Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Химико-токсикологический и микробиологический мониторинг 11
1.1 Особенности химического состава нефтешламов 12
1.1.1. Фракционный состав нефтяных углеводородов шламов 12
1.1.2. Компоненты, составляющие неорганическую часть шлама 14
1.2. Токсические эффекты нефтешламов и их компонентов 14
1.3. Стратегии выживания бактерий 18
1.3.1. Приспособленность микроорганизмов к стрессовым условиям 19
1.3.2. Ответ микробного консорциума на загрязнение 22
2. Методы биоремедиации нефтезагрязненных объектов 25
2.1. Компостирование как метод ремедиации загрязненных объектов 26
2.2. Ландфарминговая технология биоремедиации 28
3. Метаболизм полициклических ароматических углеводородов - труднодоступных компонентов нефтешлама 32
3.1. Особенности метаболизма ПАУ у бактерий и грибов 33
Экспериментальная часть
4. Материалы и методы исследования 41
1. Отбор проб нефтешлама и компостов 41
2. Экспериментальное компостирование в полевых условиях 42
3. Микробиологические методы анализа 43
4. Определение ферментативных активностей. 49
4.1 Активность внутриклеточных ферментов 49
5. Методы химического анализа 49
5.1 Анализ водной вытяжки 49
5.2 Анализ органорастворимых компонентов нефтешлама. 51
6. Токсикологические методы 51
7. Статистическая обработка результатов 52
Результаты исследований
5. Характеристика отхода нефтехимического производства 53
5.1. Химическая характеристика нефтешлама 53
5.1.1. Фракционный состав нефтяных компонентов нефтешлама 53
5.1.2. Анализ полициклических ароматических углеводородов 56
5.1.3. Водорастворимые компоненты нефтешлама 57
5.2. Токсикология нефтешлама 60
5.2.1. Изучение влияния водорастворимых компонентов нефтешлама на бактерии и одноклеточные
5.2.2. Влияние компонентов нефтешлама на растения 61
5.2.3. Мутагенность компонентов нефтешлама 61
5.3. Микробиологический статус нефтешлама 63
5.3.1. Количественная характеристика основных групп микроорганизмов 63
5.3.2. Физиологическое состояние бактериального консорциума шлама 67
5.3.3. Стресс-устойчивые группы бактерий нефтешлама 69
5.3.4. Деструкторы ксенобиотиков в нефтешламе 72
5.3.5. Характеристика бактериальных изолятов -деструкторов индивидуальных ПАУ 74
5.3.6. Оценка возможности изолятов использовать нефтешлам и ПАУ как источник питания 76
5.3.7. Активность оксигеназ расщепления ароматического кольца 80
6. Биоремедиация нефтехимического шлама с использованием компостирования 83
6.1 Химический мониторинг компостирования 84
6.1.1 Эффективность обработки шлама в отношении органических загрязнителей 84
6.1.2 Изменение содержания водорастворимых компонентов в компостах 89
6.2 Динамики микробиологических показателей в процессе компостирования 92
6.2.1. Закономерности изменений общего количества бактерий и специализированной микрофлоры 92
6.2.2. Изменение температуры в компостах 94
6.2.3. Динамические изменения различных физиолого-биохимических групп микроорганизмов и показателей биохимической активности 96
6.3 Экотоксикологическая оценка компостирования 101
Обсуждение результатов 105
Выводы 119
Литература 121
- Фракционный состав нефтяных углеводородов шламов
- Ландфарминговая технология биоремедиации
- Стресс-устойчивые группы бактерий нефтешлама
- Изменение содержания водорастворимых компонентов в компостах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Мировое сообщество движется в направлении повышения уровня урбанизации и роста промышленного производства, в связи с чем, одна из главных международных экологических проблем связана с наличием в объектах биосферы сложных комплексов экологически опасных ксенобиотиков, которые представляют угрозу для почвы, воздуха, водоемов, источников питьевой воды, здоровья людей.
В нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленных отраслях остро стоит проблема обезвреживания и утилизации больших объемов нефтесодержащих отходов (Shailubhai, 1984; Castaldi, Ford, 1991; Giles etal., 2001; Mishra etal., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001; Saikia etal., 2001). Это в полной мере относится к производственному объединению "Нижнекамскнефтехим" (НКНХ) (г.Нижнекамск, Россия), функционирование которого сопряжено с постоянным образованием твердых нефтесодержащих отходов. До недавнего времени в мировом масштабе наиболее распространенной была практика захоронения твердых опасных отходов на специализированных полигонах (Mueller etal., 1984; Holmboe, 1993; Saxena, Jotshi, 1997). Аналогично решалась эта проблема в НКНХ, где, начиная с 1965г, происходило накопление этих шламов в шламонакопителях. В настоящее время объемы скопившихся в этих специальных депо отходов достигают 1123 тыс м3. Существующие депо практически заполнены, а строительство новых противоречит экологическим критериям. В этих условиях возникла необходимость освобождения шламонакопителей и поиска путей обезвреживания и утилизации твердых нефтехимических отходов.
Нефтешламы содержат устойчивые и токсичные компоненты, в частности, полициклические ароматические углеводороды(ПАУ),алканы(Aprilletal., 1990; Rocha etal., 1997; Giles etal., 2001; Mishra etal., 2001), а также могут включать специфические продукты нефтехимии (Якушева с соавт., 2002). Часть нефтехимических составляющих - это токсиканты и канцерогены (Styrene, 1983; McMichael, 1988). Химический состав шламов варьирует в зависимости от их происхождения, специфики применяемых на предприятиях технологий добычи, переработки и химического синтеза. Исходя из этого, в каждом конкретном случае необходимо создавать стратегию ремедиации с учетом биологических и абиотических особенностей, которые характеризуют исследуемые твердые отходы.
Научное обоснование стратегии ремедиации предполагает создание концепции химического, токсикологического и биологического статуса данной антропогенной экосистемы. К изучению первых двух аспектов привл4чев(Е.внлмаШН^*№^йгочно-
ЇГЖЇЩ
исследовательских центров (Aprill et al., 1990; Juvonen et al., 2000; Giles et al., 2001), no поводу последнего практически нет данных литературы.
Наличие и степень микробной контаминации нефтешламов важны с позиций эволюции биоценозов в процессе многолетней аккумуляции специфического комплекса ксенобиотиков. Литература по нефтешламам затрагивает, как правило, микробиологические аспекты биоремедиации (Lazaret al., 1999; Giles etal., 2001; Mishra et al., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001), но не собственно нефтешламов как концентрированного комплекса специфических загрязнителей. Вместестем, создание биотехнологии, направленной на детоксикацию и утилизацию нефтешлама, предполагает исследование микробиологического статуса этой антропогенной экосистемы, что и определило изучение закономерностей распределения ряда физиолого-таксономических групп микроорганизмов в промышленном накопителе нефтехимических отходов, особенностей их физиологического состояния с учетом специфики среды обитания.
Выживание и функционирование живых организмов в условиях сложной комбинации экстремальных факторов - проблема общебиологического масштаба. Дискуссии по вопросам, связанным с гипометаболическим, анабиотическим, жизнеспособным-но-некультивируемым, "другим состоянием" микробных популяций и сообществ (Kaprelyants etal., 1993; Atlas, Bartha, 1997; Trevors, 1998; Головлев, 1998; Mascheretal., 2000) свидетельствуют о сложности данной проблемы. Её исследование включает закономерности адаптации микроорганизмов в условиях сложного комплекса экстремальных факторов нефтешлама: токсичности, гидрофобное и низкой биодоступности ксенобиотиков, высокого осмотического давления, сезонных колебаний температур.
Мировой опыт по переработке твердых отходов демонстрирует наибольшую
экономическую эффективность и экологическую безопасность применения
биотехнологий, однако известны лишь немногочисленные примеры экспериментального
и промышленного обезвреживания шламов с высоким содержанием нефтяных
углеводородов с помощью такого распространенного приема биоремедиации как
компостирование (O'Reilly, Simpkin, 1997; Kirchmann, Ewnetu, 1998; Lazaretal., 1999;
Juvonen etal., 2000; Admonetal., 2001). При этом большинство работ сконцентрировано
на исследованиях химических аспектов ремедиации нефтесодержащих отходов (EI-
Nawawy et al., 1992; Prado-Jatar et al., 1993; O'Reilly, Simpkin, 1997; Kirchmann, Ewnetu,
1998). В связи с ужесточением норм сброса в окружающую среду различных
экологически опасных химических отходов возникла
необходимость в процессе обезвреживания нефтесодержащих осадков, наряду с химическим мониторингом, осуществлять, токсикологические исследования (Aprill et al., 1990; Juvonen etal., 2000) в сочетании с выявлением закономерностей формирования и функционирования микробных сообществ в условиях компостирования нефтзагрязненных шламов (Vasudevan, Rajaram, 2001; Petrisor et al., 2001).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - создать научную основу эффективной биотехнологии детоксикации и утилизации сложного комплекса экологически опасных отходов нефтехимического предприятия. Были поставлены следующие задачи:
Охарактеризовать исходный нефтешлам по химическим, токсикологическим и микробиологическим показателям;
Выявить закономерности распределения ряда физиолого-таксономических групп микроорганизмов в промышленном накопителе нефтехимических отходов, а также оценить особенности их физиологического состояния с учетом специфики среды обитания;
Оценить особенности метаболического потенциала микроорганизмов нефтешлама с позиции создаваемой биотехнологии;
Осуществить пилотно-полевое компостирование на базе производственного объединения "Нижнекамскнефтехим" и оценить эффективность компостирования путем мониторинга с использованием основных химических, токсикологических и микробиологических параметров;
Разработать рекомендации по практической реализации полномасштабной ремедиации нефтехимических отходов.
Научная новизна. Впервые дана характеристика химического состава, микробиологического статуса и токсикологических свойств твердых нефтехимических отходов. Выявлены закономерности пространственно-временного распределения основных физиолого-таксономических групп микроорганизмов в многотонной массе нефтехимических отходов с учетом принципиально важной доли их жизнеспособных форм. Новым является также аспект дифференцированной оценки стратегии адаптации различных физиологических групп микроорганизмов в условиях длительного воздействия комбинации экстремальных факторов. Предложена гипотеза эволюции микробного сообщества исследуемой антропогенной экосистемы. Дана сравнительная характеристика контаминации нефтешламов с позиций численности и метаболической активности деструкторов основных устойчивых,
токсичных и мутагенных органических ксенобиотиков из би- и трициклоаренов, тиофенов, алканов.
Проведено разностороннее исследование токсических и генотоксических эффектов: острая и отдаленная токсичность в тестах на беспозвоночных, токсичность по отношению к бактериям, фитотоксичность, мутагенность в тесте Эймса.
Практическая значимость. Результаты диссертационной работы позволили практически реализовать в пилотно-полевых условиях (совместно с "Нижнекамскнефтехим") компостирование для обезвреживания и утилизации твердого отхода нефтехимических отходов производственного объединения "Нижнекамскнефтехим" на территории Биологических очистных сооружений и с привлечением материальной базы этого предприятия. Выявление высокой потенциальной метаболической активности микрофлоры нефтешлама позволило осуществить ремедиацию без интродукции бактериальных штаммов, что значительно удешевляет процесс. Применение испытанной технологии позволило уменьшить в среднем на 90% содержание нефтяных углеводородов, втом числе и полициклических ароматических углеводородов, с одновременной детоксикацией в отношении бактерий, одноклеточных организмов и растений. Создана система токсиколого-микробиологического и химического мониторинга, включающая тестирование различных физиолого-биохимических групп микроорганизмов и биологических активностей и изменение химического состава в процессе детоксикации и минерализации сложного комплекса промышленных отходов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на: V и VI международных конференциях "Environmental contamination on central and eastern Europe" (Prague, 1999,2003); VII Международном симпозиуме In-Situ and On-Site Bioremediation (Орландо, США); V международной конференции "Environmental pollution - ICEP-2001", (Volgograd-Perm, 2001); V, VI и VII Пущинских конференциях молодых ученыхяБиология - наука 21 века"(Пущино, 2001,2002,2003); II научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского гос. университета (Казань, 2001). Основные результаты диссертации обсуждены на ежегодных дискуссиях партнеров в рамках проекта Европейского сообщества "Copernicus-2" (Вагенинген, Голандия), 2002 (Флоренция, Италия), 2002 (Казань, Россия).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 11 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация включает разделы: введение, обзор
Фракционный состав нефтяных углеводородов шламов
Набор основных компонентов нефтешламов широко варьирует и зависит от вида производства и используемых технологий переработки нефти и полупродуктов на ее основе. Нефтесодержащие отходы можно разделить на шламы, в составе которых высока концентрация эмульгированных углеводородов (25-40%) (Aprill et al, 1990; Kirchmann, Ewnetu, 1998; Vasudevan, Rajaram, 2001) и относительно высоко содержание неорганических нерастворимых частиц (типа песка, глины) и на отходы с общим низким содержание углеводородов (5-10%) и минеральных компонентов, а высоким - неуглеводородных органических соединений (Saikia et al, 2001; Bartha, Bossert, 1984).
Несмотря на различия в технологиях, применяемых на предприятиях, можно выделить характерные компоненты этого вида отходов производств — нефтяные фракции (алкановые (алифатические), нафтеновые (циклоалкановые), ароматические углеводороды, смолистые вещества, кислород-, серо- и азотсодержащие соединения), составляющие основу углеводородной части шлама, вода, тяжелые металлы, однако процентное отношение каждого из составляющих может широко варьировать.
Большая часть углеводородов нефти в составе шлама, образующегося при нефтедобыче, может быть представлена насыщенными углеводородами (алканами), которые могут составлять до 90% (Giles et al., 2001). В отходе же нефтепереработки только около 50% от обшего количества нефтяных углеводородов составляет фракция насыщенных углеводородов и около 30% - фракция ароматических углеводородов (Rocha et al., 1997; Mishra et al., 2001). Количественный и качественный состав отходов российских нефтеперерабатывающих заводов (г. Уфа) существенно не отличаются от западных аналогов. Основную часть их углеводородов составляют ароматические и парафино-нафтеновые фракции (31-83%) (Габбасова с соавт., 2001).
К ароматической фракции углеводородов шлама принадлежат и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Содержание ПАУ колеблется в разных шламах от 0.14 до 15 г/кг (Goettems et al., 1988; Aprill et al., 1990; Li et al., 1995; Juvonen et al., 2000). Вещества, принадлежащие к данному классу соединений, отнесены Агентством по охране окружающей среды США к группе веществ, обладающих мутагенным и канцерогенным потенциалом (US ЕРА., 1985). К примеру, содержание канцерогенных ПАУ в шламе одного из нефтедобывающих комплексов США составляет около 15% от всех ПАУ (Aprill et al., 1990).
Одну из значительных частей нефтяного загрязнения шлама составляют асфальтены - не превратившегося в нефть керогена, устойчивого к микробному окислению, их количество в шламе находится на уровне 4 -15% от всех углеводородов нефти (Rocha et al., 1997; Mishra et al., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001; Габбасова с соавт., 2001).
Специфичность нефтехимических стоков состоит в наличии таких компонентов, как бензол, толуол, фенол, стирол, ацетофенон, ацетонитрил, метилфенилкарбинол, метилэтилкетон (Castaldi, Ford, 1991; Якушева, Наумова, 1998, Якушева с соавт., 2002), которые неизбежно попадают в шламы из системы биологической очистки сточных вод. В подтверждение этого, в почве, загрязненной отходами нефтехимического предприятия, кроме нефтяных компонентов, были обнаружены продукты нефтехимии (Li et al., 2000).
Помимо органических соединений, в нефтешламах присутствуют и неорганические компоненты, в том числе тяжелые металлы: цинк, хром, ванадий, никель, свинец, медь (Goettems et al., 1988; Tedesco et al., 1989; Juvonen et al., 2000). Однако, несмотря на их присутствие, нефтешламы можно отнести к отходам с низким содержанием тяжелых металлов (Prado-Jataretal., 1993).
Важной составляющей нефтешлама является вода, ее количество во многом зависит от происхождения шлама. К примеру, для шлама нефтеперерабатывающего завода Индии и шлама нефтедобычи Техаса этот показатель невысок, всего 5 - 11% (Mishra et al., 2001; Giles et al., 2001; Mishra et al., 2001). Количество воды в нефтешламе одного из Венесуэльских предприятий составляет 28%» (Rocha et al., 1997). В противоположность этому, отход другого нефтеперерабатывающей завода США содержит 45 -50% воды (Aprill et al., 1990). Еще выше этот показатель для нефтешламовых отходов из хранилища штата Ассам в Индии (88%о) (Saikia et al., 2001). Этот показатель сравним с таковым для отхода нефтехимической промышленности (Castaldi, Ford, 1991).
Важным показателем для биоремедиации нефтешлама является рН. Диблом и Бартом (Dibble, Bartha, 1979) было найдено, что оптимальный рН для переработки нефтешлама при внесении в почву должен составлять / .8 — 8.0. Шламы того или иного происхождения имеют различный рН в зависимости от технологический особенностей предприятия. Этот показатель может колебаться от 6.1 (Giles et al., 2001) до 7.4 (Mishra et al., 2001). С точки зрения ремедиации нефтешламов, в современных условиях развития биотехнологий необходимым является проведение экотоксикологической оценки загрязнения (Juvonen et al., 2001). Публикаций, посвященных оценке токсического действия собственно нефтешламов, практически не существует, однако интенсивно исследуется возможное негативное воздействие на обитателей почв, которые подверглись загрязнению компонентами нефти и нефтехимии. В местах загрязненных нефтехимическими компонентами происходят драматические изменения, проявляющиеся в увеличении инфицирования артроподами Sigmodon hispidus других обитателей экониши (Faulkner, Lochmiller, 2000). Широко известно отрицательное влияние сложных нефтяных поллютантов на иммунную систему млекопитающих (Rocke et al., 1984; Goldberg et al., 1990; Propst et al., 1999). Кроме того, они вызывают хромосомные абберации (МсВее et al., 1987; Thompson et al., 1988), а также индукцию цитохрома P-450 в клетках крыс (Elangbam et al., 1990). При попадании в организм полиароматических соединений под действием ферментов образуются эпоксисоединения, которые реагируют с гуанином. Это препятствует синтезу ДНК, вызывает нарушения, приводящие к возникновению мутаций, что, несомненно, способствует развитию раковых заболеваний (Ehrlichmann, 1999).
Ландфарминговая технология биоремедиации
Ландфарминг - это технология, основанная на использовании почвенных микроорганизмов и агротехнических приемов в аэробных экосистемах для снижения загрязнения через его трансформацию, иммобилизацию и детоксикацию (Sims, Sims, 1999). Биологическая обработка почвы с применением ландфарминга - это относительно простой и дешевый метод для очистки почв, загрязненных различными органическими веществами (Harmsen, 1991). Агентство по защите окружающей среды США (US EPA), определяет ландфарминг как "открытую" систему, в которой реализуются "динамические физические, химические и биологические" процессы (Federal Register, 1982) необходимые для деградации, трансформации или иммобилизации опасных органических отходов в почве.
Данный способ широко используется для биоремедиации нефте-, ПАУ-загрязненнных почв и осадков водоемов (Harmsen, 1991, Sims, Sims, 1999). Однако, работы по обработке непосредственно нефтешлама с использованием вышеуказанной технологии немногочисленны (Concawe, 1980; Zitrides, 1990; El-Nawawy et al, 1992; Prado-Jatar et al., 1993).
Немаловажным фактором, который необходимо учитывать в процессе обработки загрязненной почвы, является потенциальный риск, связанный с тем, что ремедиация проводится в открытой экосистеме, тогда как компостирование проводится на специально подготовленных площадках (Harmsen, Ferdinandy, 1999). В связи с этим, необходимым условием обработки по типу ладфарминга является осуществление мониторинга по химическим и токсикологическим показателям, как самой почвенной системы, так и подземных вод.
Существуют определенные критерии для выбора места проведения ландфарминга (American Institute, 1980). Местность, предназначенная для проведения очистных мероприятий по данной технологии, должна быть равнинной с минимальным уклоном для сбора стоков и уменьшения процессов эрозии в почве, а также для избежания застоя воды. Структура почвы предпочтительна суглинистая или она должна быть улучшена, например, добавлением песка для обеспечения необходимой скорости аэрации. Ландфарминг не должен проводиться над водоносным слоем или в области грунтовых вод, или же необходимо наличие слоя глины, низкая природная проницаемость которой является условием уменьшения загрязнения грунтовых вод (Bartha, Bossert, 1984).
На скорость разложения нефтяного загрязнения влияют следующие факторы: текстура почвы, плотность разрыхляющих агентов, электропроводность, влажность, глубина возделываемого слоя, катионо-обменная способность, содержание органического вещества, рН, соленость, редокс-потенциал. Эти свойства, наряду с такими как тип и количество микроорганизмов, методы мониторинга, количество внесенных питательных веществ, климатические условия региона загрязнения, в значительной степени оказывают влияние на интенсивность разложения загрязнений (Bartha, Bossert, 1984; Bartha, 1987; Pope, Matthew, 1993, Sims et al., 1989).
Дибблом и Бартом (Dibble, Bartha, 1979) показано, что для биодеградации нефтешлама в суглинистой почве оптимальным является рН 7.5-7.8, соотношение C/N 60:1, С/Р 800:1, температура от 20С и выше, влагоудерживающая способность в пределах от 30 до 90%. Добавление питательных органических компонентов и шлама сточных вод не интенсифицировало темпов разрушения нефтяных компонентов. Частое внесение шлама в почву в малом было наиболее благоприятно для процесса ремедиации.
При обработке загрязненных объектов с использованием почвенных микроорганизмов выделяют две стадии - активную (интенсивную) и пассивную (экстенсивную) (Harmsen et al., 1997; Smith et al., 1997). В ходе активной стадии наблюдается наибольшая скорость разложения ксенобиотиков, что выражается в снижении загрязнения на 50 - 90%, в зависимости от характера загрязнения. Длительность первой стадии ремедиации может не превышать и 100 дней.
Вторая стадия биоремедиации в процессе ландфарминга может продолжаться более двух лет. Экстенсивная фаза начинается, когда биологически легко доступная фракция загрязнения уже удалена в течение интенсивной стадии (Harmsen et al., 1997). Исследователи указывают на трудности, связанные с деградацией остаточного загрязнения в почве (Harmsen, 1991). Эти затруднения связаны с уменьшением биодоступности остаточных компонентов вследствие их сорбции на органическом веществе почвы (Harmsen et al., 1997). Обобщая вышесказанное, можно заключить, что активное биологическое разрушение нефтяного загрязнения обычно длится 1 - 1.5 года в условиях умеренного климата (Concawe, 1980), однако этот период может быть более продолжительным, в зависимости от количества остаточной нефти и ее химических характеристик.
Образование ассоциированных комплексов между почвенными частицами и остатками минеральных компонентов нефти и ПАУ является следствием абиотического взаимодействия ПАУ-метаболитов с гуминовыми макромолекулами почвы. В этом случае скорость снижения остаточного содержания ксенобиотиков существенно замедляется. Увеличение времени контакта может привести к увеличению их адсорбции и к замедлению удаления путем вымывания, испарения, экстракции и биодеградации (Alexander, 1995). Поэтому важным фактором для успешного проведения биоремедиации является время нахождения ксенобиотика в почве. Соответственно, химические вещества антропогенного происхождения, попавшие в почву сравнительно недавно, более доступны для микроорганизмов, чем те, что контактировали с почвой длительное время (Loehr, Webster, 1996). Активность биодеградации в такой ситуации можно повысить добавлением органического наполнителя, например, органического компоста (McCarthy et al., 1990).
В процессе ландфарминга отмечено увеличение доли тяжелых металлов и асфальтенов относительно всего объема остаточного загрязнения, тогда как процент насыщенных углеводородов и легкой ароматической фракции в почве уменьшался (Huddlestone, Creswell, 1976). Это является следствием низкой скорости деградации тяжелых аренов и асфальтенов по сравнению с общей скоростью утилизации шлама (Weldon, 1970).
Стресс-устойчивые группы бактерий нефтешлама
Поскольку нефтешлам содержит ксенобиотики, относящиеся к различным классам химических соединений, в том числе и ПАУ ( данные показаны выше). Способность ПАУ деструкторов использовать один из ксенобиотиков в качестве источника углерода и энергии проверяли на жидкой среде, сравнивая оптическую плотность культур в опытных вариантах и контроле (та же среда без источника углерода).
Скриниг бактерий на способность использовать ПАУ (фенантрен, антрацен или флуорен) выявил наличие такой способности у 90% выделенных изолятов. Однако, скорость роста на различных ксенобиотиках у штаммов была не одинаковой. Практически во всех случаях, кроме штамма А2, антрацен и фенантрен были более доступны, чем флуорен. Изоляты, выделенные на среде с антраценом, показали более активно росли на средах с ПАУ по сравнению с остальными бактериальными изолятами.
Среди микроорганизмов выделенных с фенантреном или флуореном стоит отметить лишь штаммы Р7, 24, 25 и F113,14,20 как высоко активных деструкторов ПАУ (рис. 15).
Урожай биомассы у бактериальных изолятов Р8 и А26 мало отличался от контрольного варианта (без источника углерода), что говорит о неспособности этих штаммов использовать предложенные ПАУ в качестве единственного источника углерода. Видимо, способность разлагать полиароматические углеводороды у выше упомянутых штаммов проявляется только в условиях кометаболизма Нефтешлама характеризуется как сложный комплекс загрязнений. О суммарном метаболическом потенциале исследуемых бактериальных изолятов судили по степени его доступности как единственного источника углерода и энергии. Для скрининга этой способности были выбраны 13 изолятов, проявившие различную активность при культивировании на индивидуальных ПАУ. В процессе 14-дневного культивирования на нефтешламе у 12 деструкторов из 13 тестируемых изолятов концентрация хлороформ-извлекаемых веществ уменьшилась на 10-60%, а суммарное количество 10 испытанных ПАУ сократилось на 40-60 % (рис. 16). Выделенные бактериальные изоляты были способны метаболизировать не только 2- и 3- кольцевые ПАУ, но и соединения с большим количеством конденсированных колец.
Низкая способность к разрушению комплекса загрязнителей нефтешлама показана для штамма А2, несмотря на то, что он показал высокую скорость роста на средах с антраценом, фенантреном и флуореном в качестве единственного источника углерода и энергии. Отсутствие способности разлагать сложный комплекс нефтяного загрязнения шлама может быть обусловлен накоплением продуктов метаболизма бактерий, которые могут быть ингибиторами микробных ферментативных систем. Подобный эффект катаболитной репрессии описан в литературе на примере деструкции штаммом Stenotrophomonas maltophilia VUN 10,003 дибенз(а)пирена и дибенз(а)антрацена, промежуточные метаболиты которых тормозят дальнейшее разложение (Juhasz et al., 2002).
Не было выявлено закономерностей между средой с определенным ксенобиотиком, на которой были выделены изоляты, и деструкторскими свойствами изолятов. Это обстоятельство может свидетельствовать о широкой субстратной специфичности микроорганизмов нефтешлама, что важно с точки зрения дальнейшей биоремедиация этого комплекса опасных отходов.
Анализ активности оксигеназ показал, что все исследуемые микроорганизмы осуществляют преимущественно орто-расщепление ароматического кольца. Активность катехол-2,3-диоксигеназы в 10-100 раз меньше, чем катехол-1,2-диоксигеназы (рис. 17, 18), как при предварительной индукции, так и при ее отсутствии. В качестве индуктора использовали тот ксенобиотик (фенантрен, антрацен, флуорен), на котором был выделен изолят. Активность катехол-1,2-диоксигеназы в присутствии индуктора увеличивалась в 3-60 раз (рис. 17), при этом, наибольший отклик был выявлен у штаммов, которые отличались высокой скоростью роста и урожаем биомассы при культивировании на жидких средах с ПАУ в качестве единственного источника углерода (А4, Р7, F113). Более активными диоксигеназами располагают у бактериальных изоляты, выделенные на среде с антраценом, по сравнению с таковыми, выделенными с фенантрена и флуорена.
Изменение содержания водорастворимых компонентов в компостах
Накопление отходов нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей и нефтехимической отраслей промышленности, которые содержат комплекс опасных и труднодоступных для биологического разложения компонентов, приводит к стойкому загрязнению окружающей среды. Как показывает статистика, 70% всех загрязнителей принадлежит к нефтяным углеводородам (Lazar et al., 1999). Решение проблемы утилизации нефтесодержащих отходов требует индивидуального подхода в зависимости от химических, токсикологических и микробиологических особенностей отхода.
В нормативных документах РФ перечень отходов, относящихся к 3 классу опасности, включает следующие: шламы, содержащие сырую нефть, шламы нефтеотделительных установок, водные смеси нефтепродуктов, земли, загрязненные нефтепродуктами (Критерии..., 2000). ГОСТ Р 17.4.3.07-2001, регламентирующий условия размещения осадков сточных вод в качестве удобрений, предусматривает, что этот стандарт не распространяется на осадки производственных предприятий, в том числе производств синтетического каучука и нефтехимии, в сточных водах которых могут содержаться токсичные органические вещества первого и второго класса опасности в количествах, превышающих их предельно допустимые концентрации в воде водных объектов.
В изучаемом нефтехимическом шламе 20-25% от органического вещества составляют компоненты нефти (хлороформэкстрагируемые вещества), что является характерным для данной категории нефтесодержащих отходов (Bartha, Bossert, 1984; Castaldi, Ford, 1992). В составе изучаемого нефтешлама, кроме нефтяных компонентов присутствуют продукты и полупродукты нефтехимии: бензолы, толуолы, ксилолы, стиролы, часть из которых являются токсикантами и канцерогенами (McMichael, 1987; Styrene, 1983). Наличие таких продуктов является характерным именно для отходов нефтехимического синтеза (Castaldi, Ford, 1992; Якушева, Наумова, 1998).
К экологически опасным загрязнениям принадлежат многие характерные нефтяные компоненты шламов, в том числе ПАУ (Menzie et al., 1992). Концентрация полициклических соединений в нефтешламе НКНХ сравнима с таковой в отходах нефтепереработки (Aprill et al., 1990), которые характеризуются как токсичные и экологически опасные. Кроме того, в нефтешламе НКНХ содержится особо контролируемый бензо(а)пирен, который в России не нормируется для отходов, а для почвы его предельно допустимая концентрация составляет 0.02 мг/кг (Санитарные нормы..., 1988). В отличие от российских, по американским стандартам BDAT (Best Demonstrated Available Technology), предписывающим необходимость предварительной обработки отходов до их почвенного размещения, разрешенная концентрация бензо(а)пирена на четыре порядка выше и составляет 12 мг/кг (Poche et al., 1991). Оценивая перспективы переработки и утилизации изучаемого шлама, с учетом приведенных норм и фактического содержания бензо(а)пирена (12-47 мг/кг), этот компонент следует контролировать особо в процессе предстоящей обработки.
С точки зрения последующей ремедиации отходов нефтехимической промышленности, его важной составляющей являются минеральные компоненты и их сбалансированность для развития и активной жизнедеятельности микроорганизмов.
Согласно проведенным ранее исследованиям, оптимальные соотношения C:N и С:Р для биоремедиации нефтешлама составляли 60:1 и 800:1, соответственно (Dibble, Bartha, 1979). В исследуемом нами отходе эти отношения были 1800:1 и 31000:1, соответственно, что свидетельствует о дефиците азота и особенно фосфора для жизнедеятельности микроорганизмов, что было учтено при переработке нефтешлама с применением биологической технологии.
Применительно к почвам оптимальной является влажность на уровне 60% (Мишустин, 1982), в случае нефтешлама НКНХ этот показатель выше (67-70%), что может лимитировать рост микроорганизмов. При повышенной влажности вытесняется воздух, ухудшается аэрация, вследствие чего аэробные микробные процессы затормаживаются (Колешко, 1981). Эффективность биоремедиации повышали добавлением разрыхляющего агента, что рекомендуется другими исследователями (Atlas, 1988), для повышения пористости шлама, увеличения скорости проникновения кислорода. При компостировании шлама НКНХ применяли отработанный наполнитель биофильтра, при этом параллельно была решена проблема утилизации этого отхода БОС.
Экологическая опасность нефтешламов подтверждена при анализе токсичности и генотоксичности, как водорастворимой части отхода, так и органорастворимой. Выявлено высокое негативное воздействие на простейшие (табл. 7) и растения (табл. 8). В тесте Эймса на мутагенность компоненты нефтешлама проявили генотоксический потенциал как в отсутствие метаболической активации, так и при ее наличие, причем в последнем случае мутагенность возрастала, что позволят отнести компоненты нефтешлама к промутагенам. Данных литературы по поводу токсичности и мутагенности исходного нефтешлама малочисленны (Krishnamurthi et al., 2003), вместе с тем, ранее была обнаружена высокая токсичность и генотоксичность нефтешламозагрязненных почв (Aprill et al., 1990) и компостов (Juvonen et al., 2000).
Выявленный химический состав в совокупности с экотоксикологической оценкой шламов производственного объединения «Нижнекамскнефтехим» позволяет отнести их к экологически опасным отходам, которые требуют предварительного обезвреживания.
Большинство известных работ посвящены ремедиации шламов нефтедобычи (Giles et al., 2001; Габбасова с соавт., 2001) и нефтепереработки (Rocha et al., 1997; Mishra et a., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001), а не нефтехимии. В этих работах основной акцент делается на химико-токсикологических аспектах проблемы, а не на микробиологические. Исключение составляют работы румынских (Petrisor et al., 2001) и индийских исследователей (Mishra et al, 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001), однако, и в них анализ микробного сообщества ограничивается аэробными гетеротрофами и нефтеутилизирующими микроорганизмами.
