Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы
1. Общая характеристика микроорганизмов рода Streptomyces 8-9
2. Практически значимые биологически активные вещества, продуцируемые стрептомицетами . 9
3. Биотехнологические процессы получения авермектинов и готовых лекарственных средств на их основе 21
4. Влияние препаратов авермектинового ряда на организм животных 24
5. Эффективность и формы препаратов на основе метаболитов Streptomyces avermitilis 29
5.1. Препараты, содержащие в качестве действующего вещества ивермектин 29
5.2. Препараты, содержащие в качестве действующего вещества натуральные авермектины 32
6. Проблема утилизации отходов и охраны окружающей среды при получении БАВ на основе микробиосинтеза 37
II. Собственные исследования 50
1. Материалы и методы 50-54
2. Результаты исследований 55
2.1. Особенности технологии культивирования S.avermitilis-56 при получении биологически активных веществ 55
2.2. Изучение биохимического состава мицелия S. avermitilis 61 -66
2.3. Изучение биологически активных свойств липидов мицелия S.avermitilis-56
2.4. Изучение биологически активных свойств мицелия S.avermitilis -56 72
2.4.1. Токсикологические параметры мицелия 72-73
2.5. Действие мицелия на развитие и биохимические показатели животных 73
2.6. Действие мицелия на иммунобиологические показатели организма животных 77
2.7. Действие мицелия продуцента авермектинов на гематологические показатели 82
III. Обсуждение результатов 82-89
IV. Выводы 90
V. Сведения о практическом использовании 91
Результатов исследований
VI. Рекомендации по использованию научных 91
Выводов
VII. Библиографический список 92-111
- Практически значимые биологически активные вещества, продуцируемые стрептомицетами
- Влияние препаратов авермектинового ряда на организм животных
- Особенности технологии культивирования S.avermitilis-56 при получении биологически активных веществ
- Изучение биологически активных свойств мицелия S.avermitilis
Введение к работе
Актуальность проблемы. Как известно, в последнее время широкое
применение в ветеринарной практике нашли противопаразитарные
препараты, содержащие в качестве действующего начала авермектины,
продуцируемые Streptomyces avermitiHs. Преимущества этих препаратов
связаны с тем, что они обладают широким спектром действия и более
экологически чистые, чем известные химические аналоги. В зарубежных
странах наиболее широко известен препарат Ивомек, разработанный
^ учеными фирмы MSD (W.C. Campbell, V.W. Benz, 1984; W.C. Campbell, M.
Easterbrook, 1985; J.CJ.W. Knox, K.S. Marbury and others, 1989) и
содержащий в качестве активного начала комплекс химически
модифицированных авермектинов Вт а и В(Ь- ивермектин.
Ивермектин используется в качестве действующего начала и в
большинстве других зарубежных противопаразитарных препаратах (Ивомек
ф плюс, Баймек, Пандекс, Ивомек пурон и др.).
Научно-исследовательские работы по разработке технологии
биосинтеза авермектинов и получению соответствующих лекарственных
средств в России были начаты в конце 80-х годов учеными НПО
«Биотехнология», МГП «Бифидум». В итоге этих работ были созданы
препараты Аверсект-1, Аверсект-2, Ниацид и др., содержащие в своем #
составе натуральные авермектины и по своим лечебно-профилактическим
характеристикам не уступающие известным аналогам [ 62, 63, 103, 104 ].
В то же время нельзя не отметить, что существующие технологии
получения авермектинсодержащих препаратов в определенной степени
носят незавершенный характер в плане того, что до конца не решен вопрос
щ утилизации отходов и соответствующего снижения вредного воздействия на
окружающую среду. Значительные количества мицелия продуцента
авермектинов (более 100 кг/м культуральной жидкости) после экстракции целевого продукта выбрасывается в окружающую среду.
При этом хорошо известно, что мицелий стрептомицетов содержит значительное количество таких биологически ценных компонентов, как аминокислоты, липиды, витамины, микроэлементы и др. (Кузнецов В.Д., Ефимова и др. 1975, Журавлев А.И. 1982, Ракова Т.Н., Рецкий,1998 и др.).
Таким образом, перспективным направлением дальнейшего усовершенствования и оптимизации различных технологий получения целевых продуктов микробиосинтеза с помощью стрептомицетов в целом и авермектинсодержащих препаратов в частности представляется изучение возможности выделения биологически активных веществ (БАВ) из отработанного мицелия и соответствующего снижения отрицательного воздействия на окружающую среду.
Поэтому исследования по выявлению биохимического состава биомассы продуцента авермектинов, разработке технологических процессов выделения и очистки БАВ, содержащихся в мицелии продуцента, а также созданию новых лекарственных препаратов на их основе, является актуальной проблемой ветеринарной медицины, биохимии и биотехнологии. Такие исследования имеют значительное народно-хозяйственное, социальное и экологическое значение.
Цель и задачи работы. Целью работы является на основе изучения биохимического состава и параметров безвредности биомассы S.avermitilis, определить направления утилизации мицелиальных отходов производства авермектинов с одновременным получением хозяйственно ценных продуктов...
6 Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- изучение влияния основных технологических параметров
культивирования на развитие S. avermitilis-56 в глубинных условиях;
' - изучение биохимического состава (белки, углеводы, липиды) мицелия
S. avermitilis-56\
моделирование технологического процесса биосинтеза авермектинов и получение проэкстрагированной биомассы микроорганизма;
выявление основных токсикологических параметров биомассы
микроорганизма;
^ - изучение действия биомассы и липидов продуцента авермектинов на
физиолого-биохимические показатели организма животных;
- разработка рекомендаций по усовершенствованию технологического
регламента получения авермектинов путем утилизации мицелиальных
отходов продуцента и соответствующего уменьшения вредного
воздействия на окружающую среду.
*
Научная новизна. Впервые изучены биохимический состав и параметры безвредности мицелиальных отходов производства авермектинов. Установлено, что биомасса микроорганизма, остающаяся после экстракции целевого продукта, практически безвредна при скармливании для теплокровных, содержит биологически активные вещества и оказывает положительное действие на факторы естественной резистентности животных. Показано, что липиды биомассы продуцента авермектинов обладают высокой антиокислительной активностью и представляют собой перспективное сырье для получения биопрепаратов.
ф Практическая ценность работы. Для снижения отрицательного
воздействия на окружающую среду при получении авермектинов путем
микробиосинтеза с помощью S. avermitilis предложена схема утилизации мицелиальных отходов продуцента с одновременным получением биологически активных хозяйственно ценных продуктов.
Положения, выносимые на защиту:
Результаты изучения биохимического состава и параметров безвредности биомассы S. avermitilis-56.
Данные по усовершенствованию технологии биосинтеза авермектинов путем утилизации мицелиальных отходов производства авермектинов.
Данные по выделению, очистке и изучению биологически активных свойств липидов продуцента авермектинов
Результаты изучения действия липидов и биомассы S.avermitilis на физиолого-биохимические параметры организма животных.
Апробация.
ф Результаты работы изложены на методической и научной
конференции, посвященной 85 - летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, г. Москва, май 2004 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
111 страницах машинописного текста и включает следующие разделы:
введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение
результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов,
рекомендации по использованию научных выводов, список использованной
литературы, включающий 191 источников, в том числе 37 иностранных.
ф Материалы диссертации иллюстрированы 16 рисунками и 11 таблицами.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Практически значимые биологически активные вещества, продуцируемые стрептомицетами
Анализ, имеющийся информации показывает, что стрептомицеты являются продуцентами практически всех наиболее хорошо известных и используемых в практике антибиотиков. Следует отметить, что в настоящее время известно несколько тысяч антибиотиков, но значительная часть не нашла практического применения из-за токсичности. В тоже время определенное количество антибиотиков оказалось пригодной для широкого применения в медицине, ветеринарии и животноводстве [20, 40, 51, 120].
Заслуживает внимания также то, что некоторые кормовые антибиотики позволяют не только профилактироватъ различные заболевания, но и стимулировать рост и развитие животных [72].
Стрептомицин, синтезируемый Act.streptomyciniy обладает широким спектром действия, подавляет рост грамположительных и грамотрицательных микробов, таких, как стафилококки, стрептококки, а главное действует на возбудителя туберкулеза, который относится к кислотоустойчивым микробам. Стрептомицин наиболее активен в аэробных условиях, не проявляет активности против анаэробов, микроскопических грибов, риккетсий, вирусов, механизм его действия связан с ингибированием синтеза белка [4, 65].
Из культуральной жидкости Act.kanamyceticus выделен антибиотик канамицин. Этот антибиотик угнетает развитие микробов, устойчивых к пенициллину, стрептомицину, левомицетину, тетрациклинам, токсичность его для животных такая же, как и у стрептомицина [20, 4].
Комплекс антибиотиков колимицина, мицерина и др., образуемый Actfladiae известен как каномицин. Применяют сульфат неомицина В, который хорошо растворим в воде и слабо - в спиртах. Неомицин -антибиотик широкого спектра действия, но к нему устойчивы клостридии, грибы, некоторые штаммы синегнойной палочки. Антибиотическая активность на многие микробы выше, чем у стрептомицина, но он более токсичен. Оказывает отрицательное действие на органы слуха, вызывает воспаление почек [20].
Streptomyces griseus известен как продуцент антибиотика кормогризина, который получают при глубинной ферментации на среде, содержащей кукурузную муку, крахмал и минеральные соли. Антибиотик обладает малой токсичностью для теплокровных, угнетает развитие значительного количества видов бактерий, грибов и дрожжей. Используют и высушенную массу мицелия S.griseus, которую вносят в корм как ростстимулирующую добавку, оказывающую положительное влияние на обмен веществ животных. Хороший эффект дает кормогризин при откорме свиней, а также индеек, гусей [8, 11, 26, 34, 50, 51, 124, 125].
Витамицин синтезируется микроорганизмом Streptomyces aureverticillatus. Антибиотик представляет собой высушенную культуральную жидкость вместе с мицелием. Установлено, что биологическая активность препарата связана с наличием в нем значительного количества витамина А. В производственных условиях показано, что препарат ускоряет рост животных и позволяет экономить корма [66, 19, 51]. Культурой S.aurigineus вырабатывается антибиотик кормарин. Препарат и готовят из смеси культуральной жидкости и мицелия - продуцента, высушенных на распылительной установке. Кормарин содержит витамин группы В, гормоноподобные вещества и другие факторы роста. Использование кормарина в рационах животных и птицы повышает приросты живой массы, улучшает обмен веществ и усвоямость компонентов корма [20]. Флавомицин (продуцент S.bambergiensis) известен как активный стимулятор роста свиней. В животноводстве хорошо известен антибиотик румензин (продуцент S.cinnamonensis), улучшающий переваримость кормов [4]. В научной литературе имеется информация об использовании в ветеринарии тилозина, синтезируемого S.fradiae и обладающего широким спектром антимикробного действия, но в основном на грамположительные микроорганизмы. Введение тилозина в кормовой рацион свиней способствует приросту живой массы животных [66, 20]. Аминокислоты, витамины. В мицелии, являющемся главным отходом микробиологического производства антибиотиков, содержится практически весь состав известных аминокислот, макроэлементы, полисахариды и т.. [118, 131]. Общая сумма аминокислот в мицелии колеблется от 130,19 до 325,27 мг/кг сухой биомассы. Среди них обнаружены незаменимые аминокислоты лизин, гистидин, метионин, треонин, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, частично заменимые аргинин, глицин, тирозин и заменимые глутаминовая, аспарагиновая кислота, аланин, серии, пролин [19,66]. Некоторые стрептомицеты, например Streptomyces aurantiaca, культивируемые на отходах животноводческих ферм или гидролизате древесины, позволяют получать массу, содержащую не только р-каротин, но и витамины группы В и антибиотики [66, 54]. По данным Л.П.Ковальчука культуры Actgriseus 15 Act.aureoverticillatus 1306 и Act.aurigineus 2377 в процессе выращивания на различных средах синтезируют витамины группы В (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, никотиновую кислоту и истинный витамин В]2). В работах по изучению наличия различных витаминов в мицелии и культуральной жидкости показано, что разные виды актиномицетов способны синтезировать витамины группы В. При этом выявлено, что витамин В12 содержится в основном в мицелии, а остальные аналоги (до 80%) выделяются в КЖ [85, 86, 26]. Липиды. В работах, посвященных изучению биохимического состава мицелия стрептомицет, особая роль отводится липидам. Это связано с тем, что липиды выполняют разнообразные функции - входят в состав клеточных мембран и митохондрий, участвуют в процессах активного переноса электронов и различных веществ внутри клетки, оказывают влияние на биосинтез нуклеиновых кислот и белков [31,36], Липиды в клетках микроорганизмов выполняют многие чрезвычайно важные функции. Недостаточность знаний об этих веществах, наблюдавшаяся до сих пор, может быть обусловлена, с одной стороны, долго существовавшим мнением о том, что липиды микробов и высших организмов аналогичны по составу и функциям, с другой, тем, что изучение липидов микроорганизмов представляло и представляет значительные трудности из-за их относительно малых количеств и сложного состава.
Влияние препаратов авермектинового ряда на организм животных
К настоящему времени накоплен большой опыт по применению в животноводстве различных антигельминтных и противопаразитарных средств. Они относятся к различным классам соединений и, как правило, обладают эффективностью против узкого круга паразитов, что вынуждает владельцев животных применять для лечения и профилактики десятки препаратов, далеко не безупречных в экологическом отношении и токсичных для организма животного.
Так, в сельском хозяйстве из большого разнообразия инсектоакарицидов до сих пор часто применяют органические соединения фосфора (ФОС) и хлора (ХОС), галлоидопроизводные углеводороды, эфиры карбаминовой кислот и др. химические пестициды.
Эти препараты высокоэффективны в борьбе с паразитическими насекомыми, клещами и гельминтами, причем концентрация веществ при обработке животных относительно незначительная (0,03-2%), что характеризует большую активность по отношению к членистоногим и высокую опасность пестицидов для теплокровных животных и человека.
Как известно, при противопаразитарных обработках животных часто возникают токсические явления, такие как угнетение, конвульсии, болезненность, замедление сердечного ритма, затруднение дыхания, обильное слюнотечение и др. Биохимические тесты показывают, что наблюдаются резкое изменение содержания общего белка, увеличение количества эритроцитов, гемоглобина, изменение скорости оседания эритроцитов [108].
В связи с этим актуальной задачей ветеринарной медицины и биотехнологии является создание и применение эффективных и безопасных лечебных средств широкого спектра антипаразитарного действия, в частности препаратов на основе авермектинов [12, 13]. Механизм действия авермектинов подчеркивают широкий спектр влияния препаратов этой группы на эндо- и эктопаразитов и отсутствие действия на организм животного, так как эти соединения не проникают через гематоэнцефалический барьер. Признаки острой токсичности ивермектина для свиней исследовали, когда группам свиней задавали в 1, 10, 50, 100 раз больше терапевтической дозы (300 мг/кг) ивермектина. При дозе 30 мг/кг у свиней проявилось вялость и атаксия в течение 24-х часов после приема. Прерывистое и затрудненное дыхание, потеря координации - все это происходило при передозировке препарата. Биохимические и гематологические изменения отражали депрессивное физиологическое состояние животных, которые затем потеряли двигательную активность, снизили потребление пиши и воды. При этом изменялась активность щелочной фосфатазы, содержание холестерина, триглицеридов, глюкозы, фосфора, калия, креатинина, общего билирубина и азота мочевины. Лейкоцитоз и нейтрофилия наблюдались у некоторых свиней, которым давали ивермектин в дозе 30 мг/кг. Значения железа сыворотки крови уменьшились на 8-14 день после приема ивермектина; эта кратковременная реакция также ассоциировалась с острым токсическим синдромом у лошадей иКРС[166, 167]. Биологически значимые изменения в гематологических и биохимических показателях сыворотки крови не наблюдались у лошадей, которым давали ивермектин. В одном из экспериментов Herd и Kociba наблюдали небольшие, хотя статически достоверные, изменения, но эти данные не подтвердились при повторном исследовании. Asquith и Kulwich [155, 156] также не обнаружили биохимических и гистологических изменений в крови в результате приема ивомека. Раствор ивермектина задавали трехкратно в дозе 0,6 и 1,0 мкг/кг перорально, с интервалом 2 недели. Наибольший интерес представляет собой воздействие авермектинов на иммунобиологический статус организма, так как это напрямую связано с устойчивостью животных к заболеваниям как заразной, так и незаразной этиологии. Данные, приведенные разными исследователями, подчеркивают неопределенность сведений по влиянию препаратов на организм. Так, у животных, обработанных ивомеком, отмечается достоверная стимуляция синтеза гемоглобина, высокое гематокритное число, лейкоцитоз и моноцитоз; цидектином - лейкоцитоз, лимфоцитоз и эозинопения; аверсектом — только более высокий уровень гемоглобина [7, 145]. О.И.Мамыкова (1991) изучила действие ивермектина на уровень первичного иммунного ответа к эритроцитам барана у мышей. Она выявила, что ивомек в терапевтической дозе ингибирует иммунную реакцию на тимусзависимый антиген, а также проявляет иммунносупрессивную активность. У животных обработанных ивомеком, спустя 6 недель после введения препарата сохраняется достоверная стимуляция гемоглобина, повышенное гематокритное число, лейкоцитоз и моноцитоз; аверсектом -только более высокий уровень гемоглобина. Наиболее существенное (ингибирующее) влияние авермектинсодержащие препараты оказывают на функциональные свойства иммунокомпотентных клеток, в частности, ФГА-стимулированную пролифирацию (Т-система) и фагоцитоз. Это можно расценивать как проявление иммуноактивных (иммунотоксических) свойств этих препаратов [145]. В эксперименте на овцах установлено, что ивомек в течение 5-7 дней вызывает угнетение Т- и В- систем иммунитета. По этой причине, как утверждают исследователи, сразу после дегельминтации происходит сильная реинвазия [89]. Аналогичные исследования проводили Г.С.Сивков и В.В.Яковлева (1998). В результате экспериментов выявлено, что антипаразитарные препараты на основе ивермектина снижают относительное и абсолютное содержание Т- и В-лимфоцитов, рост внутриклеточной миелопероксидазы нейтрофилов, циркулирующих иммунных комплексов на фоне умеренного лейкоцитоза и лимфоцитоза [141]. Вместе с тем пролиферативная реакция со стороны селезенки (увеличение массы органа, числа ядросодержащих клеток), отсутствие существенного влияния препаратов на гуморальный и иммунный ответ, модуляция клеточного иммунного ответа позволяет связать действие ивермектинсодержащих препаратов не с иммунотоксическими свойствами, а с возможной индукцией супрессорров [145].
Особенности технологии культивирования S.avermitilis-56 при получении биологически активных веществ
Прежде чем приступить к решению основной задачи, представлялось необходимым получить исходную информацию о характеристиках развития продуцента авермектинов при культивировании в глубинных условиях, моделирующих известную технологическую цепочку получения целевого продукта.
Культивирование микроорганизма Streptomyces avermitilis-56 проводили в глубинных условиях на ГКС. Как видно из данных, представленных на рис.3, кинетика роста биомассы Streptomyces avermitilis выражается характерной сигмоидной кривой. В период 0-30 часов после посева микроорганизма наблюдается лаг-фаза (индукционный период). В этот период заметного накопления биомассы не наблюдается, но происходит перестройка клеточного метаболизма и приспособление культуры к условиям питательной среды.
В течение 46-65 часов наблюдается фаза экспоненциального роста, происходит относительно быстрое накопление биомассы. Фаза линейного роста (50-70 ч) характеризуется постоянной сбалансированной скоростью накопления биомассы и синтезом продуктов метаболизма микроорганизма.
Фаза линейного роста сменяется периодом замедления роста (72-144...ч), в течение которого скорость роста биомассы снижается до нуля. На этом этапе развития культуры накопление целевого продукта (авермектинов) наиболее максимальное. С точки зрения современных представлений о периодической культуре микроорганизмов и характере биосинтеза вторичных метаболитов на «второй» фазе роста можно отметить, что биосинтез целевого продукта, т.е. авермектинов начинается когда интенсивность развития продуцента переходит в фазу замедления метаболизма в целом из-за исчерпания источников питания и накопления продуктов обмена веществ.
Далее рост культуры переходит в стационарную фазу, характеризующуюся стабилизацией процессов прироста и гибели клеток. Характеристика роста микроорганизма S.avermitilis-56 на ГКС: - Культуральная жидкость с темной пигментацией; - запах перегноя, специфический для продуцента авермектинов; - биомасса представляет собой мелкие шарики, хорошо оседает. Динамика изменения рН является характерным признакам для данной культуры (рис.2). В начальной стадии роста, совпадающей с лаг-фазой, наблюдается подкисление среды (7,20-7,07), что свидетельствует о том, что культура проходит период перестройки и адаптации к новым параметрам окружающей среды. С момента начала экспоненциального роста рН культуральной жидкости начинает постепенно возрастать и к окончанию процесса культивирования составляет 7,5. Биосинтез авермектинов, являющийся этапом вторичного метаболизма V S.avermitilis, начинается примерно после 48 часов роста культуры и продолжается до конца ферментации. Характер развития продуцента авермектинов зависит также от плотности посева. Показано, количество инокулята оказывает существенное влияние на длительность лаг-фазы и характер накопления биомассы. Из полученных данных следует, что оптимальные количества инокулята находятся в пределах 3-6% от количества исходной, т.е. засеваемой питательной среды (рис.4). Наглядным показателем, характеризующим развитие S. avermiti/is, является динамика утилизации источника углевода и удельная скорость роста. Эти показатели совместно с данными о выходе АТФ и экономическом коэффициенте потребления источника энергии дают достаточно объективную информацию о метаболизме культивируемого организма. Как показывают данные рисунков 3-5, наивысшая удельная скорость развития микроорганизма и соответствующая скорость потребления источника энергии и конструктивного материала, а именно углеводов наблюдается в период, находящийся между 36-48 и 68-72 часами культивирования. Нами определена динамика биосинтеза АТФ в процессе развития продуцента авермектинов. Полученные данные представлены на рис.6, и они согласуются с выше приведенными результатами о динамике физиолого-биохимических показателей микроорганизма. Интенсивность энергетического обмена микроорганизма имеет наиболее высокое значение в период максимальной скорости роста. Динамика изменения экономического коэффициента и выхода АТФ также происходит практически синхронно. То, что удельный выход «энергетической валюты» имеет свою динамику, примерно совпадающую с характерной кривой периодической культуры микроорганизмов, видимо, можно объяснить постоянно изменяющимися условиями культивирования в замкнутом пространстве без обновления среды. В таких условиях периодической культуры, как известно, идет утилизация компонентов питательной среды и соответствующее выделение в культуральную жидкость конечных продуктов мктаболизма. В конечном счете все это приводит к ухудшению в целом условий роста и возрастанию величины энергии поддержания, что несомненно приводит дополнительным энергетическим расходам и нарушению динамики накопления АТФ в биомассе микроорганизма.
Изучение биологически активных свойств мицелия S.avermitilis
Исследования по изучению острой токсичности мицелия закончились тем, что не удалось скормить мышам дозу, которая оказала бы токсическое действие, т.е. те количества мицелия, которые может съесть мышь, оказались абсолютно безвредными. Заслуживает внимания также то, что исследуемый мицелий не содержит компонентов, обладающих кумулятивными свойствами. При скармливании мицелия подопытным мышам ежедневно в течение 30-40 суток не установлено каких-либо отклонений в физиологическом состоянии и поведении животных. Все изложенное хорошо согласуется с результатами гематологических исследований. Как известно, при патологических состояниях животных состав крови изменяется соответствующим образом, и это может служить одним из тестов для определения характера отрицательного влияния внешних факторов на организм животных.
Действие проэкстрагированного мицелия продуцента авермектинов на гематологические показатели животных изучено на мышах и кроликах, которым давали препарат в различных дозах. Результаты этих экспериментов свидетельствуют об отсутствии отрицательного воздействия препарата на гематологические показатели подопытных животных. Содержание эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина в крови колеблется в определенных пределах, которые существенно не отличаются от характерных физиологических норм. Данные гематологических исследований подтверждаются и биохимическими показателями сыворотки крови подопытных животных, а также функциональным состоянием почек и печени. Содержание общего белка, углеводов, билирубина, холестерина и др. показателей, характеризующих состояние жирового, белкового и углеводного обмена животных, получавших биомассу S. avermitilis, находится на уровне тех же показателей животных, которые не получали препарат. Достоверные изменения установлены при изучении иммунологических показателей организма животных. Как известно, в защите организма важную роль играют клеточные /фагоциты/ и гуморальные факторы естественной резистентности. Фагоциты дезинтегрирует чужеродные частицы и вещества, причем микрофаги /гранулоциты-нейтрофилы и эозинофилы/ преимущественно снижают их концентрацию в организме. Макрофаги /мононуклеары, в основном моноциты и их производные/, кроме того, определяют неспецифическую фазу клеточного иммунитета, не опосредованную гуморальными факторами, и влияют на течение болезней, вызываемых факультативными паразитами. Действуя в кооперации с Т-лимфоцитами макрофаги участвуют также в реакциях клеточного иммунитета активируя В-лимфоциты и стимулируя их к синтезу соответствующих специфических антител.
Активно функционирующие или находящиеся в состоянии покоя фагоциты продуцируют лизоцим, лактоферин и другие аналогичные по функциям вещества, которые выделяясь за пределы клетки, действуют уже как гуморальные факторы естественной резистентности.
Лизоцим является ферментом с мурамидазной активностью, направленной на гидролиз 3-/1-4/-гликозидной связи полиаминосахаров клеточной стенки преимущественно грамположительных бактерии. Адсорбируясь на субстрате, т.е. на мукопептиде клеточной стенки, лизоцим расщепляет его с освобождением N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина, что приводит к лизису микробной клетки. В комбинации с комплементом, некоторыми химическими и физическими факторами лизоцим может лизировать и клетки грамотрицательных микроорганизмов. Активность лизоцима в сыворотке отражает уровень обмена веществ в организме животных, в частности естественной резистентности, в силу чего отмечаются динамические изменения содержания фермента в процессе адаптации организма к среде обитания. Содержание лизоцима существенно изменяется в зависимости от вида микро- и макроорганизма, а также формы антигенного препарата и метода его аппликации.
Бактерицидная активность биологической жидкости является отображением интегральных противомикробных процессов, вызванных гуморальными факторами естественной резистентности. В сыворотке крови инициатором реакции является IgM как наиболее комплементзависимый; в секретах слизистых - IgA как наиболее лизоцимзависимый.
Таким образом, видно, что сущность и характер иммунного ответа обеспечивается кооперативным взаимодействием всех иммунокомпетентных клеток и сопровождается образованием клеток - эффекторов, осуществляющих те или иные конкретные ответные реакции.
При этом вся скоординированная система охраны гомеостаза организма может измениться в зависимости от антигенности природного агента, а степень отклонения от физиологической нормы легко проконтролировать по антителообразованию и учету динамики изменения относительного и абсолютного содержания Т- и В- лимфоцитов в крови.
В настоящее время известен ряд методов дифференциации Т- и В-лимфоцитов на основе различий их по поверхностным антигенам. Однако для подсчета лимфоцитов обоих видов в большинстве случаев используют следующие тесты: розеткообразование с эритроцитами барана (спонтанное или Е-розетки), характерный только для Т-клеток, розеткообразование с эритроцитами барана, несущими комплекс антиген-антитело (ЕА-розетки), характерный для В-лимфоцитов.
Однако наиболее простым и достаточно информативным методом выявления действия тех или иных факторов на организм животных представляется контроль состояния системы естественной резистентности. Действительно, полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии как биомассы в целом, так и липидной фракции на бактерицидную активность сыворотки и содержание лизоцима в ней. Объективность этих данных подтверждается наличием корреляции между концентрацией липидов и величиной соответствующего эффекта, а также стимулирующим действием липидов и биомассы на накопление биомассы подопытных животных.
