков стадию прогревания. При нагревании гомогената употребляли три водяные бани: с t в 80, с t = 60 и t = 4-8. Круглодонную колбу с широким дном менее чем наполовину наполняли гомогенатом, помещали в первую баню и при быстром помешивании доводили до 60; после этого колбу переносили во вторую баню и выдерживали 10 мин при постоянном перемешивании. Для охлаждения переносили в третью баню и баластный белок, выпавший в осадок, отделяли центрифугированием в течение I часа при 12000 g.
Вторичная структура фермента
Наиболее полную информацию о структуре ферментов можно получить методом рентгеноструктурного анализа. Однако на современном этапе исследований -цистатионазы с целью получения информации о вторичной структуре фермента, его конформационной подвижности и факторов, влияющих на нее, представлялось целесообразным применить метод БД. Для этого были получены спектры КД в пептидной (от 200 до 250 нм) и ароматической (от 250 до 320 нм) областях спектра холофермента У-цистатионазы (полученного с прогреванием и без прогревания), ее апофермента, фермента, восстановленного NaBB, , и фермента, ингибированного DL-пропаргил-глицином. Все исследованные препараты находились в растворе 0,05 Ш К-фосфатного буфера, рН 7,5. На рис. 12 приведены спектры КД, полученные в пептидной области. Как видно из рисунка, все спектры близки друг к другу. По этим спектрам была определена вторичная структура исследованных форм фермента.
Исследование четвертичной структуры цистатионазы
Большинство глобулярных белков с молекулярной массой, превышающей 40 кД, являются олигомерами. Выяснение четвертичной структуры фермента, регуляции его активности, процессов диссоциации комплекса субъединиц входит в круг принципиальных проблем ферментативного катализа.
Степень диссоциации ферментного комплекса зависит от целого ряда факторов - от концентрации белка, значения рН раствора, температуры, ионной силы среды, концентрации специфических регуляторов и др.
В частности, у ПЛФ-зависимых ферментов в большинстве случаев удаление кофермента, повышение значения рН и низкая концентрация белка смещают равновесие в пользу мелких частиц (моно- или диме-ров) [ 35 J.
Как следует из обзора литературы (см. стр.24 ) вопрос об олигомерном строении -цистатионазы и о факторах, влияющих на ее диссоциацию, во многом еще остается не выясненным. Вследствие этого представляется целесообразным исследовать четвертичную структуру фермента независимыми методами: электронной микроскопией и гель-фильтрацией.
На рис. 17 представлена электронная микрофотография нативной /-цистатионазы. Вид фермента зависит от проекции, в которой изображен олигомерный комплекс. Чаще всего встречаются структуры, состоящие из четырех глобулярных частиц, реже из двух.
