Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. Равновесные и кинетические исследования денатурации и ренатурации белков 9
2.1. Основные определения 9
2.2. Равновесные состояния белков в различных денатурирующих условиях 12
2.2.1. Денатурация хлоридом 13
2.2.2. Денатурация другими солями гуанидина 19
2.2.3. Денатурация мочевиной 21
2.2.4. Температурно-денатурированное состояние 22
2.2.5. Денатурация изменением рН 33
2.2.6. Денатурация неорганическими солями 37
2.2.7. Другие типы денатурации 38
2.3. Промежуточные состояния на пути денатурации и ренатурации белков 41
2.3.1. Равновесные исследования
2.3.2. Кинетические исследования 46
2.4. Объекты исследования 53
2.4.1. Коровий о(-лактальбумин 53
2.4.2. Человеческий об-лактальбумин 62
2.4.3. Карбоангидраза В 64
3. Материалы и методы 71
3.1. Выделение и очистка препаратов 71
3.1.1. Коровий of-лактальбумин 71
3.1.2. Человеческий 0(-лактальбумин 73
3.1.3. Карбоангидраза В 74
3.2. Приготовление растворов 77
3.3. Методы исследования 78
4. Результаты и обсуждение 88
4.1. Промежуточные формы коровьего Об-лактадъбушна 88
4.1.1. Кислая форма 88
4.1.2. Тешературно-денатурированная форма 108
4.2. Промежуточные формы человеческого обчяактальбумина 112
4.3. Роль кальция в структуре оС-лактальбуминов 122
4.4. Промежуточные формы карбоангидразы В 124
4.4.1. Кислая форма 125
4.4.2. Промежуточная по гуанидинхлориду форма 136
4.5. Состояние расплавленной глобулы как особое физическое состояние белковой молекулы 137
4.5.1. Физическая природа состояния расплавленной глобулы 137
4.5.2. Фазовые переходы между нативным состоянием и состоянием расплавленной глобулы 142
4.5.3. Физические критерии нативности глобулярного белка 146
4.6. Кинетические исследования карбоангидразы В. Роль состояния расплавленной глобулы в самоорганизации белка 148
4.6.1. Кинетика ренатурации карбоангидразы В из развернутого состояния 149
4.6.2. Кинетика ренатурации карбоангидразы В из состояния расплавленной глобулы 151
4.6.3. Лежит ли состояние расплавленной глобулы на прямом пути сворачивания? 153
5. Заключение 154
6. Выводы 156
Список литературы 159
- Равновесные состояния белков в различных денатурирующих условиях
- Промежуточные состояния на пути денатурации и ренатурации белков
- Фазовые переходы между нативным состоянием и состоянием расплавленной глобулы
- Кинетика ренатурации карбоангидразы В из состояния расплавленной глобулы
Введение к работе
Как известно, структура белка формируется под действием нескольких основных сил: водородных связей, гидрофобных, ван-дер--ваальсовых и электростатических взаимодействий. Они имеют разную физическую природу и отвечают различным уровням структурной организации белка: водородные связи формируют вторичную структуру, гидрофобные взаимодействия определяют компактность белковой глобулы, ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия задают тонкие детали третичной структуры. Эти силы по-разному зависят от условий, в которых находится молекула белка, поэтому в определенных условиях возможно существование особых состояний белковой молекулы, соответствующих ослаблению или даже полному выключению одних внутримолекулярных взаимодействий, в то время как другие взаимодействия остались неизменными или даже усилились. Исследование таких состояний, промежуточных по своим свойствам между на-тивным и полностью развернутым состояниями, важно для понимания структурной организации белков и, в конечном счете, для выяснения механизмов функционирования этих важнейших биологических макромолекул. С другой стороны, интерес к подобным "промежуточным" состояниям связан с проблемой самоорганизации белка. В начале 60-х годов Анфинсен показал (см. /8/), что рибонуклеаза, денатурированная 8 М мочевиной с разорванными дисульфидными связями, способна восстанавливать нативную структуру и нативные s-s -связи после устранения воздействия денатуранта. Это означает, что вся информация, необходимая для процесса сборки белка, заложена в его первичной структуре - последовательности ковалентно сшитых аминокислотных остатков. Но как белок реализует эту информацию,
есть ли на пути сворачивания промежуточные "частично-свернутые" состояния, отличные как от нативного, так и от полностью развернутого белка? Получение таких состояний в условиях термодинамической стабильности и их детальное изучение необходимо для понимания пути самоорганизации белка и, в конечном счете, для предсказания пространственной структуры белков на основе известной первичной структуры.
Изучение денатурации белков и различных денатурационных состояний ведется уже давно, однако первое систематическое детальное исследование связано с именем Тэнфорда и его школы. В результате целого ряда экспериментальных работ, выполненных в 60-е годы, Тэнфорд и его сотрудники показали, что различные денатурирующие воздействия приводят, вообще говоря, к различным результатам. Было показано, что при денатурации белков большими концентрациями сильно денатурирующих агентов, таких как гуанидинхлорид или мочевина, белковые молекулы переходят в состояние полностью развернутого (или сшитого дисульфидннми связями, если они сохранены) статистического клубка, лишенного каких-чяибо существенных элементов вторичной или третичной структуры. В то же время воздействие высоких температур, кислых или щелочных значений рН приводит к состояниям с сохраненными элементами структуры, отличным от полностью развернутого клубка. Однако ни в одном случае эти состояния не были охарактеризованы подробно. Дальнейшее развитие исследований денатурации белков связано с использованием прецезионной микрокалориметрической техники, в первую очередь с работами П.Л.Привалова и его сотрудников. В этих работах было показано, что тепловая денатурация глобулярных однодомевных белков проис-
ходит по принципу"все или ничего", без термодинамически стабильных промежуточных состояний, т.е. является фазовым переходом первого рода. Кроме того, выяснилось, что термодинамические характеристики белков, денатурированных высокими температурами или экстремальными значениями рН, близки к соответствующим характеристикам белков, денатурированных большими концентрациями гуанидин-хлорида или мочевины, и, таким образом, различные виды денатурации приводят к термодинамически подобным денатурированным состояниям. Отсюда был сделан кажущийся естественным вывод и об их структурной эквивалентности, т.е. о соответствии структуры состояний, денатурированных теплом или рН, статистическому клубку. А так как переход в температурно-денатурированное состояние происходит по принципу "все или ничего", то этот же принцип можно было отнести и к друтим денатурационным переходам, не оставляя, таким образом, надежды на получение термодинамически стабильных состояний, промежуточных между нативным и полностью развернутым белком. Однако дальнейшее изучение процессов денатурации белков показало, что это не так. Было показано, что денатурация некоторых белков (карбоангидразы В /9/, гормона роста /10/, А-лакто-глобулина /II/, коровьего /12/ и человеческого /13/ оС-лакталь-буминов) гуанидинхлоридом происходит в два этапа: вначале, при меньшей концентрации денатуранта, исчезает спектр кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области и только потом падает спектр кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области. Это означает существование термодинамически стабильных промежуточных состояний таких белков с разрушенным уникальным пространственным окружением ароматических боковых групп, но с сохра-
вившейся вторичной структурой. Для коровьего оС-лактальбумина также было показано /12/, что его промежуточное состояние по своим спектральным свойствам близко к кислой форме этого белка, наблюдаемой при рН 2. Кинетические исследования денатурационных переходов в коровьем о(-плактадьбумине /14/ и карбоангидразе В /15/ позволяли предположить, что термодинамически стабильные промежуточные состояния этих белков могут являться также кинетическими промежуточными состояниями (интермедиатами) на пути их самоорганизации. Промежуточные состояния коровьего об-лактальбу-мина (особенно его кислая форма) и других белков исследовались в последние годы в разных лабораториях, однако полученные до сих пор данные были неполными и не позволяли построить детальную непротиворечивую модель этого состояния.
Исходя из вышеизложенного, мы предприняли комплексное исследование кислой и других промежуточных форм коровьего и человеческого оС-лактальбумишв и карбоангидразы В рядом физических методов с целью детально охарактеризовать их структуру. В результате этого исследования мы показали, что все эти формы относятся к одному и тому же термодинамическому состоянию, называемому сейчас "состоянием расплавленной глобулы", отвечающему разрушению ван--дер-ваальсовых и других специфических внутримолекулярных взаимодействий в белке, в то время как водородные связи в главной цепи и гидрофобные взаимодействия, в основном, сохранились. Мы предложили модель этого состояния в виде компактной глобулы с близкой к нативной вторичной структурой, но со значительными флукту-ациями пространственной структуры, прежде всего с фпуктуациями конформации и взаимного расположения боковых групп. Нами проведе-
но также исследование кинетики ренатурации карбоангидразы В, показавшее, что состояние расплавленной глобулы накапливается в процессе ренатурации карбоангидразы и, таким образом, может служить кинетическим интермедиатом на пути сворачивания этого белка. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, разделов "Материалы и методы" и "Результаты и обсуждение", заключения, выводов и списка литературы. Во введении кратко обоснованы и сформулированы задачи исследования. Литературный обзор посвящен анализу литературных данных, касающихся денатурации и ренатурации белков, а также промежуточных состояний на пути денатурации и ренатурации. В разделе "Материалы и методы" кратко описаны использованные материалы и методы, а также методика и техника измерений. Полученные результаты исследований и их анализ приведены в разделе "Результаты и обсуждение". В конце диссертации даны заключение и выводы. Диссертация написана на основании материалов, изложенных в работах /1-7/.
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Равновесные и кинетические исследования денатурации и ренатурации белков
Равновесные состояния белков в различных денатурирующих условиях
В настоящее время имеются обширные экспериментальные данные, показывающие, что при денатурации белков 6 М іуанидинхлоридом и 8 М мочевиной их структура, как правило, представляет собой статистический клубок. Для доказательства этого факта обычно измеряется какой-либо физический параметр денатурированных белков и сравнивается с соответствующим параметром для синтетических полипептидов в состоянии статистического клубка или для смеси аминокислот (кроме того, для сравнения иногда используют теоретические расчетные данные ддя статистических клубков). Очевидно, во всех этих случаях невозможно полностью исключить сохранение какой-либо остаточной структуры в очень небольших количествах (в пределах точности экспериментальных данных). Поэтому вывод о том, что белок действительно является статистическим клубком в каких-либо денатурирующих условиях может быть сделан только на основе многих экспериментов, охватывающих различные физические параметры. Сейчас это можно считать доказанным для таких денатурирующих агентов, как 6 М гуанидинхлорид и 8 М мочевина (последняя, однако, переводит: в состояние статистического клубка не все белки - см. далее). Рассмотрим более детально имеющиеся в литературе экспериментальные данные по этим вопросам.
Систематическое исследование состояния белков в концентрированных (обычно 6 М) растворах гуанидинхлорида началось в середине 60-х гг. со ставших уже классическими работ Тэнфорда с сотрудниками. Прежде всего было показано, что для ряда белков без s-s связей или с разорванными ft-меркаптоэтанолом дисульфидами связями в 6 М ГХЯ оказываются справедливыми соотношения зависимости характеристической вязкости и константы седиментации от длины полипептидной цепи, характерные для полимеров в состоянии статистического клубка. На примере 9 белков было показано /18/, что их характеристическая вязкость [ЦІ связана с числом аминокислотных остатков в полипептидной цепи белка п соотношением
Величина показателя степени при п близка к аналогичному показателю для статистических полимерных клубков /19/. Тому же уравнению подчиняются также 3 белка в 5 М іуанидинхлориде /18/ (это свидетельствует, что, по крайней мере, в некоторых случаях состояние статистического клубка достигается уже при 5 М, а, возможно, и более низких концентрациях гуанидинхлорида). Кроме того, в других лабораториях были получены аналогичные результаты, свидетельствующие о справедливости соотношения (I) и для рада других белков /20, 21/.
Исследование седиментационных характеристик белков в концентрированных растворах гуанидинхлорида в присутствии в -мер-каптоэтанола также выявило наличие зависимости, характерной для статистических клубков. Константа седиментации, экстраполированная к нулевой концентрации, s для 12 белков в этих условиях оказалась связанной с длиной полипептидной цепи белков соотношением где ЯГ - парциальный удельный объем белка и р - плотность раствора. Показатель степени 0,47 при п в уравнении (2) также характерен для статистических клубков /22/. Таким образом, поведение белков без дисульфидных связей (или с разорванными связями) в концентрированных растворах ГХІ по своим гидродинамическим характеристикам, а именно, характеристической вязкости и константе седиментации, хорошо соответствует поведению полимерных цепей в состоянии статистического клубка, детально исследованному теоретически и экспериментально в физической химии полимеров.
Состояние белков в концентрированных растворах гуанидинхло-рида хорошо изучено также оптическими методами. Первое систематическое исследование было проведено Тэнфордом с соавторами в работе /23/, в которой были получены кривые дисперсии оптического вращения для ряда белков и рассчитаны параметры а0 и ъ уравнения Моффита-Янга /24/ денатурированных белках. В данном случае, однако,нельзя утверждать, что вторичная структура рассмотренных белков в концентрированных растворах ГХІ соответствует статистическому клубку только на основании параметра ъо, т.к. величина ъо близка к нулю и для антипараллельной ft-структуры. Поэтому Тэнфордом /26/ также был проведен расчет величины оптического вращения для ряда белков без дисульфидных связей в 6 М ТШ на основе известного аминокислотного состава и величин [т ] для отдельных аминокислот, полученных из данных по модельным пептидным соединениям (с учетом различного вклада концевых и внутренних аминокислот). Рассчитанные величины оптических вращений денатурированных белков для трех длин волн (300, 400 и 589 нм) оказались близки к экспериментальным значениям, что говорит об отсутствии оптических эффектов, связанных с регулярным взаимным расположением аминокислотных остатков. Эти результаты, как и данные гидродинамических методов, также свидетельствуют в пользу клубкообразной конформапии белков в концентрированных растворах ПИ.
Исследование ряда белков без дисульфидных связей в 6 М гуа-нидинхлориде методом кругового дихроизма, проведенное в работе /27/, показало, что особенности спектров кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области, хорошо выраженные в нативных белках, полностью исчезают в б М ГХД; типичный спектр развернутого ГХЛ белка характеризуется небольшой отрицательной эллиптичностью в районе 220-240 нм и "завалом" в области 210-220 нм. Правда, спектры .9 исследованных белков в 6 М ГХІ совпадают не полностью (удельная эллиптичность при 220 нм колеблется в пределах (1-2)-103 град»см2/дмоль). Однако это, как считают авторы работы /27/, объясняется различием в аминокислотных составах этих белков, а не сохранением небольшой части вторичной структуры в каких-либо из них, т.к. спектры модельных полипептидных соединений в состоянии статистического клубка также несколько различаются между собой и лежат в той же области, что и спектры денатурированных белков /27/. Спектры, подобные приведенным в работе /27/, были получены и для других белков в 6 М ГХІ /28, 29/. в том числе и для рибосомальных белков /30/. В ближней ультрафиолетовой области спектры белков в 6 М ТШ практически полностью отсутствуют /26/, что свидетельствует о симметричном окружении ароматических боковых групп в этих условиях, и, таким образом, подтверждает отсутствие жесткой структуры белка вблизи ароматических групп.
Промежуточные состояния на пути денатурации и ренатурации белков
В настоящее время в литературе имеются весьма обширные экспериментальные данные по температурной денатурации белков и состоянию, получаемому в результате этого процесса. Они свидетельствуют о том, что температурная денатурация не приводит к полному разворачиванию белков (хотя в ряде случаев некоторые физические характеристики этого состояния очень слизки к характеристикам статистического клубка), а дает особое состояние, близкое термодинамически к статистическому клубку, однако структурно отличающееся от него. Рассмотрим детально эти экспериментальные результаты. Однако прежде отметим одну, существенную, на наш взгляд, методическую трудность, осложняющую прямое сравнение того или иного параметра в температурно-денатурированном состоянии с соответствующими величинами для статистических клубков. Обычно в качестве последних используются белки в 6 М гуанидинхлориде или 8 М мочевине, хотя практически все экспериментальные данные, доказывающие соответствие белковых структур статистическому клубку в этих растворителях, получены для комнатной температуры. В то же время многие физические параметры белков зависят от температуры даже в 6 М ТШ или 8 М мочевине и этой зависимостью нельзя пренебрегать. Это означает, что у нас нет достаточно надежного критерия статистического клубка при высоких температурах. В то же время некоторые экспериментальные данные указывают на то, что поведение белков в 6 М ЕХЛ и 8 М мочевине может отличаться от поведения статистических клубков. Так, в работе /54/ было показано, что при нагревании ряда белков с разорванными дисульфидны-ми связями в 6 М ТШ и одного из них (овальбумина) в 9 М мочевине от 25С до 55С их характеристическая вязкость падает в 1,5-3 раза (для белков с интактными дисульфидными связями этот эффект значительно слабее), что говорит о существенном уменьшении молекулярных объемов этих белков (статистических клубков при 25С) при нагревании. Поэтому, с нашей точки зрения, особенно интересны те работы, где приводятся прямые экспериментальные данные, свидетельствующие о сохранении (или несохранении) остаточной структуры в температурно-денатурированной форме белков.
Одно из первых экспериментальных исследований гидродинамических свойств температурно-денатурированной формы белка было проведено для рибонуклеази А в работе /55/, где показано, что характеристическая вязкость температурно-денатурированной рибонуклеази с интактными дисульфидными связями при рН 2,8 равна 5,9-6,0 см3/г в интервале температур 50-65С. Позже для этого же белка были получены величины характеристической вязкости 6,5 см3/г (рН 6,0; 60С /56/) и 9,1 см3/г (рН 2,2; 44С /57/). Последнее значение близко к величине 9,4 см3/г характеристической вязкости рибонуклеази с интактными дисульфидными связями в 6 М ГХІ при комнатной температуре /57/, однако, как мы уже отмечали, такое сравнение должно проводиться с осторожностью и, строго говоря, не является доказательством соответствия структуры белка в этих условиях статистическому клубку. Значительная разница в величинах характеристической вязкости в работах /55-57/ может быть связана с разными температурами, при которых проводились измерения и различными значениями рН среды. Не исключено, что понижение рН от изоэлектрической точки белка (т.е. рост электростатического заряда молекулы) приводит к увеличению характеристической вязкости вследствие разбухания молекулы (не являющейся статистическим клубком при нейтральных значениях рН и высокой температуре) из-за внутримолекулярных электростатических взаимодействий /26/. Для температурно-денатурированного химотрипсиногена в работе /58/ было получено значение характеристической вязкости 7 см3/г (что далеко от величины II см3/г для этого белка в 6 М ГИ с интактными дисульфидными связями при 25С /18/); кроме того, данные по дисперсии оптического вращения также не соответствовали характеристикам статистического клубка. Исследование температурной денатурации миоглобина, проведенное в работе /59/, показало, что этот белок в температурно-денатурированном состоянии также сохраняет участки остаточной структуры, т.к. единственный погруженный вглубь молекулы остаток тирозина в миоглобине остается погруженным также и после денатурации. Интересны данные Тэнфорда с сотрудниками /60/ по титрованию температурно-денатурированных белков гуанидин-хлоридом, являющиеся одним из веских аргументов, показывающих отличие температурно-денатурированного состояния от статистического клубка. Оказалось, что добавление ГХІ к температурно-денатуриро-ванным лизоциму, рибонуклеазе и химотрипсиногену приводит к кооперативному S -образному переходу, тестируемому по величине приведенного молярного вращения [шО, причем по амплитуде этого перехода авторы сделали вывод о сохранении до 25$ нативопо-добной вторичной структуры в температурно-денатурированных белках.
Фазовые переходы между нативным состоянием и состоянием расплавленной глобулы
В последнее десятилетие для ряда белков было обнаружено несовпадение денатурационных переходов, отражающих разрушение пространственной структуры белка и его вторичной структуры. Так, для карбоангидразы /9/ переход по удельной эллиптичности при 269 нм происходит при 1,4 М гуанидішхлорида, по разностному поглощению при трех длинах волн - при 1,8 М ТШ и по величине удельного оптического вращения при 400 нм - при 2,2 М (всюду даны середины переходов). В коровьем /12/ и человеческом /13/ о(-лакталь буминах также была обнаружена подобная ситуация при их денатурации ТШ: переход по удельной эллиптичности в ближней ультрафиолетовой области происходит при меньшей концентрации денатуранта, чем переход по удельной эллиптичности в дальней ультрафиолетовой области. Это свидетельствует о наличии промежуточного состояния (или состояний) с разрушенной пространственной структурой, но сохранившейся вторичной. При этом в работе /НО/ было показано, что для карбоангидразы это состояние компактно, а в работе /12/ обнаружено, что для коровьего о(-лактальбумина оно близко к кислой форме этого белка по спектральным свойствам. Более подробно свойства промежуточных состояний этих белков будут рассмотрены отдельно в разделах 2.4.1. и 2.4.3. Несовпадение переходов по разным параметрам обнаружено для гормона роста /10/, в котором переход по изменению разностного поглощения происходит раньше, чем переход по эллиптичности при 220 нм. Как и для о(-лакт-альбумина, промежуточное состояние гормона роста похоже на его кислую форму /10/. В в-лактоглобулине /II/ также переход по разностному поглощению и эллиптичности при 292 нм заканчивается при значительно меньшей концентрации гуанидинхлорида ( —3,8 М), чем сильно затянутый переход по эллиптичности при 220 нм ( 5 М). При этом последний переход имеет сложную форму: вначале, от —I М до 2 М ГХІ отрицательная эллиптичность при 220 нм несколько возрастает (на 10$), затем, от 2 М до —5 М ІХД, падает втрое. На основании начального роста отрицательной эллиптичности авторы делают предположение, что при 2 М ГХІ наблюдается промежуточное состояние, которое похоже на температурно-денатурированное состояние этого белка, также обладающее большей отрицательной эллиптичностью при 220 нм, чем нативныи белок. Однако в данном случае, по-видимому, не исключены эффекты, связанные с агрегацией ft-лактошобулина, хотя, чтобы уменьшить ее, эксперименты проводились при возможно более низких концентрациях белка. Исследование процесса денатурации пенициллиназы гуанидинхлоридом /III/ также показало несовпадение переходов по различным параметрам, т.е. существование промежуточных состояний для этого белка: с ростом концентрации ТІЛ вначале происходит переход по разностному поглощению и удельной вязкости, а затем по величине удельного оптического вращения при 234 нм. Однако детальное изучение промежуточного состояния, наблюдаемого при 0,84 М, позволило авторам сделать вывод /112/, что такое поведение связано с доменной структурой пенициллиназы и промежуточное состояние соответствует разрушению жесткой связи между двумя доменами при сохранении, в основном, структуры каждого из них. К сожалению, авторы не проводили денатурацию до 6 М ІЇЛ, а ограничились 3,5 М (по-видимому, с этим связано то, что денатуращонный переход по удельной вязкости прошел примерно на 90$ в 0,84 М гуанидинхлори-де, хотя характеристическая вязкость белка в этих условиях составляет всего 8 см3/г, а не 28 см3/г, что должно быть для статистического клубка). Недавно Вада /ИЗ/ предпринял исследование денатурации ряда белков гуанидинхлоридом, теплом и (в одном случае) изменением рН, тестируемой по нескольким физическим параметрам (поглощение, флуоресценция, ЕД в дальней и ближней ультрафиолетовых областях, светорассеяние), очень точно регистрируемым с помощью специально сконструированной им аппаратуры. Он обнаружил, что в большинстве случаев переходы происходят не по принципу "все или ничего", а через промежуточное состояние. В работе /ИЗ/ приведены данные для 17 глобулярных белков и в II из них обнаружены промежуточные состояния. Все эти результаты свидетельствуют о том, что отклонение от двухстадийности процесса денатурации далеко не исключение и для многих белков денатурация идет через промежуточные состояния. Не исключено, что дальнейшее увеличение точности экспериментальных методик позволит зарегистрировать такие состояния и в других белках, в которых они пока не обнаружены.
В последнее десятилетие быстрое развитие кинетических методов исследования биополимеров, особенно методики "остановленной струи", позволило обнаружить промежуточные состояния в кинетике ренатурадии и денатурации многих белков. В этом случае тестом на существование промежуточных состоянии является, во-первых, несовпадение кинетик, регистрируемых различными методами и, во-вторых, несоответствие кинетических кривых одной экспоненте (что должно выполняться для перехода по принципу "все или ничего"). Однако, как выяснилось в последнее время, причиной несоответствия кинетических кривых моноэкспоненте часто является цис-транс изомеризация пролиновых остатков, что, очевидно, не имеет прямого отношения к пути самоорганизации белковой молекулы. Впервые предположение о роли изомеризации пролинов в процессе рена-турации рибонуклеазы А было выдвинуто в работе /114/ для объяснения того факта, что в развернутом состоянии этого белка было обнаружено /115/ две фракции ир и tig, первая из которых сворачивается быстро ( 50 мс), вторая медленно (--20 с), дающих, однако, при ренатурадии один и тот же конечный продукт. Еыла предложена модель, согласно которой фракция ug соответствует развернутой молекуле с "ненативными" изомерами пролина и при сворачивании она должна вначале перейти в ир путем изомеризации пролиновых остатков, что и является лимитирующей стадией процесса.
Кинетика ренатурации карбоангидразы В из состояния расплавленной глобулы
Данных по человеческому оС-лактальбумину (ЧМ) в литературе значительно меньше, чем по коровьему. Это глобулярный белок, подобный КМ (80$ аминокислотных остатков гомологичны по первичной структуре; большинство замен консервативны, т.е. не меняют основных свойств остатков) с молекулярным весом 14083, 4 S-S -связями и без свободных SH -групп /165/. В отличие от коровьего об-лактальбумина человеческий белок содержит не 4, а 3 остатка триптофана. Так же, как и в случае КМ, для ЧМ существует "кислый" переход /166/, а при его равновесной денатурации гуани-динхлоридом наблюдается стабильное промежуточное состояние с выраженным спектром КД в дальней ультрафиолетовой области (причем эллиптичность при 220 нм у А-формы человеческого об-лакталь-бумина в 1,5 раза выше, чем у N -формы), но не обладающее спектром БД в ближней ультрафиолетовой области /166/. При этом промежуточное состояние, в отличие от аналогичного состояния КМ, может быть получено практически в чистом виде при 1,85 М ІХЛ, так как денатурадионные переходы по эллиптичности при 224 нм и 270 (или 293) нм достаточно сильно разнесены. Это промежуточное состояние отличается, однако, от А-формы белка по спектрам кру-говорого дихроизма, особенно в дальней ультрафиолетовой области. Кинетические исследования показали, что переход из кислой формы ЧЗД в полностью развернутую происходит за время, меньшее I мс /166/, что позволило авторам предположить, что этот переход является переходом типа спираль-клубок. В работе /166/ дается следующая модель сворачивания человеческого оС лактальбумина:
Здесь N -нативное состояние белка, А0 - промежуточное состояние, наблюдаемое в 1,85 М гуанидинхлорида, а Ат и А_п - семейство в различной степени спирализованных форм полипептидной цепи, причем кислая форма белка соответствует смещению в направлении Ат, а полностью развернутая - в направлении А_п. Исследование модификации остатков триптофана /167/ человеческого оС-лакталь-бумина 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом показало, что триптофан 60 в человеческом белке значительно более реакционноспособен, чем в коровьем, что говорит о разных окружениях этого остатка в двух белках, и реакционная способность триптофановых остатков ЧЯА несколько увеличивается при рН 2,7 по сравнению с рН 7. Кроме того, авторы работы /167/ делают вывод, что триптофан 118 находится на поверхности молекулы, а триптофани 60 и 104 частично заглублены, так что реактиву доступны только отдельные участки индольных колец. Человеческий о(-лактальбумин,так же как и коровий, связывает один ион кальция на молекулу белка /161/, а отнятие связанного кальция также сильно понижает его термостабильность /164/.
Коровья карбоангидраза В (КАВ) - глобулярный цинк-связываю-щий белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярным весом 29000, содержащий один атом цинка на молекулу белка /168/. Карбоангидраза катализирует реакцию гидратации углекислоты: С02 + Н20 з г НС03" + Н \ кроме того, обладает эстеразной и некоторыми другими видами активности (для ссылок см. /169/). КАВ не содержит дисульфидных связей и свободных SH-групп, в ее состав входит 7 аминокислотных остатков триптофана, 8 - тирозина, II - фенилаланина и 20 пролиновых остатков /9/. Рентгеноструктурных данных по КАВ нет, также нет данных и по аминокислотной последовательности. Однако химическая и пространственная структуры родственного белка - человеческой карбоангидразы В - расшифрованы /170, 171/. Согласно рентгеноструктурным данным /171/, это А-структурный белок, содержащий около 40$ А-структуры и примерно 10$ сб-спи-ралей (есть также спирали типа 3JQ). Единственный ион цинка связан с молекулой через гистидиновые остатки 94, 96 и 119, четвертым лигандом является, по-видимому, вода или ион гидроксила.
Уже первые исследования денатурации и ренатурации КАВ показали, что она является удобным объектом для изучения самоорганизации белков, т.к. выяснилось, что эти процессы идут через промежуточные состояния как в кинетике, так и при равновесной денатурации, причем кинетика денатурации и ренатурации значительно более медленная, чем для большинства белков (десятки минут). Равновесное исследование денатурации КАВ гуанидинхлоридом /9/ показало, что при увеличении концентрации денатуранта вначале происходит переход по эллиптичности в ближней ультрафиолетовой области (середина перехода 1,4 М ТШ), затем по разностному поглощению при нескольких длинах волн (1,8 М) и только после этого - по дисперсии оптического вращения в дальней ультрафиолетовой области также при нескольких длинах волн (2,2 М). При 2 М ГХЛ первый переход уже закончился, в то время как последний только начался, т.е. в карбоангидразе промежуточное состояние (или состояния) с сохранившейся вторичной структурой, но разрушенным нативным окружением ароматических боковых групп может быть получено при этой концентрации денатуранта практически в чистом виде. Подобный результат был получен в работе /ПО/ по изучению денатурации карбоангидразы по нескольким параметрам: разностному поглощению, флуоресценции, гель-фильтрации и характеристической вязкости. Это исследование показало, что промежуточное состояние, наблюдаемое при 2 М ПЛ,обладает компактностью, близкой к компактности нативного состояния. Оно склонно к агрегации при дяительном (около часа) прогреве, однако, как следует из данных по ультрацент-рифугированшо, при комнатной температуре молекулы белка в 2 М ТШ не агрегированы /НО/.
