Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности биологии термофильных метанотрофов 8
1.1. Экология и физиология 8
1.2. Общая характеристика термофильных метанотрофов 11
1.3. Метаболизм Methylococcus capsulalus Bath 16
1.3.1. Метанмонооксигеназа, ее роль и регуляция 16
1.3.2. Ассимиляция Сі-соединений 23
1.3.3. Пути ассимиляции азота 27
1.3.4. Биосинтез стеролов 28
1.4. Геномные реконструкции метаболизма «Methylacidiphilum infernorum» ЗО
Глава 2. Особенности адаптации термофильных и термотолерантных прокариот 32
2.1. Тепловой шок 32
2.2. Особенности внутриклеточных структур у термофилов 35
2.2.1. Белки и ферменты термофилов 35
2.2.2. Механизмы стабилизации нуклеотидов 36
2.2.3. Внутриклеточные факторы, стабилизирующие белки и ДНК 37
2.2.3.1. Анионные термопротекторы 37
2.2.3.2. Незаряженные осмолиты 39
2.2.4. Строение цитоплазматических мембран термофильных бактерий 42
2.2.5. Системы антиоксидантной защиты у микроорганизмов 44
Глава 3. Пигменты метанотрофов 48
3.1. Биосинтез меланинов у микроорганизмов 50
3.2. Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез 55
Экспериментальная часть 57
Глава 4. Материалы и методы 57
4.1. Объекты исследования 57
4.2. Культивирование метанотрофов 57
4.3. Микроскопические исследования 57
4.3.1. Выявление нуклеоида в целых клетках 58
4.4. Изучение физиологических свойств 58
4.5. Аналитические определения 58
4.6. Идентификация органических осмолитов 61
4.6.1. Аминокислотный анализ 61
4.6.2. Ионообменная тонкослойная хроматография 61
4.6.3. Экстракция термостабильных низкомолекулярных растворимых веществ из клеток 62
4.6.4. Разделение углеводсодержащих низкомолекулярных веществ 62
4.7. Определение включения 14СН4 суспензиями клеток 63
4.8. Определение влияния температуры инкубации на биосинтез белка и окисление метана 63
4.9. Фракционирование клеток .-. 64
4.9.1. Получение бесклеточных экстрактов 64
4.9.2. Определение концентрации белка 64
4.9.3. Электрофорез в ДСН-ПААГ 65
4.10. Определение активности ферментов 65
4.10.1. Определение активности ферментов первичного и центрального метаболизма 65
4.10.2. Определение оптимальной температуры для активности ферментов 72
4.10.3. Определение термостабилизирующего влияния экстракта,
спиртоводорастворимой фракции клеток штамма 0-12 и сахарозы на активность ЛДГ
иФДГ 73
4.11. Выделение ароматических метаболитов из культуральной жидкости 73
4.12. Выделение и изучение свойств меланина 73
4.13. Визуализация перекись - разлагающей активности клеток Md. szegediense 0-12...74
4.14. Молекулярно-генетические методы 74
4.14.1. Выделение и очистка препаратов ДНК 74
4.14.2. ПЦР-амплификация 75
4.14.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 76
4.14.4. Очистка фрагментов ДНК 77
4.14.5. Дотирование фрагментов ДНК 77
4.14.6. Получение компетентных клеток и их трансформация 77
4.14.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов 78
Глава 5. Результаты и обсуждение 79
5.1. Цитофизиологические и биохимические свойстваЛ/іі. szegediense 0-12 79
5.1.1. Особенности роста Md. szegediense 0-12 при различных температурах 79
5.1.2. Окисление и ассимиляция метана при разных температурах культивирования адаптированными клетками Md. szegediense 0-12 81
5.1.3. Влияние температуры инкубации на биосинтез белка Mi. szegediense 0-12 82
5.1.4. Цитологические особенности Md. szegediense 0-12 85
5.1.5. Фосфолипидные и жирнокислотные профили клеток Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath .4 88
5.1.6. Влияние температуры культивирования на активность ферментов первичного и центрального метаболизма 90
5.1.7. Влияние температуры измерения на активность ключевых ферментов Сі метаболизма 95
5.2. Идентификация органических термопротекторов у Md. szegediense 0-12 96
5.2.1. Накопление и путь биосинтеза сахарозы у Md. szegediense 0-12 97
5.2.2. Влияние сахарозы на термостабильность ФДГ и ЛДГ 99
5.3. Системы защиты от активных форм кислорода у термотолерантного и умеренно
термофильного метанотрофов 100
5.3.1. Активности ферментов защиты от АФК 102
5.4. Синтез меланинового пигмента Md. szegediense 0-12 109
5.4.1. Выделение и изучение свойств меланинового пигмента 110
5.4.2. Изучение локализации меланина в клетках Md. szegediense 0-12 112
5.4.3. Поиск предшественника синтеза меланина 113
5.4.4. Расшифровка путей синтеза меланина 115
Заключение 122
Выводы 124
Список литературы 125
- Общая характеристика термофильных метанотрофов
- Особенности внутриклеточных структур у термофилов
- Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез
- Выявление нуклеоида в целых клетках
Введение к работе
Актуальность проблемы. На Земле есть множество мест с постоянно высокой температурой (действующие вулканы, геотермальные источники и промышленные стоки), в которых обитают сообщества термофильных микроорганизмов. Интерес к термофильным прокариотам связан, в первую очередь, с наличием у них уникальных по стабильности биополимеров и низкомолекулярных соединений, обуславливающих адаптацию к повышенным температурам (Jaenicke, Sterner, 2003). Присутствие в высокотемпературных экосистемах метана геохимического или микробиологического происхождения предполагает возможность существования в них метанотрофов.
Метанотрофы - структурно и функционально специализированная группа аэробных метилотрофных бактерий, использующих метан и метанол в качестве источника углерода и энергии. Метанотрофы обнаружены в самых разнообразных экосистемах, в том числе в экстремальных, где их присутствие определено наличием метана и кислорода (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Способность метанотрофов окислять СН4, наиболее восстановленную органическую молекулу, обусловлена.,, наличием метанмонооксигеназы (ММО), которая может также соокислять широкий спектр алифатических, ароматических, гетероциклических и галогенированных углеводородов. Потребляя метан и соокисляя различные поллютанты в своих эконишах, метанотрофы снижают эмиссию метана и других парниковых газов в атмосферу и осуществляют естественную биоремедиацию. Кроме того, метанотрофы перспективны для биотехнологии как продуценты целевых соединений из доступных и относительно дешевых и возобновляемых субстратов - метана и метанола. В этой связи представляют особый интерес термофильные метанотрофы, как потенциальные продуценты ферментов (термозимов). В частности, ММО и другие ферменты Сі метаболизма могут обладать полезными свойствами, обусловленными термофильной природой их продуцентов (Trotsenko, Khmelenina, 2002). Термофильные метанотрофы перспективны в качестве моделей для изучения молекулярных механизмов адаптации и филогении с целью более глубокого понимания особенностей биологии и эволюции этой специализированной группы бактерий.
Среди метанотрофов известны термотолерантные представители рода Methylococcus (Foster, Davis, 1966; Малашенко с соавт., 1975), умеренно термофильные виды родов Methylocaldum и Methylothermus, а также недавно открытые термоацидофилы филума Verrucomicrobia (Bodrossy et al., 1995; 1997; 1999; Ешинимаев с соавт., 2004; Tsubota et al., 2005; Dunfield et al., 2007; Islam et al., 2008; Pol et al., 2007), однако механизмы их адаптации к изменениям температуры не исследованы.
Цель и задачи исследования. В связи с,вышеизложенным целью нашей работы было расшифровка особенностей термоадаптации умеренно термофильного мтанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12. Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:
Изучить зависимые от температуры цитобиохимические изменения у Md. szegediense 0-12.
Идентифицировать потенциальные термопротекторы и пути их биоситнеза у Md. szegediense 0-12.
Определить природу бурого пигмента, синтезируемого Md. szegediense 0-12, и возможную связь с термоадаптацией.
Научная новизна работы. До начала наших исследований механизмы
термоадаптации у метанотрофов были не известны. Нами обнаружено, что адаптация Md.
szegediense 0-12 к повышенной температуре культивирования (57С) происходит как на
уровне изменения активности ферментов Сі метаболизма, так и посредством накопления
термопротектора - сахарозы. Установлено, что синтез сахарозы осуществляется из
интермедиатов РМФ цикла (фруктозо-6-фосфата и УДФ-глюкозы) с участием
сахарозофосфатсинтазы, а деградация сахарозы катализируется
сахарозофосфатфосфорилазой. Выявлена многоуровневая система защиты от активных , форм кислорода (АФК) с участием глутатиона, пероксидазы и супероксиддисмутазы. Найдено, что адаптация к понижению температуры культивирования (45-37С) сопровождается изменением морфологии, метаболизма, фосфолипидного и \ жирнокислотного состава клеток. Впервые показано, что Md. szegediense 0-12 синтезирует меланин из интермедиатов пути деградации тирозина, образующихся в ответ на снижение температуры культивирования метанотрофа. Полученные приоритетные результаты существенно углубляют представления об особенностях адаптации и выживания умеренно термофильных метанотрофов.
Практическое значение. Наши исследования механизмов термоадаптации Md. szegediense 0-12 выявили ряд цитобиохимических особенностей, представляющих интерес для биотехнологии. Показано, что ферменты Сі метаболизма, а также цитохром с пероксидаза имеют оптимумы активности в диапазоне 55 - 70С, что позволяет реализовать метаболический потенциал данного метанотрофа для получения и применения термостабильных ферментов в процессах биоремедиации, биосинтеза метанола и других целевых продуктов из относительно дешевого субстрата - метана. В частности, способность синтезировать меланин может быть использована для получения биопротекторов, применяемых при воздействии факторов мутагенной и канцерогенной
природы. Показано, что исследуемые метанотрофы являются активно растущими в диапазоне температур от 45-57С, что делает перспективным их использование в качестве биофильтров для снижения концентрации метана в угольных шахтах.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на ежегодных конференциях молодых ученых г. Пущино (2003-2005), международной конференции «Наука и бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), ежегодной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005-2008), международной конференции «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, 2007), 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ" (Иркутск, 2007), VI международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), международной научной конференции «Экстремофилы» (Кейптаун, 2008), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 11 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 308 ссылок, содержит 11 таблиц и 51 рисунок.
Автор искренне признателен всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы, а также д.б.н. , Осипову Г.А. (Академическая группа Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва) за определение жирнокислотного состава в клетках метанотрофов, к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц. за предоставление чистой культуры штамма 0-12, к.б.н. Сузиной Н.Е. за электронно-микроскопические исследования, д.б.н. Дуде В.И. и к.б.н. Дмитриеву В.В. за люминесцентную микроскопию клеток, д.б.н. Меденцеву А.Г. за помощь при проведении полярографических исследований, к.х.н. Сахаровскому В.Г. за 'Н-ЯМР анализ экстрактов, с.н.с. Баскунову Б.П. за масс-спектрометрический анализ метаболитов, н.с. Ильченко В.Я. за определение свободных аминокислот (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН), к.б.н. Тихоновой Т.В. (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва) за двумерный гельэлектрофорез белков, к.б.н. Калиману А.В. (Институт Белка РАН) за секвенирование ПЦР продуктов, н.с. Тимошенко В.А. (МГУ им. М.В. Ломоносова) за ЭПР анализ.
Особую благодарность автор выражает своим учителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.
Общая характеристика термофильных метанотрофов
Поскольку в состав гидротермальных флюидов наряду с сероводородом входит заметное количество метана, высказывались предположения о наличии в этих зонах термотолерантных/термофильных метанотрофов. Растворимость метана и кислорода в воде падает с повышением температуры, что может ограничивать рост метанотрофов, однако установлено, что растворимость газов в природных водах с низкой ионной силой (менее 100 мМ) снижается только на треть при повышении температуры от 30 до 60С (Duan et al., 1992). Этим объясняется наличие процесса метанокисления в различных природных местообитаниях с повышенными температурами в гидротермальных районах Тихого океана (Гальченко, 2001). Кроме того, из термальных источников Венгрии и Японии были выделены термофильные виды рода Methylocaldum, Methylothermus, (Bodrossy et al., 1995; 1997; 1999; Tsubota 2005), а из гидротерм Забайкалья термотолерантный представитель рода Methylocystis (Цыренжапова с соавт., 2007). Совсем недавно в разных географических зонах были выделены термоацидофильные облигатные метанотрофы, отнесенные к филуму Verrucomicrobia, растущие до 60С. Так, Acidimethylosilexfumarolicum SolV, выделен из грязевого вулкана Солфата вблизи Неаполя (Южная Италия). Подобные вулканы - фумаролы, характеризуются значительными эмиссиями СНд (10 - 10" т/год) в атмосферу, а показатели tC и рН варьируют от умеренной температуры и нейтрального рН до высокой tC и низкого рН. Новый облигатный термоацидофильный метанотроф «Methylokorus infernorum 4» был выделен из почвенного горизонта (10-15 см, рН 4,5, 63С) в Новой Зеландии, а изолят Kami из кислого термального источника на Камчатке (Dunfield et al., 2007; Islam et al.,,2008; Pol et al., 2007).
Установлено, что метанотрофы находятся в симбиотических отношениях с различными беспозвоночными моллюсками и губками, обитающими у гидротермальных выходов и холодных ключей на дне морей и океанов (Childress et al., 1986; Stewart et al., 2005; Duperron et al., 2005). Метанотрофы, наряду с сульфидокисляющими бактериями, располагаются в специальных клетках-бактериоцитах жабр моллюсков, при этом моллюск-хозяин обеспечивает симбионтов субстратами (С02, СЩ, Ог), поступающими из гидротерм, а бактерии, в свою очередь, фиксируют углерод, снабжая хозяина углеводами.
Наряду с природными, существуют термальные экосистемы, созданные человеком. Отходы животноводческих ферм, такие как компост, навоз и силос, богаты органическим веществом и представляют собой своеобразный природный ферментер для аборигенной микрофлоры. Интенсивные микробиологические процессы разложения органики и образования метана происходят с выделением большого количества тепла. Подсчитано, что эмиссия метана из компостируемых отходов равна 7,4x10 т СН Год и соответствовала 0,31-0,41% общей эмиссии метана в Германии (Jackel et al., 2005). Из таких искусственно создаваемых экосистем выделены термотолерантные и умеренно термофильные представители родов Methylococcus и Methylocaldum (Bodrossy et al, 1997; Ешинимаев с соавт., 2004; Jackel et al., 2005).
Более того, с использованием молекулярно-биологических методов показано присутствие термотолерантных и умеренно-термофильных видов Methylococcus и Methylocaldum в различных почвах Германии с температурами in situ, намного ниже оптимальной для их развития (Knief et al., 2003; Knief, Dunfield, 2005). Таким образом, термофильные метанотрофы должны обладать высокой адаптабельностью к изменениям температуры и иметь механизмы, помогающие выживать при высоких температурах. Однако структурно-функциональные особенности их термоадаптации не изучены. 1.2. Общая характеристика термофильных метанотрофов
В настоящее время валидированные таксоны термотолерантных и умеренно термофильных метанотрофов включают 3 рода: Methylococcus Methylocaldum и Methylothermus, которые относятся к у-подклассу Proteobacteria (табл. 1). Methylococcus capsulatiis. Термотолерантные штаммы Texas и Bath имеют ВЦМ I морфотипа. Способны расти при температуре от 30 до 50С, оптимально при 42С. Обладают как растворимой, так и мембранной формами ММО. Реализуют, наряду с доминирующим РМФ циклом, минорные сериновый и РБФ пути Сі-ассимиляции. ЦТК неполный из-за отсутствия активности а-кетоглутаратдегидрогеназы. Ассимилируют аммонийный азот посредством аминирования пирувата с участием аланиндегидрогеназы и через глутаматньтй цикл (Shishkina and Trotsenko, 1979; Lees et al., 1991; Murrell and Dalton, 1983a). Эти свойства, наряду с высоким содержанием Г+Ц в ДНК (60-62 мол %), более характерным для метанотрофов II типа, послужили основанием выделить Мс. capsulatiis в самостоятельный тип "X" метанотрофных бактерий. Этот вид метанотрофов рассматривается в качестве своеобразного микробного "Розеттского камня" в метилотрофии и является одним из основных объектов молекулярно-генетических исследований (Trotsenko, Murrell, 2008).
Клетки Мс. capsulatus - грамотрицательные неподвижные кокки, размножаются бинарным делением, характеризуются наличием капсулы, дополнительных слоев на внешней поверхности клеточной стенки (S-слоев), расположенных в тетрагональной (р4) симметрии, образуют покоящиеся формы - незрелые цисты типа Azotobacter (Гальченко 2001). На минерально-солевой агаризованной среде развиваются в виде белых или , кремового цвета колоний, округлых, выпуклых, неплотной консистенции, с ровным краем. Водорастворимый пигмент не образуют. В качестве источника углерода и энергии используют только метан или метанол ( 0,01%). Способны индуцировать экспрессию гена ; нитрогеназы ni/H и фиксировать атмосферный азот (Auman et al., 2001; Кравченко и др. 2002). Клетки Мс. capsulatus содержат ФЭА (74%), КЛ (5,8%) и ФГ (13%) и ФХ, уровень которых изменяется в зависимости от условий роста (Makula, 1978, Гальченко и др., 1986; Гальченко, 2001) и метилированные производные фосфатидилэтаноламина - фосфатидил-монометилэтаноламин (ФММЭА) и фосфатидилдиметилэтаноламин (ФДМЭ), отсутствуют. Преобладающими жирными кислотами являются 1б:1со7с и 16:0 (Bowman et al., 1991, Гальченко 2001).
Особенности внутриклеточных структур у термофилов
Известно, что белки термофильных организмов, не отличаясь принципиально от белков обычных бактерий по своему аминокислотному составу, характеризуются высокой компактностью (Bruins et al., 2001). Причем компактность структуры белка может обеспечиваться всего одной аминокислотной заменой., Было проведено множество мутационных исследований для проверки стабилизирующих взаимодействий, обнаруженных у термофилов. Так, например, белок фосфорибозилизомераза, мономерный у мезофилов, у термофилов — димер, поскольку две субъединицы связаны гидрофобными взаимодействиями между iV-концом одного мономера и Р-цепью другого. С помощью сайт направленного мутагенеза фенилаланин был заменен на лейцин, при этом фермент становился термостабильным димером и не терял каталитическую активность (Hoecker et al., 2001).
Показано, что белки термофильных микроорганизмов отличаются от аналогичных белков мезофилов: увеличением числа водородных связей; наименьшим содержанием незаряженных амидов и полярных аминокислот - глутамина и аспарагина (поскольку одним из основных факторов денатурации белка является реакция деамидизации аспарагина, особенно в сочетаниях аспарагин-глицин и аспарагин-серин); большей гидрофобностью молекулы; отсутствием цистеиновых остатков (последнее приводит к отсутствию дисульфидных мостиков). Таким образом, структуры белков и ферментов термофилов характеризуются высоким уровнем изолейцина, аланина, пролина, которые обеспечивают гидрофобные свойства. В тоже же время, содержится меньше аминокислот, которые подвержены высокой химической и температурной денатурации - аспартата, глутамата, цистеина, метионина и триптофана (Bruins et al., 2001). Гидрофобные аминокислоты максимально удалены от воды и находятся внутри белков, где стабилизируются Вандерваальсовыми взаимодействиями. Все эти структурные изменения, придают белкам термофилов плотную структуру, и как следствие -термостабильность.
Тем не менее, общие механизмы, ведущие к пониманию внутренней термостабильности белков, пока не ясны. Причина этого - большое количество нейтральных замен аминокислотных остатков, не затрагивающих стабильность белка (Vieille et al, 2001; Clark et al., 2004).
Высокие температуры влияют на структурную стабильность нуклеиновых кислот, в том числе на сверхспирализацию ДНК. Под воздействием температуры могут изменяться химическая структура нуклеотидов и даже разрываться фосфодиэфирная связь. Поэтому у (гипер)термофилов должны существовать механизмы защиты ДНК и РНК от высоких температур.
Как известно, повышенное содержание ГЦ увеличивает температуру плавления ДНК, и увеличение доли ГЦ в ее составе является возможным механизмом адаптации термофилов. Действительно, содержание ГЦ в тРНК и рРНК коррелировало с оптимальными температурами роста микроорганизмов разных физиологических групп (Jaenicke, Sterner, 2003). Однако, содержание ГЦ геномной ДНК не всегда коррелирует с оптимальной температурой роста. Наоборот, ДНК из гипертермофильных архей имеет поразительно низкое содержание ГЦ. Например, у Methanococcas igneas, растущего при температуре 90С, содержание ГЦ равно 31 мол %. Показано, что у этих организмов двойная спираль ДНК стабилизируется низкомолекулярными метаболитами или белками. Так, у гипертермофильных архей идентифицированы группы белков, которые связываются с ДНК без предпочтения последовательности. Эти белки относят к семейству гистоновых, являющихся гомологами эукариотических гистонов (Soares et al., 1998). Пассивная защита ДНК могла быть обеспечена высокими концентрациями соли.
Действительно, показано, что присутствие Mg и К защищает двойную спираль ДНК от депуринизации, вероятно, непосредственно стабилизируя JV-гликозидную связь между дезоксирибозой и основанием.
Отмечено, что введение дополнительных положительных супервитков в ДНК, осуществляемое обратными гиразами, стабилизирует двойную спираль (Lopez-Garcia, Forterre, 2000). Молекулы тРНК не объединяются в большие макромолекулярные комплексы, поэтому, адаптируясь, к высоким температурам, гипертермофилы развили механизмы внутренней стабилизации. У многих термофильных бактерий увеличено содержание ГЦ в РНК. Также известно, что в тРНК с высокой частотой происходят ковалентные посттранскрипционные модификации, как например — метилирование. Посттранскрипционные модификации тРНК найдены не только у архей. У Thermus thermophihis обнаружен высокий уровень 5-метил-2-тиоуридина (Watanabe et al., 1976). Таким образом, гипертермофилы используют различные защитные механизмы для предотвращения разрушения цепей ДНК при экстремальных температурах роста.
Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез
Далее гомогентизатдиоксигеназа раскрывает ароматическое кольцо с образованием малеилацетоацетата, который изомеризуется в фумарилацетоацетат (HmgC). Последний гидролизуется специфической гидролазой (HmgB), образуя фумарат и ацетоацетат (рис. 15 а). Выше кластера hmgABC обнаружен репрессор этого кластера - hmgR, который Показано, что мутанты Ps. putida по hmgAT&C кластеру не росли на минеральной среде с тирозином, однако на LB среде в присутствии тирозина образовывали водорастворимый коричневый пигмент. Отмечено, что при нарушении пути деградации тирозина в среде накапливаются метаболиты, которые, полимеризуясь, образуют меланин (Arrias-Barrau et al., 2004).
Гидроксифенилпируват гидроксилаза, обнаруженная у морских бактерий Vibrio cholerae, Hyphomonas sp., Shewanella colwelliana, кодируется melA геном. Аминокислотная последовательность белка на 80 % сходна с гидроксифенилпируват гидроксилазой из /J.v. putida. Синтез меланина у этих штаммов индуцировался тирозином (Kotob et al., 1995). 3.2. Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез
Меланины синтезируются растениями, грибами, гельминтами, высшими эукариотами, бактериями и выполняют множество различных функций. Основная функция меланинов у растений и птиц - формирование окраски (Бригтон, 1986). Меланин кожи обеспечивает ее защиту против вредного действия УФ. Кроме того, in vitro показано подавление развития вируса иммунодефицит человека меланином (Nosanchuk, Cosadevall, 2003). У ряда грибов наблюдали корреляцию между синтезом меланина и спорообразованием, однако значение этого явления не известно (Tsai, 1998). Меланины могут служить как энергетические переносчики, связывать различные лекарства и химикаты, влиять на целостность клеток (рис. 16) (Nosanchuk, Cosadevall, 2003). УФ меланин Полисахаридная капсула
У грибов Cryptococcus neoformans и бактерий Streptomyces galbus и Azospirillum lipoferum, выявлена индукция лакказы и синтеза меланина высокой или низкой температурами. Образование меланина у V. cholerae индуцировалось в ответ на стрессы осмотический шок и высокую температуру. Следовательно, меланин обладает протекторными свойствами, защищая клетки от неблагоприятных внешних воздействий (Coyne, al-Harthi, 1992; Rosas, et al., 1997). У Shewanella algae меланин функционирует как терминальный акцептор электронов и передает их к железу. Это дает преимущество данной бактерии при росте в анаэробных условиях. У многих бактерий и грибов синтез меланина связан с вирулентностью этих штаммов (Nosanchuk, Cosadevall, 2003). Кроме того, меланины имеют очень большое сродство к металлам и высокую эффективность поглощать активные свободные радикалы (Zughaier et al., 1999; Keith et al., 2007). Показано, что мутанты по синтезу меланину были более чувствительны к УФ, радиации, действию стресс - факторов, таких как температура и АФК (Nosanchuk, Cosadevall, 2003) (рис. 16).
Для термофилов существование при высокой температуре является нормальным физиологическим состоянием, поскольку все их системы адаптированы к жизни в таких условиях. Логично предположить, что молекулярные механизмы термоадаптации универсальны у всех термофильных микроорганизмов, тем не менее требуется экспериментально проверить, функционируют ли они у термофильных и термотолерантных метанотрофов.
Основным объектом исследования являлся умеренно термофильный Methylocaldum szegediense 0-12, выделенный к.б.н., н.с. Ешинимаевым Б. Ц. из проб силоса отобранных вблизи г. Пущине В качестве объектов сравнения использовали чистые культуры термотолерантого Methylococcus capsulatus Bath и мезофильного Methylocystis echinoides 2 из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН.
Метанотрофные бактерии выращивали на минеральной среде "П" следующего состава (в г/л): Na2HP04 - 1,5; КН2Р04 - 0,7; KN03 - 1,0; MgS04 7 Н20- 0,2; СаСЬ - 0,02; (в мг/л): ЭДТА Na2 - 5; FeS04- 7Н20 - 2; (в мкг/л): ZnS04- 7Н20 - 100; МпС12 4Н20 - 30; СиС12 5Н20 - 10; СоС12 6Н20 - 200; NiCb 6 Н20 - 20; Na2Mo04 - 30; Н3ВО3 - 30; вода дистиллированная, рН среды доводили до 6,8 (Гальченко, 2001). Среду, раствор микроэлементов и фосфаты стерилизовали отдельно (1 атм, 30 мин). Md. szegediense 0-12 культивировали на минеральной среде Пм, аналогичной по составу среде «П», но с добавлением 1 мг/л CuS04 5 Н2О (рН среды 7,2).
Культивирование проводили в колбах объёмом 750 мл, заполненных 100 мл среды. Инокулят добавляли в среду в соотношении 1:10. Колбы заполняли смесью метан-воздух (1:1) и встряхивали при 100 об/мин на роторной качалке Clim-0-Shake (Швейцария) при 60-37С для Md. szegediense 0-12 и при 45-28С для Мс. capsulatus. Мезофильный Ms. echinoides 2 выращивали при 28С.
Escherichia coli (XLl-Blue и DH5a) выращивали при 37С на жидкой или агаризованной (1,5% агара "Difco", США) средах "LB" с добавлением при необходимости селективных антибиотиков: ампициллина (Amp) - 100 мкг/мл или хлорамфеникола (Cm) -25 мкг/мл.
Морфологию метанотрофов изучали в световом микроскопе Jenaval (Германия) с фазовым контрастом и на тотальных препаратах с помощью электронного микроскопа JEOL JEM 100В (Япония). Для приготовления ультратонких срезов клетки фиксировали в 0,15 М какодилатном буфере (рН 7,3), содержащем 0,1% рутениевого красного при 4С в течение 1ч. Затем трижды отмывали в 0,15 М какодилатном буфере и дополнительно фиксировали в растворе 1,5% Os04 и 0,1% рутениевого красного в 0,05 М какодилатном буфере (рН 7,3) в течение 3 ч при 20 С.
Выявление нуклеоида в целых клетках
Каталазу определяли по снижению концентрации НгО при 240 нм (Е=42,6/М х см) в реакционной смеси следующего состава: 0,05 М калий-фосфатный буфер рН 7,0; Н2О2 14 мМ, экстракт (Bergmeer, 1983). GSH-нероксидазу определяли по окислению НАДФН при 340 нм в реакционной смеси, содержащей: ЮмМ Трис-HCI буфер, рН 7,6; 0,2 мМ НЛДФН;. 0,5 мМ ЭДТА; 2 мМ GSH; 1 Е/мл GSH- редуктаза;- 150 мкМ Н2Ог; экстракт (Bergmeer, 1983). Глутатионредуктазу определяли по окислению НАДФН при 340 нм в реакционной смеси, содержащей: 0,01 М Трис-HCI буфер, рН 8,0; 0,5 мМ ЭДТА; 4 мМ GSSG; 0,2 мМ НАДФН; экстракт (Bergmeer, 1983). Цитохром с пероксидазу определяли в смеси, содержащей: 0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,6, 20 мкМ восстановленного цитохрома с, 0,18 мМ свежеразведенного Н2О2, экстракт.
Окисление восстановленного цитохрома с измеряли при 550 нм (Verduyn et al., 1988). Пероксидазу определяли с субстратами 4- аминоантипирином (ЛАП), аммоний 2,2 азино-бис (З-этилбензотиазолин-6-сульфонатом) (ABTS), 2,6-димстоксифенолом (ДМФ), пирогаллолом (ПГ).
Пероксидазную активность с ААП измеряли при 510 нм (Е= 13,16 мМ) в реакционной смеси, которая содержала: 0,2 М Фосфатный буфер, рН 7,0; 0,0017 М НгСЬ; и 0,17 М раствор фенола с 0,0025 М 4-ААП; экстракт. Активность с ABTS измеряли при 436 нм (Е= 29 мМ) в реакционной смеси, содержащей: 50 мМ Трис-HCL буфер, рН 7,5; 0,0017 М Н2О2; 0,5 мМ ABTS; экстракт. Активность с ДМФ измеряли при 468 нм (Е= 14,8 мМ) в реакционной смеси, содержащей: 50 мМ Трис-HCL буфер, рН 7,5; 0,0017 М Н2О2; 0,5 мМ ДМФ; экстракт. Активность с ПГ измеряли при 296 нм (Е= 24,7 мМ) в реакционной смеси, содержащей: 50 мМ Трис-HCL буфер, рН 7,5; 0,0017 М Н2О2; 0,5 мМ ПГ; экстракт (Trinder, 1966).
Фенолоксидазу определяли с субстратами ABTS, ДМФ и ПГ. Реакционные смеси с этими субстратами были аналогичны описанным выше, но без Н2О2 (Morisaki et al., 2001).
ДОФА оксидазу определяли в реакционной смеси, следующего состава: 50 мМ Трис-HCI буфер, рН 7,5; 2 мМ ДОФА; экстракт (Hernandez-Romero et al., 2005).
Пероксидазную и фенолоксидазную активность определяли также в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях (в присутствии ДСП). Для приготовления образцов к бесклеточным экстрактам (100 мкг белка в 10 мкл) добавляли 10 мкл 100 % глицерина и 2 мкл 1% бромфенолового синего. Образцы наносили в слот ПААГ и проводили электрофорез, как описано выше. После разделения, для оценки пероксидазной активности, гель инкубировали в растворе, содержащем: 10 мл 50 мМ Трис НС1 буфера, 1 мл 0,3 % NiCb, 6 мг диаминобензидина (ДАБ) и 20 мкл 30 % Н202. Для оценки фенолоксидазной активности гель инкубировали в растворе, содержащем 50 мМ Трис НС1 буфера и 0,5 мМ ДМФ (Hernandez-Romero et al., 2005). Окраску на гем содержащие белки проводили согласно рекомендациям авторов (Francis et al., 1984).
Супероксиддисмутазу определяли двумя методами (Beauchamp, Fridovich, 1971) с модификациями: 1) спектрофотометрически, по ингибированию восстановления нитросинего тетразолия (NBT) ксантиноксидазой, и 2) в нативном ПААГ, по ингибированию фотовосстановления NBT.
Спектрофотометрически СОД определяли в реакционной смеси (2 мл), содержащей (мкмоль): NBT - 0,112; ксантин, растворенного в 0,004 N NaOH - 0,1; ЭДТА Na2 - 0,2; KCN - 0,04; ксантиноксидазу - 0,08 Е; Трис -НС1 буфер, рН 8 - 100. Оценивали ингибирование восстановления NBT ксантиноксидазой при 560 нм. За единицу активности СОД принимали 50 %-ное ингибирование восстановления NBT. Выявление активности СОД в нативном ПААГ. Для приготовления образцов, к бесклеточным экстрактам (100 мкг белка в 10 мкл) добавляли 10 мкл 100 % глицерина и 2 мкл 1% бромфенолового синего. Образцы наносили Е/СЛОТ ПААГ, который был приготовлен без ДСН. Разделение клеточных белков проводили в трйс-глициновом буфере (глицин — 14,4 г/л; 0,5 М Трис-НО, рН-8,3). Электрофорез проводили при 160 V до входа проб в разделяющий гель, а затем при 200 V. После разделения гель вымачивали 20 мин в 2,45 мМ NBT, затем 30 мин в растворе, содержащем 0,028 М ТЕМЕД, 0,028 мМ рибофлавин, 0,05 М Na-фосфатный буфер рН 7,8. Переносили гель в маленькую камеру из фольги и освещали УФ 5-15 мин. Во время освещения гель становился полностью темно-синим, за исключением мест локализации СОД.
Чтобы отличить Mn-содержащую СОД от Fe - СОД, гель перед проявлением активности вымачивали 30 мин в 0,05 М Na-фосфатном буфере, рН 7,8, содержащем 5 мМ Н2О2 и 1 мМ KCN. При этом Н2О2 ингибирует и инактивирует Fe- СОД, а цианиды -пероксидазную и каталазную активности (Clare et al., 1984).
Определение активности ферментов катаболизма тирозина.
Аминотрансферазы тирозина и феиилаланина определяли в бесклеточных экстрактах по тирозин-зависимому образованию глутамата из а-кетоглутарата методом ТСХ. Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): пиридоксальфосфат - 0,02; тирозин - 10; кетокислота - 30 (а-кетоглутарат, пируват, оксалоацетат или глиоксилат). Реакцию проводили в 0,5 М трис - НС1 буфере, рН 7,5 в течение 30 мин при 37С и останавливали кипячением (5 мин). Контроль - реакционная смесь без тирозина. Продукты реакции хроматографировали на пластинах Фиксион (Венгрия) в системе для разделения аминокислот, как описано выше.
Гомопротокатехоат - 2,3-Диоксигеназу определяли по образованию 5-карбоксиметил-2-муконового полуальдегида, оценивая увеличение поглощения при 380 нм (Е=38000). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис - НС1 буфер, рН 7,6 - 100; 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота-0,04 (Sparnins, Chapman, 1975).
Гомогентизат 1,2 - диоксигеназу измеряли, по образованию малеилацетоацетата, при 330 нм (Е=10,800). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): трис - НС1 буфер, рН 7,6— 100; 2,5-дигидроксифенилуксусная кислота-0,1 (Sparnins, Chapman, 1975). Малеилацетоацетат нзомеразу определяли по убыли малеилацетоацетата при 330 нм. Реакционная смесь аналогична предыдущей. После 5 мин инкубации и достаточного увеличения ОП добавляли GSH (1 мкмоль/мл), активатора изомеразы (Sparnins, Chapman, 1975).
Тирозиндекарбоксилазу детектировали по скорости образования 14СС 2 из р С-тирозииа, улавливая углекислоту фенилэтиламином (Shishkina et al., 1982). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): а-кетоглутарат — 30, пиридоксальфосфат - 0,02, ТПФ - 0,2, MgCli -4, Трис - НС1 буфер, рН 7,5 - 100 и экстракт. Смесь помещали в основное отделение сосудика Варбурга, в его боковой отросток вносили р14С-тирозин (2,5 мкмоль 2,5 мкСі/мкмоль, Хемапол, Чехия). В центральное отделение сосудика помещали фильтр, смоченный фенилэтиламином (0,2 мл). Преинкубировали 5 мин при 37С, смешивали содержимое бокового отростка с основным объемом и инкубировали 1 ч при 37С. Реакцию останавливали добавлением 1,6 мл смеси, содержащей 0,08 М лимонной кислоты и 0,04 М NaiHPC (рН 3,0). Через 30 мин измеряли радиоактивность фильтров в сцинтилляционном коктейле Unisolve 2 (Koch-Light, Англия). Контролями служили кипяченые клетки и реакционная смесь, не содержащая а-кетоглутарат и пиридоксальфосфат.
![Получение и исследование фото- и электролюминесцентных свойств оксидных люминофоров в системе [(Ca,Mg)O(Al,Ga)2O3SiO2]:Eu](/i/i/4245/495299.png "Получение и исследование фото- и электролюминесцентных свойств оксидных люминофоров в системе [(Ca,Mg)O(Al,Ga)2O3SiO2]:Eu Терентьев, Михаил Александрович")
